Article de méthode

Tri cellulaire à fermeture éclair de leucine pour la purification de cellules transduites à double vecteur

DOI :

10.3791/68628

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24 octobre 2025

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1City of Hope Los Angeles and National Medical Center, 2Lymphoma and Cellular Therapy Services, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 3Department of Hematology and Hematopoietic Cell Transplantation, City of Hope National Medical Center

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous décrivons un protocole permettant de purifier sélectivement des lymphocytes T à double transduction à partir d’un mélange de lymphocytes T co-transduits. Cette approche combine deux vecteurs rétroviraux qui codent chacun pour un composant d’une méthodologie de tri cellulaire basée sur la fermeture éclair de leucine appariée qui permet une purification immunomagnétique sélective de cellules transduites à double vecteur.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les thérapies adoptives à base de lymphocytes T, y compris les lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR), ont démontré une activité clinique impressionnante contre les hémopathies malignes et sont prometteuses dans le traitement des tumeurs malignes solides. Malgré ces succès, de multiples mécanismes de résistance à l’immunothérapie par lymphocytes T ont été identifiés qui limitent le succès thérapeutique, notamment la perte ou la faible expression des antigènes cibles, le développement de l’épuisement des lymphocytes T et la présence d’un microenvironnement tumoral immunosuppresseur. De multiples stratégies d’ingénierie cellulaire ont été développées pour surmonter ces mécanismes de résistance. Cependant, plusieurs mécanismes de résistance peuvent se produire simultanément, nécessitant une combinaison de plusieurs stratégies d’ingénierie pour optimiser l’activité antitumorale. Les contraintes d’empaquetage des vecteurs limitent la transmission de grandes quantités d’informations génétiques aux lymphocytes T et présentent un défi dans la co-expression de plusieurs constructions modifiées. Ici, nous décrivons un protocole de co-transduction de lymphocytes T avec deux vecteurs pour coder plusieurs transgènes, augmentant ainsi le nombre de fonctions modifiées. En co-exprimant une méthodologie de tri cellulaire basée sur la fermeture éclair de leucine, appelée Zip-sort, nous dirigeons la purification immunomagnétique sélective de cellules à double transduction qui ont incorporé deux vecteurs distincts.

Introduction

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La thérapie par cellules CAR-T a révolutionné le traitement de la leucémie à cellules B, du lymphome et du myélome multiple 1,2. Les cellules CAR-T sont également étudiées pour les tumeurs malignes solides3. Cependant, des mécanismes récurrents d’échec de la thérapie par cellules CAR-T ont été identifiés, notamment une faible expression ou une perte de la molécule antigène cible CAR, le développement d’un dysfonctionnement des cellules T (épuisement), une immunosuppression active par le microenvironnement tumoral et un trafic limité de cellules T et leur persistance dans le microenvironnement tumoral 3,4,5,6 . Bien que des solutions d’ingénierie individuelles aient été conçues pour tenter de surmonter chacun de ces mécanismes de résistance des cellules CAR-T3, l’introduction de plusieurs fonctions modifiées dans un produit de thérapie cellulaire pour surmonter simultanément plusieurs mécanismes de résistance est un défi en raison de la capacité limitée d’empaquetage génétique des systèmes de vecteurs rétroviraux et lentiviraux7.

Pour surmonter les limites de la capacité d’emballage des vecteurs, la co-transduction des lymphocytes T avec plusieurs vecteurs est de plus en plus utilisée. La co-transduction vectorielle a été utilisée pour étudier les stratégies d’ingénierie des lymphocytes T à cellules T contrôlées par des médicaments et à cellules logiques dans des études précliniques 8,9,10 et dans un essai clinique récent évaluant les cellules T double CAR CD19/CD22 pour surmonter les limites de l’emballage des vecteurs11. Cependant, la co-transduction génère des produits cellulaires mixtes contenant des combinaisons de lymphocytes T à transduction simple et double, ce qui peut nuire à la fonctionnalité du produit s’il dépend de composants codés par les deux vecteurs et peut également conduire à une compétition entre les lymphocytes T à transduction unique12.

Pour surmonter ces défis, nous avons développé une méthodologie appelée Zip-sort, qui utilise des fermetures éclair de leucine hétérodimérisantes - chacune exprimée à partir de l’un des deux vecteurs co-transduits - pour diriger la purification immunomagnétique en une seule étape des cellules à double transduit13. Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes de construction de vecteurs rétroviraux intégrant notre méthodologie Zip-sort, la production et la concentration de surnageants rétroviraux, l’activation et la co-transduction des lymphocytes T, et la purification immunomagnétique des cellules à double transduction (Zip-sort).

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Protocole

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Des études sur des animaux ont été menées au laboratoire de recherche animale Parvin de City of Hope (COH) selon le protocole #23145 approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de COH et dans le vivarium du Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) selon le protocole #99-07-025 approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du MSKCC. Les lymphocytes T humains ont été isolés à partir de cellules mononucléées de sang périphérique (PBMC) anonymisées qui ont été purifiées par Ficoll-Paque à partir de filtres de réduction des leucocytes obtenus du Centre de donneurs de sang de la ville de Hope et utilisés selon le protocole #24427 approuvé par le comité d’examen institutionnel de la ville de Hope. Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux normes de biosécurité institutionnelles.

1. Conception vectorielle de tri par zip

  1. Sélectionnez le vecteur d’expression de votre choix pour modifier génétiquement les cellules d’intérêt.
    REMARQUE : La méthode de tri par glissière comprend des fermetures éclair sécrétées et des fermetures éclair de capture, qui sont toutes deux exprimées à partir de vecteurs différents, et qui s’apparient de manière intracellulaire et de trafic à la surface de la cellule pour permettre la purification sélective des cellules incorporant les deux vecteurs (Figure 1A-D)13. Les fermetures éclair sécrétées sont exprimées à partir du vecteur 1 et contiennent une étiquette d’affinité. Les fermetures éclair de capture sont exprimées à partir du vecteur 2 et conservent la fermeture éclair sécrétée à la surface de la cellule. La modification de la fermeture à glissière de blocage est composée d’une deuxième fermeture à glissière liée de manière covalente, qui bloque l’appariement extracellulaire non spécifique de la fermeture à glissière sécrétée. La modification de la fermeture éclair de blocage est nécessaire pour empêcher l’appariement extracellulaire lors de l’ajout d’une fermeture éclair de capture à des protéines avec des domaines extracellulaires allongés (généralement des domaines extracellulaires plus grands qu’un domaine à charnière courte).
  2. Sélectionnez un ensemble de fermetures éclair secrètes et de capture dans le tableau supplémentaire 1 et le fichier supplémentaire 1 pour tester et construire des vecteurs.
  3. Clonez des séquences de fermeture éclair en vecteurs d’expression appariés à l’aide de techniques de biologie moléculairestandard 13- Chacun des deux vecteurs codera soit la fermeture éclair sécrétée par l’étiquette d’affinité, soit la fermeture éclair de capture (Figure 1D).
    1. Voir le tableau supplémentaire 1 et le fichier supplémentaire 1 pour les séquences de construction de la fermeture éclair. Les séquences de fermeture éclair ont été placées à l’extrémité 5' (N) d’un message polycistronique pour améliorer leur expression et ainsi augmenter le rendement du tri. Placez les transgènes suivants en aval, séparés par des peptides 2A auto-clivants (Figure 1D). Cependant, des expériences antérieures ont réussi à placer les fermetures éclair dans une configuration de 3 pieds si une expression élevée est maintenue.

2. Production de rétrovirus

  1. Préparez des cellules Phoenix-Eco (ATCC CRL-3214, virus tropique de la souris) ou des cellules Phoenix-Eco ɑ-V β-313 (ajout de ɑ-V β-3 conçu pour améliorer l’adhésion de Phoenix-Eco) ou 293Vec-RD11414 (virus tropique humain) ou 293Vec-RD114 cellules ɑ-V β-3 (ajout de ɑ-V β-3 conçu pour améliorer l’adhésion de 293Vec-RD114) 1 jour avant la transfection.
    REMARQUE : Ce protocole ne nécessite pas de modification des lignes d’emballage avec des intégrines ɑ-V β-3, mais cette modification améliore l’adhésion de cette lignée cellulaire aux flacons de culture tissulaire et facilite la collecte de surnageants rétroviraux.
    1. Trypsiniser les cellules dans un ballon T175 contenant des cellules Phoenix ou 293Vec-RD114 à ~80 % de confluence avec 0,25 % de trypsine-EDTA.
      1. Retirer le milieu, laver les cellules adhérentes avec 10 ml de PBS, en gardant les cellules non perturbées pour éliminer les composants sériques qui inhibent la trypsine, ajouter 5 ml de trypsine-EDTA à 0,25 % et incuber les cellules à 37 °C pendant 5 min.
      2. Dissociez et collectez les cellules dans 5 mL de DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 1 % de pénicilline/streptomycine et 1 % de GlutaMAX (appelé DMEM complet).
      3. Granulez les cellules dans un tube conique de 15 mL en les centrifugant à 340 x g pendant 5 min à 4 °C. Média de décantation.
    2. Mettre en suspension des cellules granulées par centrifugation dans 10 mL de DMEM complet et une plaque sur une boîte de culture tissulaire de 10 cm d’environ 1,5 x 10 6 cellules Phoenix-Eco,cellules Phoenix-Eco ɑ-V β-3, cellules 293Vec-RD114 ou cellules 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 comptées avec un hémacytomètre.
    3. Secouez ou tournez doucement la plaque pour répartir uniformément les cellules et incubez toute la nuit à 37 °C pour permettre aux cellules d’adhérer à la plaque.
  2. Environ 18 à 24 heures plus tard, vérifiez que les cellules sont confluentes à 60 % à 70 %, les cellules saines et adhérentes présentant des projections dendritiques.
  3. Cellules Phoenix-Eco, Phoenix-Eco ɑ-V β-3 cellules transfectrices, cellules 293Vec-RD114 ou 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 avec des constructions de vecteurs LZRS rétroviraux (Addgene Plasmid #31601, transfection stable épisomale basée sur EBNA) ou des constructions de vecteurs PB13 (intégration génomique stable basée sur le transposon piggyBac, fichier supplémentaire 1) à l’aide du kit de transfection (Table des matériaux) comme décrit ci-dessous.
    1. Combinez 2 μg d’ADN du vecteur LZRS ou de l’ADN du vecteur PB et 16 μL de réactif amplificateur dans 300 μL de tampon EC dans un tube de microcentrifugation pour chaque réaction de transfection.
    2. Pour une intégration stable des constructions de vecteurs PB, ajoutez également 1 μg du vecteur hyperactif piggyBac transposase pCMV-hyPBase15 (Sanger Institute).
    3. Agiter doucement pendant 5 s et incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter 20 μL de réactif de transfection, vortex pendant 10 s et incuber à température ambiante pendant 10 min pour générer des complexes micelle d’ADN.
    4. Ajoutez 300 μL de DMEM complet dans le tube, pipetez plusieurs fois pour bien mélanger et ajoutez la suspension micelle goutte à goutte dans les cellules de la ligne d’emballage plaquées à l’aide d’une pipette de 1 mL.
    5. Agitez doucement pour assurer un dépôt uniforme des micelles. Après 24 heures, trypsiniser les cellules transfectées et évaluer l’expression initiale de la construction codée par rétroviral par cytométrie en flux.
    6. Transférez les cellules trypsinisées dans une fiole T75 avec 20 mL de DMEM complet et ajoutez 2 μg/mL de puromycine ou 10 μg/mL de blasticidine, selon les gènes de résistance aux antibiotiques, pour sélectionner les cellules transfectées. Une fois que les cellules atteignent une confluence de 70 % à 75 %, trypsiniser et transférer dans une fiole T175 contenant 40 ml de DMEM complet. Maintenir la sélection d’antibiotiques dans les milieux pendant l’expansion de la chaîne d’emballage.
    7. Lorsque les cellules sont confluentes à 80 % à 85 %, trypsiniser à nouveau et confirmer l’expression de la construction par cytométrie en flux. Congeler une aliquote de cellules à l’aide d’un produit de congélation (50 % de DMEM complet, 40 % de FBS, 10 % de DMSO) et de passage des cellules dans deux flacons T175 (rapport de séparation 1:10-1:12) avec 40 mL de DMEM complet.
  4. Recueillir et concentrer le surnageant rétroviral à partir de lignes d’emballage stables entièrement sélectionnées cultivées dans des flacons T175 lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 % à 85 %.
    1. Retirer les antibiotiques du milieu avant la première récolte en remplaçant le milieu dans le T175 par 40 ml de DMEM frais et complet 24 h avant le premier prélèvement prévu.
    2. Recueillir et filtrer les surnageants 24 h après le remplacement du média en passant le surnageant recueilli dans des seringues de 50 mL munies de filtres à seringue (0,45 μm, fluorure de polyvinylidène). Recueillir dans un tube conique de 50 ml.
    3. Ajouter 5 solutions concentrées de polyéthylène glycol (PEG) (40 % (poids/vol) PEG 8 000 MW contenant 2,4 % (poids/vol) de NaCl) surnageant filtré et retourner le tube plusieurs fois pour bien mélanger (étape de précipitation PEG).
    4. Ajoutez 40 ml de DMEM complet dans la fiole T175 récoltée d’origine, incubez pendant encore 24 heures et recueillez quotidiennement le surnageant viral pendant 2 autres jours consécutifs au total.
    5. Faites précipiter le virus pendant 1 à 2 jours à 4 °C. Le virus précipité se présente sous la forme d’une matière floculante, flottante ou sédimentée.
    6. Centrifugeuse : suspension virale précipitée par PEG à 2 100 x g pendant 15 min à 4 °C. Jeter le surnageant non précipité.
    7. Remettre en suspension chaque pastille virale précipitée par le PEG dans 500 μL de RPMI complété par 10 % de FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine, 1 % de glutaMAX, 1 % de pyruvate de sodium, 1 % d’acides aminés non essentiels et 0,1 % de β-mercaptoéthanol (appelé RPMI complet).
    8. Utilisez immédiatement le virus remis en suspension pour la transduction ou transférez-le dans un tube de microcentrifugation et conservez-le à -80 °C.

3. Jour 0 : Enrichissement et activation des lymphocytes T de souris

  1. Enduire une plaque de 6 puits traitée pour culture tissulaire avec 1,5 mL de PBS par puits contenant 2 μg/mL d’anti-CD3 (clone 145-2C11) et 2 μg/mL d’anti-CD28 (clone 37.51). Incuber pendant 2 h à 37 °C.
  2. Prélever la rate de la souris donneuse, dissocier les cellules à travers un filtre de 40 μm et collecter les splénocytes dans l’IPRP complet. Splénocytes des granulés par centrifugation à 340 x g pendant 5 min à 4 °C.
    REMARQUE : Des souris femelles BALB/cJ âgées de 6 à 8 semaines ont été utilisées comme souris donneuses dans cette étude.
  3. Jeter le surnageant, agiter doucement la pastille au vortex, ajouter 1 mL de tampon de lyse des globules rouges, pipeter 3 à 5 fois pour mélanger, incuber à température ambiante pendant 1 min, tremper avec 10 mL de RPMI complet et faire tourner les cellules en centrifugeant à 340 x g pendant 5 min à 4 °C.
  4. Jeter le surnageant, ajouter 800 μL de PBS avec 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA (appelé tampon MACS), et ajouter 200 μL de microbilles de CD19 de souris. Pipette à mélanger et à incuber pendant 15 min à 4 °C.
  5. Préparez 1 colonne LD par rate de souris. Fixez la colonne LD à un séparateur MACS. Placez un tube conique de 15 ml en dessous pour recueillir les splénocytes appauvris en CD19. Mouillez la colonne avec 2 mL de tampon MACS.
  6. Après l’incubation avec des microbilles CD19, laver les cellules avec 5 mL de tampon MACS froid, les cellules en granulés par centrifugation à 340 x g pendant 5 min à 4 °C, et jeter le surnageant. Suspendez à nouveau dans 1 mL de tampon MACS et ajoutez des cellules à la colonne LD. Attendez que la suspension passe avant de laver avec 1 mL puis 2 mL de tampon MACS.
  7. Recueillir les splénocytes appauvris en CD19 pour les utiliser en aval. Jeter la colonne LD, faire tourner les splénocytes appauvris en CD19 par centrifugation à 340 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 18 mL d’IPRP complet. Ajouter de l’IL-2 humaine recombinante (rhIL-2) à une concentration finale de 50 UI/mL.
  8. Jetez la solution d’anticorps de la plaque à 6 puits recouverte d’anticorps. Ajouter 3 ml de splénocytes appauvris en lymphocytes B en suspension dans chaque puits de la plaque à 6 puits recouverte d’anticorps.

4. Jour 1 : Transduction rétrovirale des lymphocytes T de souris

  1. Enduire une plaque de 6 puits non traitée par culture tissulaire avec 1,5 mL de PBS par puits contenant 2 μg/mL d’anti-CD3 (clone 145-2C11), 2 μg/mL d’anti-CD28 (clone 37.51) et 20 μg/mL de RetroNectin.
    REMARQUE : Des plaques non issues de la culture tissulaire sont utilisées lors de l’enrobage de RetroNectin conformément aux recommandations du fabricant.
  2. Incuber pendant 2 h à 37 °C. Jetez la solution de revêtement ou conservez-la pour la réutiliser (peut être réutilisée une fois). Bloquer la plaque avec 1 mL de PBS avec 2 % de BSA par puits, incuber pendant 10 min à 37 °C et jeter la solution de blocage.
  3. Entre-temps, décongeler le surnageant viral précipité par le PEG dans un bain d’eau à 37 °C.
    REMARQUE : 500 μL de chaque rétrovirus concentré en PEG co-transduit généré à partir d’une fiole T175 devraient être suffisants pour transduire deux fois jusqu’à 2 x 106 lymphocytes T activés par puits avec > efficacité de double transduction de 20 %.
  4. Ajouter des surnageants viraux de co-transduction dans le puits à 6 puits selon les conditions souhaitées, porter le volume final à au moins 2 mL avec un RPMI complet et 50 UI/mL de rhIL-2, et essorer pendant 1 h à 2 100 x g et 32 °C.
  5. Ajouter 0,5 à 2 x 106 lymphocytes T activés par puits et faire tourner la plaque à 340 x g pendant 10 min à 32 °C. Si les cellules ne sont pas adhérentes, répétez l’essorage à 340 x g pendant encore 10 à 20 minutes à 32 °C. Incuber à 37 °C pendant la nuit.

5. Jour 2 : Évaluation de l’expression vectorielle et retransduction facultative

  1. Perturber 100 à 200 μL de cellules adhérentes par condition à partir de la plaque de transduction pour la cytométrie en flux. L’utilisateur doit identifier un marqueur détectable par cytométrie en flux pour chaque vecteur individuel et étiquette d’affinité et les utiliser pour évaluer l’efficacité de la transduction d’un seul vecteur vectoriel, l’efficacité de la transduction d’un double vecteur et la présentation de l’étiquette d’affinité à l’aide de la cytométrie en flux.
  2. Effectuez une cytométrie en flux sur des cellules co-transduites comme décrit ci-dessous.
    1. Configurez les axes des paramètres d’acquisition pour afficher les rapporteurs vectoriels pour le vecteur 1 et le vecteur 2 (Figure 1C).
    2. Tracez des histogrammes pour la coloration de la fermeture éclair des marqueurs d’affinité (par exemple, FLAG ou CD34) pour chacun des quatre quadrants d’expression du Vecteur 1 et du Vecteur 2 afin de vous assurer que la coloration des marqueurs d’affinité est limitée aux cellules co-exprimant les rapporteurs de transduction du Vecteur 1 et du Vecteur 2.
  3. Si les cellules sont suffisamment à double transduction pour garantir un nombre suffisant de cellules pour les expériences en aval (généralement une double transduction de 20 % ou plus), effectuez les opérations suivantes.
    1. Enrobez le double du nombre de puits initiaux utilisés pour transduire chaque lignée de lymphocytes T avec du PBS contenant 2 μg/mL d’anticorps anti-CD3 et anti-CD28 pour maintenir la stimulation des lymphocytes T. Incuber pendant 2 h à 37 °C.
    2. Transférez les cellules dans de nouveaux puits avec un IPRP complet avec 50 UI/mL de rhIL-2 (maintient la stimulation des lymphocytes T).
  4. Si les cellules ne sont pas suffisamment à double transduction pour garantir un nombre suffisant de cellules pour les expériences en aval (généralement < 20 % de double transduction), effectuez les opérations suivantes.
    1. Retransduisez en utilisant le même protocole que le jour 1, mais en augmentant pour doubler le nombre de puits initialement utilisés pour tenir compte de l’expansion des lymphocytes T.
    2. Incuber à 37 °C pendant la nuit. Répétez la cytométrie en flux 24 h plus tard.
      REMARQUE : Les constructions codées par vecteur, y compris la fermeture éclair de l’étiquette d’affinité, montrent une expression maximale 2 jours après la transduction initiale.

6. Jour 3 : Sélection immunomagnétique des lymphocytes T (Zip-sort)

  1. Regrouper les puits des cellules générées en utilisant les mêmes conditions de co-transduction dans un tube conique de 15 ml.
  2. Cellules de centrifugation à 340 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter les cellules surnageantes et incuber dans 500 μL de tampon MACS contenant 30 μL de microbilles (DYKDDDDK (FLAG) ou CD34 humain) par 1 x 107 cellules pendant 30 min à 4 °C.
  3. Après l’incubation, laver les cellules avec 5 mL de tampon MACS froid. Cellules de centrifugation à 340 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon MACS.
  4. Sélectionnez positivement les lymphocytes T transductés à l’aide d’une colonne LS comme décrit ci-dessous.
    1. Mouillez la colonne avec 2 mL de tampon MACS. Appliquez la suspension de la cellule sur la colonne LS dans le support magnétique.
    2. Laver séquentiellement avec un tampon MACS (1 mL, 2 mL, 3 mL). L’éluation a retenu les cellules de la colonne en retirant la colonne du support magnétique, en ajoutant 5 mL de RPMI complet dans la colonne et en insérant le piston de la cellule.
    3. Capturez les cellules dans un tube conique de 15 mL ou directement dans une fiole T25. Équilibrer les cellules à 0,5 x 106 cellules/mL dans un RPMI complet avec 50 UI/mL de rhIL-2.
    4. Si vous partez de < double transduction de 20 %, éluez éventuellement les cellules sur une deuxième colonne LS pour une sélection positive séquentielle afin d’augmenter la pureté après le tri.
  5. Cultiver des cellules CAR-T dans des flacons T25 ou T75 à environ 0,5 x 106 cellules/mL de RPMI complet et 50 UI/mL de rhIL-2.
  6. Facultatif : Si les lymphocytes T doivent être utilisés pour des expériences in vivo, envisagez de cultiver dans du dasatinib 1 μM pour atténuer le dysfonctionnement induit par la signalisation tonique des cellules CAR-T rencontré au cours de la période de culture initiale13,16.
  7. Effectuer une cytométrie en flux conformément aux étapes 2.1 et 2.2 ci-dessus pour les lymphocytes T pré-triés et post-triés afin d’évaluer le rendement et la pureté après le tri par zip ( % de double transduit).
    Rendement = 100 x nombre total de cellules à double transmission récupérées / nombre total de cellules à double transmission présentes dans la population pré-triée)

7. Jour 4 : Culture continue de lymphocytes T

  1. Ajouter de l’IPRP complet frais et 50 UI/mL de rhIL-2 pour tout le volume de culture afin de maintenir la concentration de lymphocytes T à 0,5-1 x 106 cellules/mL.
  2. Facultatif : Si des lymphocytes T doivent être utilisés pour des expériences in vivo , ajoutez du dasatinib frais de 1 μM.

8. Jour 5 : Caractérisation des lymphocytes T triés par zip

  1. Facultatif : Préparez 100 à 200 μL de suspension de lymphocytes T par condition colorée avec des anticorps pour détecter les CAR ou d’autres produits protéiques codés par les vecteurs Zip-sort à l’aide de la cytométrie en flux.
  2. Réaliser des expériences in vitro ou in vivo avec des cellules CAR-T.
  3. Facultatif : Si les lymphocytes T doivent être utilisés pour des expériences in vivo , laver les cellules pour éliminer le dasatinib. Remettre les cellules en suspension à la concentration requise pour l’injection rétro-orbitaire ou dans la veine terminale conformément aux directives institutionnelles.

9. Jour 0 : Purification et stimulation des lymphocytes T humains

  1. Décongelez rapidement un flacon de cellules mononucléées de sang périphérique humain (PBMC) cryoconservées dans un bain-marie (ou utilisez des PBMC fraîchement isolés). Ajouter les PBMC décongelés dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de tampon MACS, préparer une aliquote pour le comptage et granuler les cellules par centrifugation à 340 x g pendant 5 min à 4 °C.
  2. Jetez les cellules surnageantes et remises en suspension dans la mémoire tampon MACS (utilisez 40 μL de mémoire tampon pour 1 x 107 cellules au total). Procéder à l’isolement des lymphocytes T à l’aide du kit d’isolement des lymphocytes T Pan, humain, conformément aux instructions du fabricant.
    1. Brièvement, ajoutez 10 μL de cocktail de biotine-anticorps Pan T Cell pour 1 x 107 cellules totales. Incuber pendant 5 min à 4 °C.
    2. Ajouter 30 μL de tampon MACS par 1 x 107 cellules au total. Ajouter 20 μL de cocktail de microbilles de cellules Pan T par 1 x 107 cellules au total.
    3. Incuber pendant 10 min à 4 °C. Remplissez le volume de suspension cellulaire à l’aide d’un tampon MACS à au moins 500 μL.
    4. Procéder à la séparation magnétique des cellules à l’aide d’une colonne LS et recueillir le flux contenant des cellules T enrichies (non touchées).
  3. Compter le rendement des cellules T et les cellules granulées par centrifugation à 340 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant. Mettre en suspension les lymphocytes T humains dans un RPMI complet à raison de 1 x 106 cellules/mL avec rhIL-2 à 50 UI/mL.
  4. À un tube conique de 15 mL contenant 2 mL de PBS, ajoutez le volume requis de Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 pour l’expansion et l’activation des lymphocytes T (25 billes μL par 1 x 106 cellules, en utilisant un rapport bille / cellule T de 1:1) et tournez à 340 x g pendant 5 min à 4 °C pour laver les billes. Jeter le surnageant.
  5. Mélanger les lymphocytes T remis en suspension avec des billes lavées et transférer dans un ballon T25 pour la culture.

10. Jour 3 : Transduction rétrovirale des lymphocytes T humains

  1. Enduire une plaque de 6 puits sans culture tissulaire avec 1,5 mL de PBS par puits contenant 20 μg/mL de RetroNectin.
  2. Incuber pendant 2 h à 37 °C. Jetez la solution de revêtement ou conservez-la pour la réutiliser (peut être réutilisée une fois).
  3. Entre-temps, décongeler les surnageants viraux précipités par le PEG pour la co-transduction dans un bain d’eau à 37 °C.
  4. Ajouter le surnageant viral de co-transduction dans des puits de plaque à 6 puits revêtue de RetroNectine selon les conditions de transduction souhaitées, compter et ajouter la quantité désirée de lymphocytes T (généralement 0,5 - 2 x 106 lymphocytes T/puits), porter le volume jusqu’à 3 mL avec un IPRP complet contenant rhIL-2 et tourner pendant 45 min à 340 x g à 32 °C.
  5. Après 24 h, maintenir les lymphocytes T à 1 x 106 cellules/mL dans un RPMI complet avec 50 UI/mL de rhIL-2.
  6. Transférez les cellules de la plaque à 6 puits à la fiole T25 si le volume nécessaire pour maintenir la concentration souhaitée de cellules T dépasse la capacité volumique de la plaque à 6 puits.

11. Jour 6 : Tri éclair des cellules CAR-T humaines

  1. Retirer les Dynabeads des lymphocytes T avant la purification immunomagnétique basée sur les marqueurs d’affinité (Zip-sort) pour éviter une éventuelle rétention associée aux Dynabeads dans la colonne magnétique et avant la cytométrie en flux pour éviter toute interférence potentielle avec l’analyse par cytométrie en flux.
  2. Vortex brièvement pour dissocier les Dynabeads et transférer les lymphocytes T dans un tube conique de 15 mL et les insérer dans l’aimant Dynabead. Retournez le tube plusieurs fois et attendez 5 minutes jusqu’à ce que les Dynabeads soient liées à l’aimant.
  3. Transférez soigneusement la suspension cellulaire sans Dynabeads dans un nouveau tube conique de 15 mL en aspirant avec une pipette. Comptez la concentration des cellules récupérées et utilisez le volume pour calculer le rendement total des cellules.
  4. Évaluez l’expression de CAR à l’aide de la cytométrie en flux conformément au protocole de transduction de souris ci-dessus.
  5. Faites tourner les cellules par centrifugation à 340 x g pendant 5 min à 4 °C et incubez dans un tampon MACS de 500 μL contenant 30 μL de microbilles (DYKDDDDK (FLAG) ou CD34 humain) par 1 x 107 cellules.
  6. Suivez les étapes 6.3 à 6.5 pour obtenir des cellules CAR-T humaines triées par zip.
  7. Évaluez la viabilité après le tri par vérification de la viabilité par hémacytomètre à l’aide de l’exclusion du bleu trypan. La viabilité avant le tri devrait être > 80 %. Celle-ci peut descendre en dessous de 80 % après le tri par glissière, mais se rétablit en 4 à 5 jours.
  8. Développer les lymphocytes T humains dans un RPMI complet avec 50 UI/mL de rhIL-2 et maintenir la concentration des lymphocytes T à environ 1 x 106 cellules/mL. L’expansion et la maintenance des cellules T post-tri peuvent être adaptées en fonction des protocoles d’expansion et d’utilisation standard de l’utilisateur.
  9. Effectuer des tests expérimentaux en aval tels que des tests de destruction, la production de cytokines, des analyses in vivo à l’aide de lymphocytes T généralement après le 8e jour.

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Résultats

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Dans ce protocole, nous démontrons la co-transduction et la sélection immunomagnétique en une seule étape de lymphocytes T doublement transduits avec deux vecteurs rétroviraux distincts (appelés tri Zip, Figure 1)13. Chaque vecteur code pour une partie d’une paire de fermetures éclair de leucine hétérodimérisantes qui est affichée de manière sélective à la surface des lymphocytes T à double transduction (Figure 1A). Une fermeture éclair s...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous avons décrit un protocole pour générer des ensembles de vecteurs de tri Zip, produire des rétrovirus, co-transduire, des cellules T de souris et humaines, et purifier immunomagnétiquement les cellules à double transduit (Zip-sort). Le protocole ci-dessus a été optimisé pour les vecteurs rétroviraux et pour les lymphocytes T de souris et humains. Bien que la méthodologie Zip-sort n’ait pas été évaluée avec d’autres systèmes de vecteurs, en principe, d’autres systèmes de vecteurs...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.R., S.C., S.E.J. et M.V.D.B. sont co-inventeurs de demandes de brevet liées à la technologie Zip-sort. A.P.B. fournit des services de conseil à Abbvie et à Bristol Myers Squibb. M.v.d.B. a reçu un soutien à la recherche de Seres Therapeutics et des options d’achat d’actions de Seres Therapeutics et de ThymoFox ; il a reçu des royalties de Wolters Kluwer ; il a été consultant, a reçu des honoraires ou a participé à des conseils consultatifs pour Seres Therapeutics, Vor Biopharma, Rheos Medicines, Frazier Healthcare Partners, Nektar Therapeutics, Notch Therapeutics, Ceramedix, Lygenesis, Pluto Therapeutics, GlaskoSmithKline, Da Volterra, ThymoFox, Garuda, Novartis (conjoint), Synthekine (conjoint), Beigene (conjoint), Kite (conjoint), MustangBio (conjoint) et Cellectar (conjoint) ; il détient des licences de propriété intellectuelle avec Seres Therapeutics et Juno Therapeutics ; il occupe un rôle fiduciaire au sein du conseil de fondation de DKMS (une organisation à but non lucratif) ; et il est le président du conseil consultatif scientifique de Smart Immune.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.C. a reçu le soutien de la Fondation allemande pour la recherche (bourse de recherche ; Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG). S.E.J. reçoit le soutien d’une bourse de développement de carrière du NCI (numéro de bourse K08-CA252157). S.E.J. a également reçu le soutien de l’American Society for Clinical Oncology (prix du jeune chercheur), du National Marrow Donor Program (prix du programme Amy) et du Parker Institute for Cancer Immunotherapy (prix Bridge Scholar). La recherche dans le laboratoire van den Brink est soutenue par les bourses P01-CA023766, R35-CA284024, R01-CA228308 de l’Institut national du cancer ; Prix R01-HL164902 de l’Institut national du cœur, des poumons et du sang et prix P01-AG052359 de l’Institut national du vieillissement. Cette recherche est financée en partie par la dotation de la chaire Deana et Steve Campbell Chief Physician Executive Distinguished Chair.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lié à une lignée cellulaire tumorale
C1498ATCCTIB-49
Réf. BM185-CD19Réf. 13
Réf. BM185-CD20Réf. 13
Unité centrale 4D-NucleofectorLonzaAAF-1003B
Unité 4D-Nucleofector XLonzaAAF-1003X
Kit tampon Lonza SF
production de virus
Boîte de culture cellulaire traitée par culture tissulaire (TC) de 10 cmCorning353003
Tube conique de 50 mLThermo Scientific339652
EffecteneQiagen301425
plasmide pENTR1aAddgene17398
LZRS-RFAAddgene31601
PB MMLV puro (vecteur viral pour les lymphocytes T de souris)Réf. 13
PB SFG blastR (vecteur viral pour les lymphocytes T humains)Réf. 13
pCMV-hyPBaseInstitut Sanger
Phénix-EcoATCCCRL-3214
Phoenix-Eco alpha V bêta 3Réf. 13Phoenix-Eco modifié pour adhérer aux flacons de culture avec une avidité plus élevée
PB-EF1a intron WPRE mCD4 P2A MCS intégrine bêta 3Réf. 13facultatif pour améliorer l’adhérence des cellules de la ligne d’emballage aux flacons de culture
PB-EF1a intron WPRE hCD8a 2A intégrine alpha VRéf. 13facultatif pour améliorer l’adhérence des cellules de la ligne d’emballage aux flacons de culture
Biovec-RD113Biovec Pharma
Biovec-RD113 alpha V bêta 3Biovec PharmaCette étude, transfectée avec des vecteurs alpha V bêta 3
Filtres à seringue Millex-HV (0,45 &mu ; m)MilliporeSLHVR33RRS
Polyéthylène glycol 8000 (PEG)Fisher ScientificBP233-1
Chlorure de sodiumFisher ScientificS271-500
PuromycineSanta Cruz BiotechSC-108071B
BlasticidineSanta Cruz BiotechSC-204655
Fioles traitées T175 TC  ;Corning353112
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénolGibco25200056
Milieu cellulaire
2-mercaptoéthanolGibco21985023
RPMI1640Gibco11-875-119
DMEMGibco11-965-118
FBSSigmaRéf. F2442
GlutamaxGibco35050061
Acides aminés non essentiels MEMGibco11140050
Pénicilline-streptomycineGibco15140-163
Pyruvate de sodiumGibco11360070
stimulation / transduction des cellules T< forte>
Tube conique de 15 mLThermo Scientific339650
Plaque non-TC à 6 puitsGibco351146
Plaque TC à 6 puitsGibco353046
microbilles anti-CD19  ;Miltenyi Biotec130-121-301
InVivoMab anti-souris CD28 (Clone 37.51)BioXCellRéférence BE0015-1
InVivoPlus anti-souris CD3&epsilon ; (Clone 145-2C11)BioXCellBE0001-1
Albumine sérique bovineSigma AldrichA4737-1G
Le dasatinibCayman Chemical11498
Dynabeads Activateur Humain T-Activateur CD3/CD28GibcoRéférence 11131D
EDTA (0,5 M), pH 8,0, sans RNaseInvitrogenAM9260G
Tampon de lyse HybriMax RBCSigmaR7757-100ML
Colonne LDMiltenyi Biotec130-042-901
Kit d’isolement de cellules Pan T, humainMiltenyi Biotec130-096-535
Aimant Dynamag-15Invitrogen12301D
Saline tamponnée au phosphate (1X)Corning21040CV
RétronectineTakaraT100B
rhIL-2Proleukin (aldesleukin)
Fiole de culture cellulaire T25Corning353109
Zip-sort
et micro ; Kit d’isolation MACS DYKDDDDKMiltenyi Biotec130-101-591
CD34 MicroBead Kit, humainMiltenyi Biotec130-046-702
QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Colonne LSMiltenyi Biotec130-042-401
Cytométrie en flux et surveillance cellulaire
Anti-CD90.1 Thy1.1 APC (Clone OX-7)BD BiosciencesCat# 561409 ; Numéro de référence : AB_10683163
Marqueur anti-V5 Anticorps, (Clone 4C12E11) iFluor 488GenScriptN° de catalogue (N° de ligne) A01803, RRID :AB_2925231
Myc PETechnologie de signalisation cellulaireCat# 2233 ; RRID : AB_823474
Myc Alexa 647Technologie de signalisation cellulaireCat# 2233 ; RRID : AB_823474
Balise anti-DYKDDDK APC (Clone L5)BioLégendeCat# 637307 ; Numéro de référence : AB_2561496
Anticorps anti CD34 de souris, Alexa Fluor 647, (clone QBEnd/10)Novus BiologicalsCat# NBP2-34713AF647 ; Numéro de référence : AB_2925234
Streptag FITCGenScriptN° de catalogue : A01736 ; RRID : AB_2622221
Incucyte SX5Sartorius
Cytomètre en flux PenteonAgilent

Références

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Dual Vector TransductionT Cell EngineeringImmunomagnetic PurificationAdoptive T Cell TherapyCAR T CellsTumor MicroenvironmentTransgene CoexpressionCell Purification

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