Technique d’injection sous-rétinienne transsclérale mini-invasive optimisée chez la souris

Résumé

Les injections sous-rétiniennes sont une technique indispensable au développement préclinique de traitements pour les maladies des photorécepteurs et des EPR. Nous décrivons une technique d’injection sous-rétinienne transsclérale optimisée chez la souris qui améliore les taux de réussite peropératoire et minimise les lésions rétiniennes.

Résumé

La méthode conventionnelle d’administration de matériel dans l’espace sous-rétinien chez la souris implique une double perforation de la rétine neurale, ce qui provoque des dommages chirurgicaux importants. Cela conduit à une variabilité dans les mesures de résultats ultérieures de la fonction visuelle, telles que les enregistrements d’électrorétinogramme (ERG) ou les tests de vision comportementale, qui confondent les évaluations de l’efficacité des thérapies expérimentales. Pour surmonter ces barrières, nous avons optimisé une technique d’injection sous-rétinienne transsclérale mini-invasive chez la souris. Dans cette technique, on accède au fornix supérieur à l’aide d’un spéculum de paupière en fil de tungstène sur mesure pour effectuer une péritomie conjonctivale et une ténotomie. Une sclérotomie ponctuelle est réalisée à l’aide d’un couteau en diamant sans pénétrer dans la rétine, à travers lequel une fine aiguille de verre est soigneusement insérée à un angle peu profond. La charge utile est délivrée dans l’espace sous-rétinien à l’aide d’une pompe de micro-injection. La tomographie par cohérence optique (OCT) est utilisée pour évaluer la taille et la position de la bulle sous-rétinienne immédiatement après l’injection. Nous avons comparé les résultats de cette technique à la méthode transrétinienne conventionnelle réalisée à l’aide d’une seringue à ressort avec une sclérotomie à l’aiguille 33G. Les enregistrements ERG ont indiqué une excellente préservation de la fonction rétinienne chez les souris injectées par transsclérence, comparable à celle des souris témoins non injectées. En revanche, une réduction appréciable du signal ERG a été observée dans les cohortes injectées de manière conventionnelle. En résumé, nous avons optimisé une technique mini-invasive pour l’injection sous-rétinienne chez la souris. Nous démontrons que cette technique est une méthode robuste et efficace pour l’administration de la thérapie génique qui minimise les dommages anatomiques à la rétine et a un impact minimal sur la fonction rétinienne. Cette méthode abaisse le seuil pour le développement de thérapies ciblant à la fois l’épithélium pigmenté de la rétine et les photorécepteurs pour traiter un large éventail de maladies rétiniennes et maculaires.

Introduction

L’injection sous-rétinienne est une intervention chirurgicale oculaire dans laquelle le matériau est délivré dans l’espace potentiel entre la rétine et l’épithélium pigmenté rétinien (EPR). Par rapport à d’autres méthodes d’administration de médicaments dans le segment postérieur, telles que les injections intravitréennes ou suprachoroïdiennes, les injections sous-rétiniennes permettent d’obtenir l’accès le plus immédiat à la fois aux photorécepteurs et à l’EPR. Pour l’administration de particules de thérapie génique virale, l’injection sous-rétinienne permet d’obtenir des taux beaucoup plus élevés de transduction des photorécepteurs et des EPR, ce qui permet des titres viraux plus faibles et un risque réduit de toxicité virale¹. De plus, l’espace sous-rétinien est anatomiquement confiné, ce qui limite la propagation systémique des particules virales et réduit le risque de réponses immunitaires². Chez l’homme, le profil d’innocuité des injections sous-rétiniennes est très favorable, la structure et la fonction rétiniennes revenant aux niveaux de base dans le mois suivant l’injection ^3,4. Les injections sous-rétiniennes sont utilisées dans un certain nombre d’applications, telles que la greffe de cellules souches et l’administration de médicaments à petites molécules², leur utilisation la plus courante étant l’administration de vecteurs viraux pour les traitements de thérapie génique des maladies rétiniennes. Les titres viraux relativement faibles, l’exposition systémique minimale et le taux et la spécificité élevés de transduction associés aux injections sous-rétiniennes en ont fait une technique indispensable dans le domaine de la rétine. Les injections sous-rétiniennes sont utilisées avec succès chez les patients pour le traitement des troubles rétiniens héréditaires, notamment la rétinite pigmentaire et l’amaurose congénitale de Leber ^5,6.

Compte tenu de son importance dans le domaine, la capacité d’effectuer des injections sous-rétiniennes chez la souris est cruciale pour les études précliniques portant sur les thérapies pour les maladies héréditaires de la rétine. Cependant, les méthodes actuelles d’injections sous-rétiniennes chez la souris ont des taux d’échec élevés et causent souvent des dommages chirurgicaux à la rétine, ce qui peut limiter la fiabilité et la cohérence des mesures des résultats fonctionnels. Traditionnellement, les injections sous-rétiniennes chez les rongeurs sont effectuées par voie transrétinienne, de sorte que l’aiguille pénètre dans la rétine antérieure, passe à travers le cristallin et pénètre dans l’espace sous-rétinien à la suite d’une seconde pénétration de la rétine ^7,8 (Figure 1A). Bien que relativement facile à réaliser, cette procédure introduit une incohérence marquée dans les résultats expérimentaux en raison de l’étendue variable des dommages chirurgicaux. Ceci est particulièrement limité pour les études utilisant des mesures de résultats de vision comportementale et fonctionnelle. De plus, le cristallin est disproportionné chez la souris par rapport à l’homme ; Cela augmente considérablement le risque d’endommager le cristallin lors de l’injection transrétinienne, rendant l’animal inutilisable pour les évaluations de la vision fonctionnelle⁴.

Une autre option est la voie d’injection transsclérale, qui évite ces problèmes en accédant à l’espace sous-rétinien par une approche postérieure, où l’aiguille pénètre dans la sclère, la choroïde, la membrane de Bruch et l’EPR ^4,9 (Figure 1B). Cette approche minimise les dommages rétiniens en évitant complètement la pénétration rétinienne. Il est également associé à une réduction du reflux de matériel injecté à partir de l’espace sous-rétinien¹⁰, ce qui permet des résultats plus cohérents et des cohortes expérimentales plus petites. Bien que la technique d’injection sous-rétinienne transsclérale chez la souris ait déjà été décrite dans la littérature, son adoption généralisée reste limitée par sa difficulté technique, qui peut entraver le taux de réussite⁴. Ici, nous décrivons plusieurs améliorations apportées à la procédure d’injection transsclérale, qui rendent sa réalisation plus facile et plus rapide, réduisent la variabilité expérimentale et améliorent les taux de réussite des injections. Ces améliorations comprennent la mise au point d’un spéculum pour les paupières d’une souris, l’administration préopératoire d’atropine, la création d’une sclérotomie précise à l’aide d’un couteau en diamant et l’optimisation de la taille de l’aiguille et de l’approche d’injection. Cette technique permet d’obtenir une excellente couverture de transduction virale des photorécepteurs et de l’EPR, sans provoquer d’impact chirurgical détectable par l’ERG.

Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément au comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Duke et à la déclaration de l’Association pour la recherche sur la vision et l’ophtalmologie sur l’utilisation des animaux dans la recherche en ophtalmie et sur la vision.

1. Préparation des animaux

1. Administrer une injection intrapéritonéale de 1 mg/kg d’atropine (dans un volume total de 50 μL) 30 min avant d’effectuer l’injection sous-rétinienne. Cette étape augmente considérablement les taux de réussite en prévenant les réflexes oculocardiaques et oculorespiratoires potentiellement létaux déclenchés par l’élévation transitoire de la pression intraoculaire pendant l’injection^11,12.
   REMARQUE : Notre dosage d’atropine est optimisé pour les souris C57BL / 6 et peut devoir être ajusté pour d’autres souches de souris. Nous n’avons pas observé de différences appréciables entre les sexes ou les âges dans le dosage de l’atropine.
2. Pendant toute la procédure, gardez la souris sur une surface chaude pour maximiser le confort de l’animal et réduire le développement de la cataracte froide.
3. Anesthésier la souris à l’aide d’isoflurane inhalé à 2 % dans de l’oxygène (2 L/min) jusqu’à ce qu’on observe une décubitus et que l’animal ne réagisse plus au pincement des orteils. Appliquez une goutte de proparacaïne à 0,5 % sur l’œil pour une anesthésie topique.
4. Appliquez une goutte du mélange de cyclopentolate à 0,2 % et de phényléphrine à 1 % sur l’œil pour dilater la pupille pour l’imagerie postopératoire de la bulle sous-rétinienne par OCT. La phényléphrine sert également à réduire les saignements peropératoires en resserrant les vaisseaux sanguins superficiels¹³.

2. Sclérotomie

1. Avant de commencer la procédure, chargez une micro-aiguille de verre avec le volume de solution souhaité à injecter. Fixez l’aiguille au micro-injecteur, avec une pression de compensation réglée à 5 hectopascals (hPa) pour contrer l’action capillaire. Nous utilisons généralement des volumes de 1 μL pour les injections sous-rétiniennes.
2. Placez la souris sous un stéréomicroscope à dissection. Utilisez un grossissement de 20x pour les étapes 2.3 à 2.6 et un grossissement de 50x pour les étapes 2.7 à 3.5.
3. Pour les jeunes souris, effectuez une cantatomie latérale avant l’intervention, afin de fournir un accès et une visualisation suffisants du site chirurgical.
4. Exposez le fornix supérieur à l’aide d’un fil-spéculum miniature fabriqué sur mesure (Figure 1C). Immobiliser le spéculum pour permettre la rétraction de la paupière supérieure les mains libres.
5. À l’aide de ciseaux Vannas inclinés, effectuez une incision paralimbique (~ 1 mm en arrière du limbe) dans la conjonctive supérieure et la capsule de Tenon pour exposer les 3-4 heures d’horloge supérieures de la sclère. Veillez à ne pas perforer le sinus veineux rétro-orbitaire. Retirez tous les restes de la capsule de Tenon recouvrant le site d’injection prévu avec précaution mais soin.
6. Saisissez le bord antérieur de la péritomie et de la ténotomie conjonctivales à l’aide d’une pince dentée verrouillable et inféroductez doucement le globe pour exposer la sclère supérieure. Immobiliser la pince verrouillée pour permettre l’inéroduction mains libres.
7. Appliquez immédiatement une goutte de solution saline tamponnée équilibrée (BSS) sur l’œil pour éviter que la sclérotique nue ne se dessèche. Nous trouvons également que le grossissement optique produit par la gouttelette BSS est utile.
8. À l’aide d’un couteau en diamant, faites une sclérotomie précise à ~12 heures et à ~1-2 mm du limbe. Positionnez la lame dans un plan tangentiel par rapport à la sclérotique pour vous assurer que la sclérotomie est aussi petite et peu profonde que possible.
   REMARQUE : Ceci est fait pour deux raisons : (1) une petite sclérotomie permet un ajustement serré de l’aiguille de verre, réduisant ainsi le reflux pendant l’étape d’injection, et (2) une sclérotomie peu profonde est essentielle pour éviter de pénétrer dans la rétine. Notez qu’une petite quantité de sang choroïdien peut apparaître sur le site de la sclérotomie, ce qui n’implique pas d’implications négatives pour l’issue de la procédure.

3. Injection sous-rétinienne transsclérale

1. En préparation de l’injection, utilisez une éponge chirurgicale pour retirer délicatement tous les BSS de la surface de l’œil.
2. Tenez le biseau de l’aiguille vers le bas à un angle peu profond par rapport à la sclérotique et introduisez l’extrémité lentement et soigneusement dans la sclérotomie pour accéder à l’espace sous-rétinien. Afin d’éviter de pénétrer dans la rétine, faites-le à un angle relativement faible et juste assez profond pour dégager l’ouverture de la sclérotomie de 0,5 à 1 mm.
   REMARQUE : Le biseau de l’aiguille est positionné vers le bas afin de minimiser la possibilité d’administration choroïdienne et de réduire la probabilité de perforer la rétine avec la pointe de l’aiguille qui avance.
3. Tout en maintenant l’aiguille en position stable, initier l’injection à 500 hPa à l’aide d’une pédale et maintenir une pression ininterrompue pendant 15 s.
4. Pour terminer l’injection, maintenez la pression d’injection jusqu’à ce que l’aiguille soit complètement retirée de la sclérotomie. Si la pression est interrompue prématurément alors que l’aiguille est encore dans l’espace sous-rétinien, une grande partie de la charge utile injectée peut rapidement sortir de l’œil dans l’aiguille par capillarité.
5. Une fois l’aiguille retirée, remarquez un reflux partiel de la solution injectée à travers le site de sclérotomie. C’est ce qui est prévisible, étant donné que le volume de 1 μL dépasse la capacité de l’espace sous-rétinien, même chez les souris adultes. L’absence de reflux peut indiquer un échec de l’injection en raison d’une administration choroïdienne ou intravitréenne par inadvertance.
6. Retirez la pince de verrouillage et le spéculum de la paupière de l’œil. Veillez à ne pas appliquer de pression sur le globe, car cela pourrait provoquer un reflux supplémentaire de la solution injectée.
7. Immédiatement après l’injection, appliquez une pommade oculaire lubrifiante abondante sur l’œil pour permettre la visualisation de la bulle sous-rétinienne par OCT¹⁴.
8. Appliquez une pommade topique à l’érythromycine sur l’œil et fournissez des soins postopératoires généraux à l’animal.

Résultats

Une injection réussie à l’aide de cette technique transsclérale génère une bulle sous-rétinienne observable sur OCT immédiatement après la procédure d’injection (Figure 2A). Compte tenu du défi technique de cette technique, l’étape d’imagerie est indispensable pour identifier les animaux injectés avec succès. Pour les chercheurs qui prévoient d’utiliser cette technique pour des expériences de thérapie génique, nous recommandons d’effectuer des injections pratiques avec des particules de viru...

Discussion

La technique décrite ici apporte plusieurs améliorations à l’approche d’injection transsclérale^{décrite précédemment 4}, ce qui améliore la fiabilité de la procédure et réduit davantage les dommages chirurgicaux à l’œil. L’une de ces améliorations est l’utilisation d’un spéculum pour rétracter la paupière supérieure, permettant un accès stable, sans encombre et les mains libres à l’œil. Les spéculums commerciaux sont souvent mal optimisés, même pour les souris adult...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chlorure de sodium injectable à 0,9 %, USP	Hospira	PAA130066
Solution ophtalmique de sulfate d’atropine à 1 %, USP	Akorn	NDC 17478-215-05
30° ; couteau diamant	Katena	K2-6560
AmScope 6W LED double illuminateur à col de cygne	AmScope	LED-11CR
Ciseaux Vannas coudés	Roboz	RS-5618
Solution d’irrigation stérile BSS	Alcon	289010-0902
Gouttes oculaires dilatantes Cyclomydril	Alcon	0065-0359-02	0,2 % cyclopentolate, 1 % phényléphrine
Pointes de pipette epT.I.P.S. MicroloaderTM	Eppendorf	5242 956.003
Micro-injecteur FemtoJet 4i	Eppendorf	E5252000021	Produit discontinué
Pommade oculaire lubrifiante GenTeal Tears	Alcon	16027802
Aiguilles de micro-injection en verre	Clunbury Scientific	Réf. B100-58-50	30° ; biseau. Diamètre : 50 & micro ; m extérieur, 29 & micro ; m intérieur
Solution d’isoflurane	Convoitise	29405
Microscope d’imagerie rétinienne MICRON IV avec OCT guidé par l’image	Phénix	N/A
Stéréomicroscope SteREO Discovery.V8	Zeiss	495015-0001-000
Pince dentée à verrouillage Stern-Castroviejo	Katena	Référence K5-2552
Pinces dentées	Roboz	RS-5172
Fils de nettoyage en tungstène pour aiguilles de calibre 23s	Hamilton	18306
Lances oculaires Ultracell PVA	Médical aux BVI	40400-8
Seringues à insuline Ultra-Fine2015	BD	328438	3/10 ml, 8 mm (5/16 po), 31 g