Article de méthode

Mise en évidence de la transition du cytochrome C mitochondrial par microscopie électronique à immunotransmission

DOI :

10.3791/68633

⸱

15 août 2025

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1Medical Department, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Critical Care Medicine, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan, 3Sichuan Scientist Biotechnology Co., Ltd, 4Department of Critical Care Medicine, Deyang Hospital Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 6Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit des méthodes pour étudier les changements micromorphologiques dans les neurones et la transition du cytochrome c mitochondrial par microscopie électronique à immunotransmission.

Résumé

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Les changements de localisation des protéines dans la microstructure présentent souvent un mécanisme de régulation précis au niveau des organites pathologiques. La façon de capturer avec précision l’emplacement de ce transfert de protéines d’organites a une signification et une valeur positives pour le diagnostic et le traitement des maladies. Les mitochondries jouent un rôle central dans la nécrose et la voie intrinsèque de l’apoptose. Dans des conditions normales, le cytochrome c (Cyt c) n’existe qu’entre les membranes interne et externe des mitochondries et dans le noyau. Lorsque les cellules subissent une apoptose, la perméabilité de la membrane interne mitochondriale est altérée et Cyt c est libéré des mitochondries dans le cytoplasme. Dans cette étude, un modèle de lésion d’ischémie-reperfusion cérébrale chez le rat a été établi, et les changements micromorphologiques des neurones subissant l’apoptose ont été mis en évidence par microscopie électronique à immunotransmission. De plus, il montre la vision du marquage immunogold du transfert de Cyt c de la matrice mitochondriale au cytoplasme après une lésion d’ischémie-reperfusion cérébrale plus précisément. La technique de microscopie électronique à immunotransmission présentée dans ce protocole est adaptée à la mise en évidence de toute transition de position des protéines au niveau microscopique.

Introduction

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Selon l’étude mondiale sur la charge de morbidité de 2021, l’AVC était la 3e cause de décès et la 4e cause d’années de vie corrigées de l’incapacité. Il y a eu 11,9 millions de nouveaux accidents vasculaires cérébraux, dont 65,3 % (7,8 millions)1. La mort neuronale survient après une ischémie cérébrale, y compris la nécrose et l’apoptose. Le tissu cérébral le plus gravement touché subit par la suite une mort cellulaire nécrotique. Les neurones de la pénombre ischémique ou de la zone péri-infarctus peuvent subir une apoptose après plusieurs heures ou jours2. En plus des fonctions bioénergétiques et métaboliques, les mitochondries jouent également un rôle central dans la voie intrinsèque de l’apoptose 3,4,5,6.

Cyt C est une protéine codée par des gènes nucléaires. Dans des conditions normales, Cyt C n’existe qu’entre les membranes interne et externe des mitochondries et dans le noyau. La voie apoptotique médiée par sa libération est associée au contrôle réglementaire des membres de la famille Bcl-2. Après avoir été stimulés par l’apoptose, les oligomères Bax/Bak se forment et s’insèrent dans le pore externe de la membrane mitochondriale, ce qui entraîne des modifications de la pression osmotique mitochondriale et une perte de potentiel transmembranaire. Cyt C est libéré des mitochondries vers le cytoplasme, où il se lie à l’activateur de l’apoptose 1 pour former le complexe apoptotique et activer la pro-caspase-9. À leur tour, la caspase-3 et la caspase-7 sont activées, ce qui déclenche la cascade de caspase et induit l’apoptosecellulaire 7.

La microscopie électronique à transmission (MET) permet d’observer clairement les modifications de la structure cellulaire à différents stades de l’apoptose. L’observation morphologique en microscopie électronique est une méthode fiable pour déterminer l’apoptose8. Cependant, il ne peut pas observer de changements dans le Cyt C dans l’ultrastructure. Il existe plusieurs techniques pour détecter des protéines spécifiques dans l’ultrastructure : la cytométrie en flux, le dosage immuno-enzymatique, le dosage immuno-enzymatique, la spectrophotométrie et le Western blot. Cependant, ils ne peuvent pas capturer avec précision les changements d’emplacement des protéines dans la microstructure. L’or colloïdal a des particules de différentes tailles et la densité électronique de l’or colloïdal est élevée. La technologie Immunogold est particulièrement adaptée aux études de localisation en microscopie électronique unique ou multi-étiquettes. En raison de sa coloration rouge clair à foncé inhérente, l’or colloïdal se prête également à l’observation en microscopie optique. Lorsque des protéines spécifiques sont marquées par Immunogold, les changements de localisation peuvent être visualisés au moyen d’un TEM à une résolution subcellulairede 9.

Ce protocole décrit la mise en évidence de la transition du Cyt C mitochondrial par microscopie électronique à immunotransmission (IEM). L’objectif global de cette méthode est de visualiser la translocation subcellulaire de Cyt C pendant l’apoptose induite par l’ischémie à l’aide de l’IEM. La raison d’être de l’IEM est de marquer Cyt C avec de l’or colloïdal et de visualiser ses changements de localisation à la résolution subcellulaire à l’aide de TEM9. L’IEM peut observer les changements dynamiques des protéines au niveau spatial, fournissant un moyen puissant d’expliquer les activités physiologiques et pathologiques10.

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Protocole

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Le programme pour les animaux a été approuvé par le comité d’éthique de SLAS (IACUC numéro d’émission : SYST-2024-018). Ici, 6 rats SD mâles exempts d’agents pathogènes (200-220 g) ont été élevés dans des cages de ventilation indépendantes, en maintenant l’environnement du laboratoire à 22-25 °C et à 45 %-65 % d’humidité relative. Tous les rats ont été nourris de manière adaptative pendant 1 semaine avec de l’eau et un régime gratuits pendant la période.

1. Mise en place d’un modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO)

  1. Répartissez au hasard les rats en deux groupes : le groupe MCAO et le groupe d’opération fictive, avec trois rats dans chaque groupe. Voir la figure 1 pour l’organigramme expérimental.
  2. Vérifiez l’équipement impliqué dans ce protocole conformément à la liste de la figure 2.
  3. Pour établir un modèle de MCAO de lésion d’ischémie-reperfusion chez le rat, utilisez la procédure de suture intraluminale.
  4. Jeûnez les rats pendant 12 h avant la chirurgie avec de l’eau accessible.
  5. Anesthésier des rats SD avec de l’isoflurane à 2 % (voir le tableau des matières) dans un mélange air-oxygène à raison de 0,6 L/min. Confirmez la bonne anesthésie en coupant la peau des membres avec une pince ; Les rats ne doivent pas avoir de rétraction ou de réflexe de jambe. Fixez les rats complètement inconscients sur la table d’opération et maintenez la température corporelle à 37 °C à l’aide d’un régulateur de température pour animaux. Fermez leurs yeux pendant la chirurgie pour éviter la sécheresse.
  6. Retirez la fourrure autour du cou avec un rasoir électrique et désinfectez la peau avec de la bétadine. Faites une incision médiane du cou de 1,5 cm avec des ciseaux chirurgicaux (voir le tableau des matériaux), effectuez une dissection contondante sur le muscle et le fascia périvasculaire et exposez la trachée pour localiser l’artère carotide commune (ACC), l’artère carotide externe (ECA) et l’artère carotide interne (ICA) droites. Les outils chirurgicaux doivent être stérilisés pour prévenir les infections.
  7. Lissez l’extrémité distale de l’ECA avec une suture chirurgicale 6-0 et placez une autre suture chirurgicale lâchement autour de l’extrémité proximale de l’ECA jusqu’au point de bifurcation. Veillez à ne pas endommager le nerf vague.
  8. Clipsez l’ACC et l’ICA avec des clips vasculaires et faites une petite incision dans l’ECA entre deux sutures chirurgicales.
  9. Introduisez la suture monofilament dans la lumière de l’ECA vers le bas vers le CCA, resserrez la suture chirurgicale autour du moignon de l’ECA pour fixer la suture intraluminale et éviter les saignements. Assurez-vous que la suture monofilament correspond au poids de l’animal afin de minimiser les dommages et d’atteindre un volume cible d’infarctus de 40 % dans l’hémisphère ipsilatéral.
  10. Coupez la partie restante de l’ECA pour libérer la souche et positionnez la souche ECA sous le point de bifurcation de sorte qu’elle soit à peu près alignée avec l’ICA.
  11. Retirez le clip microvasculaire de l’ICA, continuez à faire avancer la suture jusqu’à ce qu’une légère résistance se fasse sentir, indiquant l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne ; Cette longueur est généralement d’environ 2 cm. Attachez fermement la suture autour du monofilament. Retirer l’autre clip microvasculaire de l’ACC.
  12. Fermez l’incision avec une suture chirurgicale et mettez le rat dans une cage de récupération, prenez soin de l’animal jusqu’à 2 h après l’ischémie.

2. Restauration du flux sanguin de l’artère cérébrale moyenne

  1. Avant la réanesthésie, vérifiez le neuroscore avec l’échelle Longa Score pour évaluer le succès de la chirurgie comme décrit à l’étape 3.
  2. Anesthésie le rat comme ci-dessus et rouvre l’incision. Placez un clip microvasculaire sur l’ACC, retirez la suture occlusive à mi-chemin de l’ICA jusqu’à ce que l’extrémité de la suture soit visible à travers l’ICA.
  3. Placez un autre micro-clip sur l’ICA au-dessus de l’emplacement de la suture intraluminale, retirez complètement la suture occlusive et attachez le moignon ECA. Reperfusion pendant 24h.
  4. Retirez les clips de la CCA et de l’ICA. Fermez l’incision avec une suture chirurgicale. Administrer la buprénorphine (0,05 mg/kg ; voir le tableau des matières) par voie sous-cutanée.
  5. Remettez le rat dans la cage, donnez-lui de l’eau et de la purée de nourriture, et prenez soin de lui jusqu’à ce qu’il reprenne conscience. Maintenez la température corporelle des rats à 37± 0,5 °C pendant toute la procédure expérimentale.

3. Évaluation du neuroscore

  1. Noter les déficits neurologiques après l’opération et 24 h après la reperfusion à l’aide de l’échelle de score de Longa11 : (0) aucun déficit ; (1) incapacité d’étendre complètement la patte avant gauche (côté paralysé) ; (2) tourner vers la gauche (côté paralysé) ; (3) tomber vers la gauche (côté paralysé) ; (4) pas de marche spontanée et diminution de la conscience ; (5) mort.
    REMARQUE : Trois opérateurs ont été évalués selon les normes ci-dessus.

4. Prélèvement de tissus cérébraux

  1. Prélever les tissus cérébraux 24 heures après la reperfusion après que les déficits neurologiques ont été notés et évalués.
  2. Anesthésier le rat comme décrit ci-dessus. Coupez la peau pour exposer la tête et le cou et coupez le cordon cervical de la colonne cervicale avec des ciseaux chirurgicaux (voir le tableau des matériaux).
  3. Séparez et retirez les muscles postérieurs du cou. Retirez délicatement le crâne à l’aide d’une pince incurvée (voir tableau des matériaux). Faites attention à la dure-mère lors de la séparation du crâne pour éviter de gratter les tissus cérébraux. Retirez complètement les tissus cérébraux.
  4. Placez les tissus cérébraux dans des fixateurs TEM et IEM prérefroidis à 4 °C et conservez-les au réfrigérateur à 4 °C.

5. Opération fictive

  1. Pour les opérations fictives, effectuez toutes les procédures comme ci-dessus, sauf que l’occlusion n’est pas terminée.

6. Préparation et imagerie de sections ultraminces

  1. Préparation de la section ultramince TEM
    1. Fixation : Déterminer le site d’échantillonnage des tissus frais afin de minimiser les dommages mécaniques tels que la traction, la contusion et l’extrusion, et s’assurer que l’épaisseur des tissus ne dépasse pas 2 mm. Assurez-vous que le volume du tissu ne dépasse pas 1 mm x 1 mm x 1 mm.
    2. Fixer avec le fixateur TEM à 4 °C pendant 24 h. Laver 3 fois pendant 15 minutes chacune dans un tampon phosphate 0,1 M PB (pH 7,4 ; voir tableau des matériaux).
    3. Post-fixation : Ajouter 1 % d’acide osmique ·0,1 M PB (voir tableau des matériaux) pendant 2 h à température ambiante (25 °C).
    4. Déshydratation : Déshydrater successivement les tissus dans de l’éthanol à 30 % pendant 10 min, de l’éthanol à 50 % pendant 10 min, de l’éthanol à 70 % pendant 15 min, de l’éthanol à 90 % pendant 15 min, de l’éthanol absolu pendant 15 min et de l’acétone à 100 % pendant 15 min.
    5. Trempage de gomme : Immerger successivement les tissus dans la solution de résine époxy SPI-Pon 812 : acétone = 1:3 pendant 30 min, solution SPI-Pon 812 : acétone = 1:1 pendant 30 min, et solution SPI-Pon 812 : acétone = 3:1 pendant 1 h (voir tableau des matériaux).
    6. Polymérisation et enrobage : Immerger l’échantillon dans du SPI-Pon 812 pur pendant une nuit à 37 °C, passer au SPI-Pon 812 frais pendant 8 h et polymériser à 60 °C pendant 48 h (voir le tableau des matériaux).
    7. Coupe : Trancher le bloc encastré en demi-finesse à 0,8 μm d’épaisseur à l’aide d’un couteau diamanté, colorer au bleu d’aminotoluène à 25 °C pendant 5 min. Localisez et sélectionnez des zones avec des neurones densément emballés à l’aide d’un microscope optique pour une observation à fort grossissement. Réalisez des sections ultraminces avec un microtome à 90 nm d’épaisseur. Placez les échantillons sur des grilles en cuivre revêtues de formvar de 200 mailles (voir tableau des matériaux).
    8. Post-coloration : Colorer les grilles dans l’acétate d’uranyle à 25 °C pendant 15 min, puis colorer les grilles dans le citrate de plomb à 25 °C pendant 5 min.
  2. Préparation de la section ultramince IEM
    1. Effectuez les étapes 6.1.1 à 6.1.4.
    2. Trempage de gomme : Immerger successivement les tissus dans la solution L. R. Résine blanche : Éthanol = 1 : 3 pendant 2 h, solution L. R. Résine blanche : Éthanol = 1 : 1 pendant 2 h, et solution L. R. Résine blanche : Éthanol = 3 : 1 pendant 2 h.
    3. Polymérisation et enrobage : Immerger l’échantillon dans de la résine L. R. White pure pendant la nuit à 4 °C, passer à de la résine L. R. White fraîche pendant 4 h à 25 °C et polymériser à 55 °C pendant 78 h.
    4. Coupe (comme à l’étape 6.1.7) : Coupez les blocs encastrés en une demi-fine épaisseur à 0,8 μm, colorez-les au bleu d’aminotoluène à 25 °C pendant 5 min. Localisez et sélectionnez les zones avec des neurones densément emballés avec un microscope optique. Réalisez des sections ultraminces à 90 nm d’épaisseur. Placez les échantillons sur des grilles en cuivre.

7. Étiquetage Immunogold

  1. Rincer 2 fois avec du PBS et 1 fois avec un tampon de glycine à 25 °C pendant 5 min chacun, puis ajouter un tampon phosphate à 2 % d’albumine sérique bovine (PBS-BSA) et incuber pendant 30 min.
  2. Incuber dans la solution d’anticorps primaire (anticorps polyclonal de lapin contre le cytochrome C) à 37 °C pendant 2 h. L’anticorps primaire est dilué avec du PBS-BSA dans un rapport de 1:50.
  3. Rincer au PBS à 25 °C pendant 5 fois pendant 5 minutes chacune. Incuber dans la solution d’anticorps secondaires colloïdaux marqués à l’or (IgG anti-lapin de chèvre conjugués à l’or) à 25 °C pendant 1 h. L’anticorps secondaire est dilué avec du PBS-BSA dans un rapport de 1:20 (voir le tableau des matériaux).
  4. Rincer au PBS à 25 °C pendant 5 fois pendant 5 minutes chacune. Rincer à l’eau distillée à 25 °C pendant 5 fois pendant 5 min chacune (voir tableau des matériaux).
  5. Post-coloration : Colorer les grilles dans l’acétate d’uranyle à 25 °C pendant 10 min, puis colorer les grilles dans le citrate de plomb à 25 °C pendant 2 min (voir le tableau des matériaux).
  6. Imagez la section ultramince et prenez des photos au microscope électronique à transmission à 80 kV.

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Résultats

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L’évaluation du neuroscore confirme le succès du MCAO, selon l’échelle de score de Longa, les rats du groupe MCAO présentaient au moins des cercles vers la gauche (neuroscore 2). Les rats du groupe d’opération simulée n’ont montré aucun dysfonctionnement neurologique évident (neuroscore 0). Aucune mortalité n’a été observée pendant la journée de l’opération. Le neuroscore des animaux est répertorié dans le tableau 1.

L’analyse IEM du groupe MCAO a révélé des neurones avec des ...

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Discussion

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L’objectif principal de la thérapie de reperfusion dans l’AVC ischémique aigu est de rétablir la perfusion sanguine dans la région ischémique. Nous pouvons maintenant atteindre cet objectif grâce à la thrombolyse intraveineuse, au traitement endovasculaire et au traitement antithrombotique. Cependant, la restauration de la perfusion sanguine entraîne des lésions d’ischémie-reperfusion, aggrave la nécrose neuronale et l’apoptose, entraînant une déficience neurologique. Au cours de l’isché...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par le Projet de recherche scientifique spécial sur la médecine traditionnelle chinoise de l’Administration provinciale de la médecine traditionnelle chinoise du Sichuan (2021MS414).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,9 % de solution saline normaleSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.
200 mailles grilles en cuivre revêtues de formvarZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.BZ10262a
220-230g MCAO MonofilamentsBeijing Cinontech Co., Ltd.A4-243250
Éthanol absoluChengdu  ; Kelong  ; Chemical  ;Co.,Ltd.
acétoneChengdu  ; Kelong  ; Chemical  ;Co.,Ltd.
Système d’anesthésie animaleRayward Life Technology Co., Ltd.R500
Mainteneur en température animaleRayward Life Technology Co., Ltd.69020
Table de cuissonShenzhen Bangqi Chuangyuan Technology Co., Ltd.CT-946
Cisaillement osseuxOutils de sciences fines16102-11
Moules d’enrobage capsulaireZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GP130-B
CentrifugeuseSCILOGEXD3024R
Microscopie optique conventionnelle à fond clairZeiss (Allemagne)Primo Star
Pince ophtalmique incurvée (10 cm)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.
Couteau diamantéDiatomée (Suisse)DU4530
Pince à dissectionRayward Life Technology Co., Ltd.F12018-10
Pince à dissectionRayward Life Technology Co., Ltd.F12010-10
Four de séchage électriqueShanghai YiHENG Scientific Instrument Co., Ltd.DHG-9030A
Rasoir électriqueYiwu Kemei Electric Appliances Co., Ltd.KM-PG5002
Fluide de fixationSichuan Scientist Biotechnology CO., Ltd.SC0001
Nantong Mevid Life Science Co., Ltd.
Chèvre conjuguée à l’or anti-lapin lgGSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Pince hémostatique (12,5 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL068
Pince hémostatique (14 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL002
IsofluraneRayward Life Technology Co., Ltd.
L. R. Résine blancheTianjin Tainuo Science and Technology Co., Ltd.
Citrate de plombSPI (US)GA10701
Porte-aiguilleJiachi Medical Technology Co., Ltd.
Tétroxyde d’osmiumTED PELLA (US)4008-220501
PBSServicebioG4202
Anticorps polyclonal de lapin contre le cytochrome c  ;   ;Affinity Biosciences, Ltd.AF0146
RatsBeijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd.
SPI-Pon 812 Kit d’encastrement en résineSPI(US)GS02660
StéréomicroscopeSunny Optical Technology Co., Ltd.Soptop SZMN
Ciseaux à tête droite (10 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL063
Pince ophtalmique droite (10cm)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.
Ciseaux chirurgicauxRayward Life Technology Co., Ltd.S14001-10
Microscopie électronique à transmissionHitachi (Japan), Ltd.HT7800
ultramicrotomeLeica (Allemagne)UC7
Acétate d’uraniumSPI (États-Unis)GS02624
H2008340020231012012023120501211001Lame de verre 220518001D1110942024071201AGR1281A10044036898028110322241102187881211001

Références

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