Method Article

Microscopie multi-harmonique à autofluorescence simultanée sans marquage

DOI:

10.3791/68637

⸱

August 29th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Bioengineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 4NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics, University of Illinois Urbana-Champaign

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole présente un guide étape par étape pour la technique microscopique SLAM (Simultaneous Mark-free Autofluorescence Multi-harmonic), y compris des détails sur la façon de générer la source de lumière laser, de préparer un échantillon de tissu, d’effectuer l’imagerie et d’analyser les données. SLAM fait progresser la microscopie non linéaire en mesurant quatre contrastes complémentaires sans marquage pour étudier le microenvironnement tissulaire.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopie optique non linéaire image des échantillons biologiques en détectant les signaux de l’interaction non linéaire d’impulsions laser ultracourtes avec des molécules endogènes. Cette méthode permet une identification chimique et structurelle rapide à résolution subcellulaire de manière non destructive ou sans marquage, ce qui permet une approche puissante pour étudier les cellules et les tissus. Ces contrastes non linéaires distinctifs comprennent l’autofluorescence excitée par plusieurs photons et la génération d’harmoniques. Parce que chacun de ces contrastes offre des avantages et des limites uniques, leur combinaison et leur co-enregistrement spatio-temporel fournissent une palette de contraste complémentaire qui améliore les capacités analytiques de la microscopie optique non linéaire. Par conséquent, notre groupe a développé la microscopie multiharmonique à autofluorescence simultanée sans marquage (SLAM), une technique d’imagerie qui mesure quatre signaux optiques non linéaires générés simultanément ou plus, dans le but d’identifier des caractéristiques morphologiques, métaboliques et fonctionnelles distinctes dans les échantillons biologiques. Ici, nous présentons un protocole pour l’imagerie SLAM des tissus, en nous concentrant sur les composants essentiels de la technique, notamment la source laser, la compression d’impulsion et le microscope. En outre, nous abordons la préparation des échantillons et décrivons le pipeline de traitement des données SLAM. Le flux de travail présenté est adapté à l’étude de l’état métabolique, de la disposition, des réponses cellulaires et de la composition des tissus humains et animaux sans s’appuyer sur des marqueurs exogènes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopie optique non linéaire exploite la réponse d’un échantillon à un rayonnement optique intense (lumière avec des champs électriques supérieurs à 3 × 103 V/cm) pour dériver le contraste de l’image, où la polarisation induite (et donc le signal généré) dépend de manière non linéaire de l’intensité incidente 1,2,3. Parce que ces multiples contrastes sont chacun médiés par différentes interactions lumière-matière, la microscopie non linéaire offre un accès simultané à des informations uniques concernant à la fois la morphologie et le paysage chimique d’un spécimen 1,2,3. Alors que les techniques de microscopie traditionnelles impliquant une interaction linéaire avec la lumière d’éclairage permettent également une imagerie quantitative, la microscopie non linéaire permet une approche plus multimodale, ayant souvent une profondeur d’imagerie et une coupe optique améliorées, tout en causant moins de photodommages à l’échantillon4. Dans le contexte d’applications biomédicales, telles que l’évaluation histologique peropératoire des tissus 5,6, cette technique permet de sonder directement les biomolécules natives, facilitant ainsi l’investigation sans couture des cellules vivantes sans avoir besoin de marqueurs ou de modifications externes. Cette approche évite l’utilisation de marqueurs, de marqueurs7, de molécules exogènes, de protéines fluorescentes génétiquement exprimées ou de nanoparticules, qui non seulement nécessitent un travail intensif, mais ont également le potentiel de perturber la biochimie native de l’échantillon et d’avoir un impact négatif sur les cellules ou les tissus cibles 8,9,10. Ainsi, le microscope non linéaire constitue un outil analytique puissant et authentique qui fournit une imagerie continue des structures microscopiques sans altérer l’intégrité chimique et structurelle de l’échantillon. Cette capacité ouvre un large éventail d’applications, allant du diagnostic et de la découverte de médicaments à la signalisation cellulaire et à la biologie des systèmes.

Les contrastes multiphotoniques tels que l’autofluorescence à deux photons (2PAF), l’autofluorescence à trois photons (3PAF), la génération de deuxième harmonique (SHG) et la génération de troisième harmonique (THG) confèrent chacun des avantages analytiques dans la caractérisation des échantillons. 2Le PAF est généré par des flavines endogènes, la flavine adénosine dinucléotide (FAD) étant la plus abondante dans les systèmes biologiques11. 3PAF exploite l’excitation proche infrarouge pour visualiser des chromophores intrinsèques tels que le NAD(P)H et permet l’imagerie métabolique tout en contournant les problèmes de phototoxicité et d’atténuation liés aux UV12. SHG révèle spécifiquement des structures moléculaires non centrosymétriques telles que le collagène fibrillaire (types I, II et III) et les réseaux de protéines 13,14,15,16,17, fournissant des informations structurelles 1. Enfin, le THG, sensible aux interfaces et aux petites caractéristiques structurales, excelle dans l’imagerie des distributions lipidiques et des vésicules extracellulaires 18,19,20,21,22.

Chacun de ces signaux de contraste a été exploré indépendamment par des groupes de recherche, établissant le créneau de la microscopie non linéaire multiphotonique en tant qu’outil fiable et polyvalent pour les applications biologiques 23,24,25,26. Ces efforts ont été menés par les inventeurs du microscope 2PAF, qui ont exploité leur technologie innovante pour mieux comprendre la morphologie des tissus, le métabolisme cellulaire et même les caractéristiques morphofonctionnelles de pathologies telles que la maladie d’Alzheimer et le cancer23. Leurs travaux ont finalement conduit à des applications révolutionnaires en neurosciences27,28. Au cours des années suivantes, plusieurs chercheurs ont mis en évidence la sensibilité du SHG aux modifications de la matrice extracellulaire, l’échafaudage qui fournit un soutien structurel aux cellules et qui subit des altérations substantielles au cours de la pathogenèse du cancer29. Notamment, Campagnola et al.14,24,30,31 ont démontré que la microscopie SHG permet de visualiser des assemblages macromoléculaires et supramoléculaires, révélant des détails tels que l’arrangement, la concentration et le type de collagène qui ne sont pas détectables avec les techniques conventionnelles basées sur la fluorescence. Ces résultats ont souligné le potentiel de la microscopie SHG en tant qu’outil de diagnostic viable en milieu clinique. Enfin, la microscopie THG a été appliquée avec succès pour visualiser les couches rétiniennes chez les rongeurs à une résolution subcellulairede 25, cartographier les structures cérébrales32 et capturer la topographie multi-interfaciale de l’invasion cellulaire du mélanome33.

Ces mises en œuvre historiques de la microscopie non linéaire impliquaient généralement un laser femtoseconde (fs) à verrouillage de mode couplé à un objectif à haute ouverture numérique (NA) pour générer et collecter les signaux non linéaires, qui étaient ensuite dirigés avec un miroir dichroïque vers un filtre passe-bande et collectés avec un tube photomultiplicateur (PMT)34. Malgré des implémentations similaires, la plupart des applications se sont concentrées sur l’acquisition d’un seul ou, tout au plus, de deux contrastes, tout en négligeant les autres. Pour réaliser pleinement le potentiel du microscope multiphotonique, Boppart et al. ont d’abord mis en œuvre l’acquisition séquentielle de plusieurs contrastes non linéaires 21,35,36,37, suivie de leur détection simultanée 4,22,38,39,40,41. La technique résultante, connue sous le nom de microscopie multiharmonique à autofluorescence simultanée sans marquage (SLAM), co-enregistre spatialement et temporellement les signaux non linéaires 2PAF, 3PAF, SHG et THG par excitation à injection unique et détection multiplex, ce qui permet d’obtenir une puissance analytique supérieure. La co-localisation spatio-temporelle de ces quatre canaux fournit des données hautement classées et riches en fonctionnalités42, offrant des avantages par rapport aux données acquises séquentiellement en éliminant les artefacts de mouvement et en assurant un meilleur recalage des images. Par conséquent, le SLAM permet de générer des caractéristiques composites, telles que des rapports optiques de réduction-oxydation, qui caractérisent efficacement les propriétés métaboliques 43,44,45. De plus, l’analyse combinée des signaux à travers les modalités facilite l’ingénierie de caractéristiques supplémentaires basées sur la corrélation et la colocalisation des canaux. Par exemple, Shi et al. ont démontré l’importance des caractéristiques de colocalisation de la microscopie SLAM dans la classification précise des cellules d’ovaire de hamster chinois (CHO) utilisées dans la production pharmaceutique42. De cette façon, le SLAM jette les bases de ce qui est aujourd’hui considéré comme l’état de l’art en microscopie multiphotonique, ouvrant ainsi la voie à de futures avancées dans le domaine46.

Dans ce protocole, nous décrivons les composants clés d’un microscope SLAM (Figure 1) et décrivons une méthodologie étape par étape pour sa mise en œuvre. Cela comprend la génération et la mise en forme des impulsions d’excitation, la préparation représentative des échantillons de tissus, les procédures d’imagerie et le traitement, ainsi que l’affichage des données résultantes. En utilisant une technologie prête à l’emploi et des techniques établies, ce protocole est universel, transférable et peut être facilement reproduit à l’aide de systèmes optiques similaires dans différents laboratoires.

figure-introduction-1
Figure 1 : La conception optique d’un microscope à autofluorescence multiharmonique (SLAM) sans marquage simultané. Le laser femtoseconde émet une lumière de 1040 nm en impulsions de 370 fs à un taux de répétition de 10 MHz. L’intensité et la polarisation du laser sont soigneusement contrôlées avant de pomper un cristal photonique pour générer un supercontinuum. Les impulsions sont ensuite compressées par un façonneur d’impulsions et dirigées vers un microscope à balayage laser personnalisé (boîte en pointillés). Les miroirs dichroïques et les filtres passe-bande isolent les signaux non linéaires générés par l’échantillon avant qu’ils ne soient détectés par des détecteurs de photons à haute sensibilité tels que les tubes photomultiplicateurs (PMT) ou les photodétecteurs hybrides (HPD). La conception optique est basée sur un système41 décrit précédemment. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les études sur les animaux ont été réalisées conformément au protocole UIUC#23031 approuvé par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de l’Illinois et ont strictement suivi toutes les directives et réglementations pertinentes.

1. Civrage et alignement de la fibre à cristaux photoniques (PCF)

  1. À l’aide de coupe-fibres ou de coupe-fils, coupez une section de fibre à cristaux photoniques (PCF, Table des matériaux) sur une longueur d’un peu plus de 15 cm.
    REMARQUE : Des longueurs d’au moins 1,5 cm seront clivées à chaque extrémité du PCF car cette longueur est nécessaire pour fixer solidement le PCF pendant le clivage. La longueur finale du PCF (12 cm) utilisé dans cette étude a été déterminée sur la base d’une simulation précédente à l’aide de l’équation de Schrödinger non linéaire généralisée47 et d’essais empiriques. En général, la meilleure longueur de PCF peut varier en fonction du type de PCF, de l’entrée laser de la pompe et du supercontinuum souhaité.
    ATTENTION : Lors de la coupe du PCF, portez un équipement de protection individuelle (EPI) pour protéger les yeux et la peau de l’expérimentateur. Jetez immédiatement les déchets de fibres dans le conteneur d’élimination des objets tranchants.
  2. Enlevez environ 3 cm du revêtement plastique à chaque extrémité du PCF à l’aide d’un décapant à fibres (Table des matériaux) ou d’une lame de rasoir, et nettoyez tout plastique résiduel avec du papier de soie (Table des matériaux) et du méthanol à 100 %.
  3. Placez une extrémité du PCF dans le support sur un couperet à fibre optique de précision (Table des matériaux) et alignez la lame à 1,5 cm de l’extrémité du PCF. Fermez soigneusement les pinces et appuyez sur le bouton de clivage .
    REMARQUE : Suivez attentivement le manuel d’utilisation du couperet à fibre, y compris les directives spécifiques pour le clivage des PCF. Les paramètres, tels que la tension de la fibre, peuvent nécessiter un réglage fin pour des clivages cohérents et de haute qualité pour chaque type de PCF.
  4. Inspecter la face et le côté clivés du PCF à l’aide du microscope intégré (grossissement de 10×) sur un poste de travail de traitement de la fibre de verre (Tableau des matériaux), en s’assurant que le clivage est de bonne qualité (figures 2A, C). Clivage de nouveau s’il y a des débris (figure 2D), des rayures (figure 2E) ou si la surface clivée n’est pas plate et perpendiculaire à la longueur du PCF (figure 2B).
    REMARQUE : Des précautions extrêmes doivent être prises lors de cette étape et des étapes ultérieures pour éviter de toucher les extrémités clivées du PCF à une surface pour éviter de causer des dommages.
  5. Fendre la deuxième extrémité du PCF, en assurant la longueur finale souhaitée.
    REMARQUE : Le PCF utilisé dans ce protocole est coupé à 12 cm.
  6. Comme pour les étapes précédentes, inspectez l’extrémité nouvellement clivée du PCF (reportez-vous à l’étape 1.4). Si le clivage semble défectueux ou incohérent, jetez le PCF actuel et répétez le processus avec un nouveau.
  7. Fixez l’extrémité d’entrée du PCF sur une platine à 3 axes (Table des matériaux) à peu près à la distance focale de la lentille de couplage de fibre mesurée à l’aide d’une règle. Soutenez solidement l’autre extrémité du PCF à l’aide d’un poteau ou d’un support temporaire.
    REMARQUE : Ne serrez pas encore la sortie pour éviter de casser le PCF lors du réglage grossier.
    ATTENTION : Il est nécessaire de soutenir l’extrémité de sortie et de l’entourer de blocs de faisceau suffisants pour réduire le risque d’exposition au laser.
  8. Placez un wattmètre optique (Table des matériaux) dans le trajet du faisceau juste avant le PCF pour mesurer la puissance d’entrée. Assurez-vous que le laser femtoseconde (Table des matériaux) est bloqué par l’obturateur 1 avant d’allumer le laser.
    REMARQUE : Suivez toujours tous les programmes de formation à la sécurité laser requis pour comprendre les risques associés à l’utilisation du laser.
    ATTENTION : Lors de l’utilisation du laser, portez des lunettes de sécurité laser appropriées spécifiquement conçues pour la longueur d’onde et la puissance du laser utilisé. Avant d’utiliser le laser, retirez tous les bijoux, montres et autres objets réfléchissants qui peuvent provoquer des reflets parasites dangereux.
  9. Allumez le laser et laissez-le se réchauffer pendant le « temps de préchauffage à froid » spécifié par le laser. Ouvrez l’obturateur 1 et réglez la puissance à l’aide de la plaque demi-onde (HWP1) juste avant le séparateur de faisceau polarisant jusqu’à ce que le wattmètre indique 260 mW ou moins.
    REMARQUE : L’utilisation de 260 mW pour l’alignement a été déterminée empiriquement comme étant suffisamment faible pour éviter d’endommager le PCF (même lorsqu’il est mal aligné) tout en fournissant un faisceau lumineux pour la visualisation sur une visionneuse IR ou une cible fluorescente.
  10. Bloquez le laser à l’aide de l’obturateur 1 et déplacez le wattmètre vers l’extrémité de sortie du PCF.
  11. Débloquez le laser et ajustez l’axe optique de la face d’entrée du PCF à l’aide de l’étage à 3 axes jusqu’à ce qu’un signal apparaisse sur le wattmètre, indiquant qu’une partie de la lumière est couplée dans le noyau, la gaine ou le revêtement plastique du PCF. Si le positionnement de l’entrée PCF au foyer du faisceau est au-delà de la portée de la platine 3 axes, bloquez le laser, puis ajustez et refixez le PCF.
    REMARQUE : Une visionneuse infrarouge (IR) ou une cible fluorescente peut être utilisée pour visualiser où le faisceau est focalisé.
  12. À l’aide de la platine à 3 axes, ajustez une dimension de l’axe optique du PCF pour trouver la plage sur laquelle la lumière est couplée, calculez le milieu de cette plage et déplacez la platine à cet endroit. Répétez cette opération pour la deuxième dimension afin de centrer approximativement la poutre sur le noyau du PCF.
    REMARQUE : Les graduations μm sur la platine à 3 axes peuvent aider à mesurer les distances et à trouver le centre du PCF.
  13. Ajustez de manière itérative les trois dimensions de la platine à 3 axes dans une séquence répétitive tout en optimisant l’efficacité du couplage pour centrer et focaliser précisément le faisceau dans le cœur du PCF.
    REMARQUE : Si l’efficacité maximale du couplage, mesurée par le wattmètre, est sensiblement inférieure à 80 % de la puissance d’entrée fermer l’obturateur 1, desserrez le PCF et inspectez-le pour l’endommager. S’il est endommagé, redémarrez à partir de l’étape 1.1, sinon, bloquez le laser, resserrez le PCF et redémarrez l’alignement à partir de l’étape 1.11.
  14. Bloquez le faisceau avec l’obturateur 1 et augmentez la puissance laser à 1,6 W.
    REMARQUE : L’utilisation de 1,6 W a été déterminée par simulation et essais empiriques pour générer un supercontinuum suffisamment large, tout en restant inférieur au seuil de dommage du PCF.
  15. Ouvrez l’obturateur 1 et ajustez à nouveau de manière itérative la platine à 3 axes pour ajuster l’emplacement d’entrée du PCF afin d’optimiser l’efficacité du couplage.
    REMARQUE : Empiriquement, l’efficacité maximale est généralement d’environ 80 %.
  16. Fermez l’obturateur 1 et fixez la sortie du PCF à peu près à la distance focale du miroir parabolique. Placez un bloc de faisceau à la sortie du miroir parabolique.
  17. Réduisez à nouveau la puissance laser à 260 mW ou moins.
  18. Ouvrez l’obturateur 1 et utilisez la platine à 3 axes du miroir parabolique pour aligner l’axe optique du miroir parabolique afin de minimiser la distorsion du faisceau. Ensuite, ajustez la mise au point et collimatez le faisceau en champ lointain.
    REMARQUE : Utilisez une visionneuse IR ou une cible fluorescente pour visualiser le faisceau de sortie.
  19. Ajustez les miroirs après le miroir parabolique pour vous assurer que le faisceau est aligné sur le reste du système optique.
    REMARQUE : Installez des cibles d’alignement ou des iris permanents pour rendre cette étape reproductible.
  20. Fermez l’obturateur 1 et augmentez la puissance du laser à 1,6 W. Ouvrez l’obturateur 1 et vérifiez que la trajectoire du faisceau est inchangée.
  21. Mesurez la puissance de sortie du façonneur d’impulsions (Table des matériaux) à l’aide d’un wattmètre. Faites pivoter la plaque demi-onde devant le façonneur d’impulsions (HWP3) pour optimiser l’efficacité de transmission du formateur d’impulsions.

figure-protocol-1
Figure 2 : Extrémités clivées de la fibre à cristaux photoniques (PCF). (A, B) Images du côté du clivage. (C-F) Images du visage du clivage. (A) Un PCF bien clivé a une face plate et perpendiculaire. (B) Un PCF mal clivé avec une face inclinée et ébréchée. (C) Un PCF bien clivé avec une face propre. (D) Un PCF mal manipulé qui a de la saleté à sa surface. (E) Un PCF mal clivé avec des rayures sur sa surface. (F) Un ancien PCF qui a été remplacé. Il y a des dommages visibles au noyau du PCF, comme en témoigne la tache sombre au centre du PCF. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Caractérisation et optimisation des impulsions

  1. À l’aide d’un spectromètre ou d’un analyseur de spectre optique (OSA, Table of Materials), mesurez le laser après le miroir parabolique pour vérifier la génération du supercontinuum du PCF.
  2. Faites pivoter la plaque demi-onde après le séparateur de faisceau polarisant (HWP2) pour optimiser la largeur du supercontinuum.
  3. Allumez l’autocorrélateur de microscopie (Table des matériaux). À l’aide du logiciel, réglez le détecteur sur le détecteur interne et réglez la plage de balayage sur 5 ps pour vous assurer que toute la largeur de l’autocorrélation d’impulsions sera capturée.
    REMARQUE : Pour les configurations avec des largeurs d’impulsion plus longues (par exemple, en raison de la dispersion dans un long PCF), la plage de balayage doit être augmentée de manière appropriée. Gardez à l’esprit que la largeur d’impulsion mesurée par un autocorrélateur d’intensité n’est pas la durée réelle de l’impulsion, mais qu’elle peut toujours servir de référence utile pour la compression d’impulsion. Pour une caractérisation précise et complète de l’amplitude et de la phase de l’impulsion, il faut utiliser des techniques résolues spectralement telles que le Frequency-Resolved Optical Gating (FROG)48 .
  4. Débloquez le laser et alignez l’autocorrélateur sur le faisceau sortant du façonneur d’impulsions jusqu’à ce qu’un signal apparaisse.
    REMARQUE : La mise en place de miroirs temporaires (deux à l’entrée et deux à la sortie de l’autocorrélateur) permettra d’aligner le faisceau sur l’autocorrélateur sans affecter le reste du système optique.
  5. Assurez-vous que l’obturateur 2 est fermé et appliquez le support d’immersion approprié (tel que de l’eau ou de l’huile) sur l’objectif (table des matériaux). Placez le détecteur externe d’autocorrélateur sur la platine du microscope (Table des matériaux) et ajustez la platine pour positionner le détecteur directement au-dessus de l’objectif.
    REMARQUE : Contrairement aux objectifs de microscope classiques, les objectifs recommandés utilisés pour la microscopie SLAM sont transmissifs aux ultraviolets pour améliorer la détection du THG38.
  6. Allumez les miroirs du galvanomètre à balayage (Table des matériaux) pour régler leur tension à zéro. Ouvrez l’obturateur et utilisez une visionneuse IR ou une cible fluorescente pour vérifier que le faisceau atteint le détecteur externe.
  7. Réglez le détecteur d’autocorrélateur pour qu’il soit le détecteur externe. Ajustez la position de la platine jusqu’à ce que le signal apparaisse.
    REMARQUE : Si le détecteur sature, réduisez la puissance à l’aide du filtre à densité neutre.
  8. Ajustez les coefficients polynomiaux (ordres de dispersion) du façonneur d’impulsions pour minimiser de manière itérative la largeur d’impulsion mesurée par l’autocorrélateur. Réduire la plage de balayage de l’autocorrélateur de manière appropriée à mesure que la largeur d’impulsion diminue afin d’améliorer la précision et la visualisation de la fonction d’autocorrélation.
    REMARQUE : La largeur d’impulsion optimale, mesurée avec un ajustement gaussien, doit être de quelques dizaines de femtosecondes (fs).

3. Préparation de l’échantillon

REMARQUE : Par souci de simplicité, ce protocole décrit l’imagerie tissulaire ex vivo . Cependant, en raison de la nature sans marquage du SLAM, les procédures d’imagerie in vivo sont facilement adaptables38.

  1. Euthanasier l’animal par asphyxie au CO2 ou par toute autre méthode d’euthanasie approuvée par l’IACUC.
  2. Prélever le ou les organes d’intérêt à l’aide de la procédure de nécropsiestandard 49 dans les 10 minutes suivant l’autopsie et rincer avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pré-refroidie pour éliminer le sang.
    REMARQUE : Dans cette étude, le foie et les poumons ont été prélevés.
  3. Disséquez l’organe verticalement ou horizontalement à l’aide d’une lame, en fonction de l’orientation requise pour l’analyse. Assurez-vous que la dissection est effectuée avec précision pour maintenir l’intégrité de la structure tissulaire.
  4. Placez le morceau de tissu dans une boîte de culture tissulaire stérile remplie de milieux de culture cellulaire complets sans rouge de phénol. Réfrigérez le mouchoir à 4 °C si vous ne recueillez pas immédiatement les images.
    REMARQUE : Le milieu de culture cellulaire utilisé dans cette étude était un milieu d’aigle modifié (DMEM) tamponné HEPES - Dulbecco’s complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 4 mM de glutamine et des suppléments de milieu de croissance des cellules endothéliales (tableau des matériaux). Ce milieu a été soigneusement choisi pour maintenir la viabilité physiologique des cellules épithéliales et endothéliales résidant dans l’échantillon de tissu rénal pendant la durée de l’imagerie50.
  5. Pour préparer des étalons d’étalonnage de fluorescence, mettez une balance de précision à zéro sur le poids d’un bateau de pesée antistatique et mesurez environ 5 mg de sel disodique de flavine adénine dinucléotide (FAD, Table des matériaux) ou 5 mg de sel disodique de nicotinamide adénine dinucléotide disodique (NADH, Table des matériaux).
  6. À l’aide d’une pipette monocanal, distribuer un volume approprié de tampon HEPES de 1 M dans les cabines de pesée contenant des poudres de DCP ou de NADH pré-pesées afin de préparer des solutions mères de 5 mM. Pipetez de haut en bas à plusieurs reprises pour dissoudre la poudre.
  7. Préparer des solutions de travail de 1 mM à partir des solutions mères par dilution 1:5 dans le tampon HEPES.
    REMARQUE : Il a été déterminé empiriquement que la concentration de travail de 1 mM utilisée dans cette étude produit un signal élevé tout en évitant la saturation du détecteur.
  8. Stocker les solutions mères de DAP et de NADH dans des tubes de microcentrifugation à 4 °C.
    REMARQUE : Les étalons de solution peuvent être conservés au réfrigérateur pendant plusieurs jours, mais il est recommandé de préparer des solutions fraîches pour chaque expérience.
  9. Juste avant de collecter les images de microscopie SLAM, placez les échantillons de tissus dans des boîtes d’imagerie à fond de verre de 35 mm (Table des matériaux). Vous pouvez également utiliser une lamelle en verre. Aliquote les solutions FAD et NADH dans des plats ou des lamelles identiques.
    REMARQUE : Le verre non revêtu ou le verre revêtu de poly-D-lysine est fortement recommandé en raison de la réduction du signal de fond. Assurez-vous que l’épaisseur du verre est appropriée pour l’objectif du microscope utilisé (cette étude a utilisé #0).

4. Configuration et fonctionnement du SLAM

  1. Vérifiez que l’entrée laser du PCF est bloquée par l’obturateur 1 et allumez le laser. Laissez le laser se réchauffer pendant le « temps de préchauffage à froid » spécifié du laser.
    REMARQUE : Un temps de préchauffage à froid de 30 minutes est utilisé pour le laser dans cette étude.
  2. Vérifiez que le trajet du faisceau est dégagé de tout obstacle et placez un wattmètre optique dans le trajet du faisceau juste avant le PCF. Ouvrez l’obturateur 1 et mesurez la puissance d’entrée.
  3. Fermez l’obturateur 1 et déplacez le wattmètre sur la sortie du PCF après le miroir parabolique. Ouvrez l’obturateur 1 et maximisez la sortie du PCF à l’aide de la platine d’entrée sur 3 axes.
  4. Laissez le PCF se réchauffer pendant 10 min, puis maximisez à nouveau la puissance de sortie. Enregistrez la transmission du PCF. Si la transmission tombe en dessous de 50 %, remplacez le PCF.
    REMARQUE : Tout au long du fonctionnement du microscope SLAM (dans les étapes qui suivent), il est recommandé de mesurer la puissance de sortie du PCF toutes les heures pour garantir des données cohérentes.
  5. Déplacez le wattmètre après le filtre à densité neutre (ND) et tournez le filtre pour contrôler la puissance laser qui atteint l’échantillon.
    REMARQUE : Multipliez la puissance mesurée par la transmittance des composants optiques restants. La transmittance est mesurée en plaçant le wattmètre après la lentille de l’objectif. Pour cette étude, une puissance laser moyenne de 20 mW sur l’échantillon a été utilisée. La puissance du laser a été déterminée empiriquement pour l’échantillon, la profondeur d’imagerie et le système de microscope donnés afin de générer des images de haute qualité tout en évitant d’endommager l’échantillon ou la non-linéarité du détecteur. Bien qu’il n’existe pas de norme définitive, l’imagerie multiphotonique sans marquage typique est limitée à quelques dizaines à des centaines de milliwatts 7,32,33,51,52.
  6. Allumez les galvanomètres et la platine. Ouvrez le logiciel d’acquisition et entrez les paramètres souhaités pour l’imagerie.
    REMARQUE : Cette étude a utilisé 512 × 512 pixels et un temps de séjour des pixels de 13,65 μs pour imager un champ de vision de 360 × 360 μm2 . La moyenne de cinq images prises à 0,333 Hz a été calculée en une seule image de haute qualité.
  7. Placez l’échantillon sur la platine en utilisant le milieu d’immersion approprié à l’objectif, comme cela a été utilisé précédemment à l’étape 2.5.
  8. Éteignez les lumières de la pièce et fermez les rideaux.
    REMARQUE : Pour éviter d’endommager les détecteurs, n’allumez jamais les lumières de la pièce lorsque les détecteurs sont allumés ou que les volets du détecteur sont ouverts.
  9. Allumez les alimentations et les amplificateurs du détecteur.
  10. Fermez la boîte à lumière qui entoure la scène.
  11. Utilisez les interrupteurs de commande électroniques pour ouvrir manuellement les volets du détecteur (S3, S4, S5, S6).
  12. Dans le logiciel d’acquisition de microscope, cliquez sur Cliquez pour démarrer l’acquisition pour commencer à collecter des images SLAM. Ajustez la mise au point du microscope en tournant le bouton du contrôleur de platine du microscope (Table des matériaux) jusqu’à ce que l’échantillon soit mis au point.
    REMARQUE : La lamelle en verre génère un signal THG puissant, qui peut être utilisé pour déterminer avec précision la profondeur de l’imagerie à l’aide de la position de la platine affichée sur le contrôleur de platine de microscope. Par exemple, toutes les images des étalons de solution prises dans cette étude ont été prises à un plan focal de 20 μm au-dessus de la lamelle.
  13. Utilisez le joystick de la commande de la platine de microscope pour localiser le champ de vision souhaité dans l’échantillon, puis cliquez sur Arrêter et réinitialiser.
    REMARQUE : Si l’image sature, revenez à l’étape 4.5 et baissez la puissance. Si l’image a un rapport signal/bruit inférieur à 10, la puissance peut être augmentée avec précaution.
  14. Sous l’onglet Enregistrement , cliquez sur Enregistrer les données pour passer à Oui, puis cliquez sur Cliquer pour démarrer l’acquisition. Attendez la fin de l’acquisition avant de continuer.
  15. Pour modifier ou manipuler l’échantillon pendant l’imagerie, fermez les obturateurs du détecteur et utilisez une lampe de poche ou une lampe frontale pour la lumière. Une fois l’exemple modifié, revenez à l’étape 4.10.
    REMARQUE : Pour permettre la répétabilité et l’analyse quantitative, collectez des images SLAM des normes de solution FAD et NADH. Assurez-vous que le champ de vision, la taille de l’image et la puissance d’excitation correspondent à ceux utilisés pour les échantillons biologiques.
  16. Pour terminer l’acquisition d’images SLAM, fermez les volets du détecteur et éteignez les détecteurs avant d’allumer les lumières de la pièce.
  17. Bloquez le laser à l’aide de l’obturateur 1, puis éteignez le laser.
  18. Éteignez les galvanomètres et la platine. Fermez le logiciel d’acquisition de microscope.
  19. Jetez le mouchoir de manière appropriée et nettoyez le lieu de travail.

5. Visualisation des données

REMARQUE : l’analyse d’image suivante peut se produire dans un logiciel d’analyse d’images tel que ImageJ53 (Table of Materials) ou dans un langage de programmation doté de capacités d’analyse d’images, tel que Python ou MATLAB. Les étapes suivantes décrivent comment effectuer une visualisation de données à l’aide d’ImageJ.

  1. Assurez-vous que les images de chaque canal sont dans un format d’image sans perte (par exemple, TIFF ou PNG).
    REMARQUE : Le logiciel de contrôle de microscope personnalisé utilisé dans cette étude a automatiquement enregistré les images au format TIFF. Pour enregistrer une image au format TIFF, ouvrez-la dans ImageJ et sélectionnez Fichier > Enregistrer sous > TIFF.
  2. Pour générer des images standard d’éclairage, ouvrez les images des canaux FAD et NAD(P)H des solutions FAD et NADH, respectivement, dans ImageJ. Pour chaque image, sélectionnez Traiter > filtres > Flou gaussien..., réglez Sigma (Rayon) sur 41, puis cliquez sur OK.
    REMARQUE : Ajustez le Sigma (Rayon) du filtre gaussien si nécessaire pour lisser suffisamment l’image.
  3. Pour corriger simultanément l’éclairage inégal et normaliser l’intensité de fluorescence, ouvrez les images des canaux FAD et NAD(P)H de l’échantillon. Pour chaque image, sélectionnez Traiter > calculatrice d’image..., pour Image1 , sélectionnez l’image exemple, pour Opération , sélectionnez Diviser, et pour Image2 , sélectionnez l’image standard d’éclairage qui correspond au canal de l’image d’échantillon, puis cliquez sur OK.
    REMARQUE : Cette étape est essentielle pour corriger la variabilité du système et maintenir la cohérence des évaluations quantitatives de l’autofluorescence, telles que le rapport d’oxydoréduction optique (ORR).
  4. Si plusieurs images sont prises pour former un champ de vision plus large ou une pile en Z, assemblez ou combinez les images en une seule image ou une pile d’images.
  5. Pour générer une image ORR, additionnez d’abord les images FAD et NAD(P)H. Sélectionnez Traiter > calculatrice d’image..., pour Image1 et Image2, sélectionnez respectivement les images des canaux FAD et NAD(P)H, pour Opération , sélectionnez Ajouter, puis cliquez sur OK. Pour calculer l’image ORR, sélectionnez Traiter > calculatrice d’image..., pour Image1 , sélectionnez l’image du canal FAD, pour Opération , sélectionnez Diviser, et pour Image2 , sélectionnez le résultat de la somme de FAD et NAD(P)H, puis cliquez sur OK.
  6. Pour appliquer une palette de couleurs à l’image ORR, sélectionnez Image > Couleur > Modifier la LUT..., cliquez sur Ouvrir, sélectionnez le fichier de table de recherche (.lut) souhaité et cliquez sur OK. Sélectionnez Image > Ajuster > luminosité/contraste et ajustez le contraste comme vous le souhaitez.
    REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser une palette de couleurs isoluminante telle que la carte de couleurs CET-I2 54,55 (inversée) utilisée dans cette étude. Pour inverser une palette de couleurs dans ImageJ après l’avoir appliquée à une image, sélectionnez Image > Couleur > Inverser les LUTs.
  7. Pour améliorer la clarté des caractéristiques de l’image ORR, mettez la luminosité à l’échelle en fonction de l’intensité des canaux de fluorescence. Tout d’abord, sélectionnez le résultat de la somme de FAD et NAD(P)H et sélectionnez Traiter > Améliorer le contraste..., assurez-vous que Normaliser est coché, puis cliquez sur OK. Sélectionnez Modifier > Copier pour copier ce résultat dans le presse-papiers. Ensuite, sélectionnez l’image ORR et sélectionnez Type de > d’image > Couleur RVB », puis sélectionnez Type de > d’image > TSL (32 bits). Déplacez le curseur en bas de l’image complètement vers la droite pour afficher le canal Luminosité , sélectionnez Modifier > Coller, puis sélectionnez Type de > d’image > Couleur RVB.
  8. Pour visualiser l’image SLAM en tant que composite, ouvrez les quatre canaux SLAM dans ImageJ et sélectionnez : Image > Couleur > Fusionner les canaux... Pour C2 (vert), sélectionnez l’image du canal SHG, pour C5 (cyan), sélectionnez l’image du canal NAD(P)H, pour C6 (magenta), sélectionnez l’image du canal THG et pour C7 (jaune), sélectionnez l’image du canal FAD. Assurez-vous que l’option Créer un composite est cochée et cliquez sur OK.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’approche multicanal et multimodale complexe du microscope SLAM (Figure 1) peut rendre difficile pour les nouveaux utilisateurs de résoudre les problèmes et de comprendre les résultats. Tout d’abord, un PCF bien clivé présente une face propre (figure 2C) avec une surface plane perpendiculaire à la longueur du PCF (figure 2A). Une face de clivage inclinée et ébréchée (figure 2B) et la présence d’égratig...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La génération d’un supercontinuum approprié est cruciale pour une imagerie SLAM réussie, mais elle peut s’avérer difficile en raison de la complexité de la configuration du PCF. Il est essentiel d’assurer un clivage précis et une manipulation soigneuse du PCF pour maintenir des surfaces propres, exemptes de débris, de saleté ou d’égratignures, qui peuvent tous interférer avec le couplage efficace, la génération de supercontinuum et même raccourcir la durée de vie du PCF. Étant donné que ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le financement de l’équipement utilisé dans cette étude a été fourni en partie par GSK par l’intermédiaire du Center for Optical Molecular Imaging de l’Institut Beckman pour les sciences et technologies avancées. Ce travail a également été soutenu en partie par le NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics (CLIMB) (P41EB031772) et le NSF Science and Technology Center for Quantitative Cell Biology. K.K.D.T a été soutenu par le programme de formation en recherche du NIEHS en toxicologie et en santé environnementale (5T32ES007326-25), A.D.C a été soutenu par le programme de bourses postdoctorales de l’Institut Beckman pour les sciences et technologies avancées, et A.H. a été soutenu par le programme de formation en microenvironnement tissulaire du NIBIB (T32EB019944). Les auteurs remercient Darold Spillman pour sa gestion des espaces de laboratoire, de l’équipement et de la technologie et remercient les Drs Janet E. Sorrells et Rishyashring R. Iyer pour leurs contributions passées au système de microscope SLAM utilisé dans cette étude.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Platine 3 axesThorLabsMAX316Abandonné.
Boîte d’imagerie à fond en verre de 35 mmMatTekP35G-0-14-CVerre de protection #0 non traité.
DMEMGibco21063029Glycémie élevée, HEPES, pas de rouge de phénol.
Suppléments de milieu de croissance des cellules endothélialesPromoCellRéf. C-39210Omettre le sérum de veau fœtal.
Laser femtoseconde FemtoTrainSpectra-Physique1040-5Puissance moyenne : >5,0 W, Énergie d’impulsion : >500 nJ, Longueur d’onde : 1040 nm ± ; 8 nm, taux de répétition : 10 MHz, largeur d’impulsion (FWHM) : < 220 fs.
Sérum fœtal bovinCytivaSH30071.03Caractérisation de HyClone.
Décapant de fibresThorLabsT10S13
Flavine adénine dinucléotide sel disodique hydrateSigma-AldrichRéf. F6625
Miroirs galvanomètresTechnologie Cambridge6215HAbandonné.
Poste de travail pour l’usinage du verreVytranGPX3800
ImageJLaboratoire Eliceiri à l’Université du Wisconsin à MadisonVersion 2.16.0FIJI Distribution.
Papier de soie KimwipeKimberly-Clark Professionnelle34120
L-GlutamineCytivaSH30034.01
Platine de microscopeInstrumentation scientifique appliquéeFTP-2050
Contrôleur de platine de microscopeInstrumentation scientifique appliquéeMS-2000-500-UDSW
Autocorrélateur de microscopieAngewandte Physik und Elektronik GmbHCarpe
Lentille d’objectifOlympeXLPLN25XWMP2Immersion dans l’eau, grossissement 25X, 1,05 NA.
Wattmètre optiqueNewportRéférence 919P-003-10600 à 1700 milles marins.
Analyseur de spectre optiqueThorLabsOSA202C
Fibre cristalline photoniquePhotonique NKTLMA-PM-15 NKTGrande zone de mode, maintien de la polarisation. Diamètre du noyau : 15 & micro ;m.
Couperet à fibre optique de précisionFujikuraCT-101
Façonneur d’impulsionsSolutions Biophotonique Inc.FemtoJock-DAbandonné.
&bêta ;-Nicotinamide adénine dinucléotide, hydrate de sel disodique réduitSigma-Aldrich10128023001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyd, R. W. Nonlinear optics. , Academic Press. Amsterdam. (2008).
  2. Potma, E. O. Foundations of nonlinear optical microscopy. , John Wiley and Sons. (2024).
  3. Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1999).
  4. Boppart, S. A., You, S., Li, L., Chen, J., Tu, H. Simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy and beyond. APL Photonics. 4 (10), 100901(2019).
  5. Sun, Y., et al. Real-time three-dimensional histology-like imaging by label-free nonlinear optical microscopy. Quant Imaging Med Surg. 10 (11), 2177-2190 (2020).
  6. Yang, L., et al. Intraoperative label-free multimodal nonlinear optical imaging for point-of-procedure cancer diagnostics. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 27 (4), 6801412(2021).
  7. Talone, B., et al. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals features of bone composition in pathophysiological conditions. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1042680(2022).
  8. Liu, H. S., Jan, M. S., Chou, C. K., Chen, P. H., Ke, N. J. Is green fluorescent protein toxic to the living cells. Biochem Biophys Res Commun. 260 (3), 712-717 (1999).
  9. Tsoi, K. M., Dai, Q., Alman, B. A., Chan, W. C. W. Are quantum dots toxic? Exploring the discrepancy between cell culture and animal studies. Acc Chem Res. 46 (3), 662-671 (2013).
  10. Alford, R., et al. Toxicity of organic fluorophores used in molecular imaging: Literature review. Mol Imaging. 8 (6), (2009).
  11. Macheroux, P., Kappes, B., Ealick, S. E. Flavogenomics - a genomic and structural view of flavin-dependent proteins. FEBS J. 278 (15), 2625-2634 (2011).
  12. Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Top Fluoresc Spectrosc. 5, 471-540 (2002).
  13. Ranjit, S., et al. Imaging fibrosis and separating collagens using second harmonic generation and phasor approach to fluorescence lifetime imaging. Sci Rep. 5 (1), 13378(2015).
  14. Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
  15. Cox, G. Biological applications of second harmonic imaging. Biophys Rev. 3 (3), 131(2011).
  16. Aghigh, A., Bancelin, S., Rivard, M., Pinsard, M., Ibrahim, H., Légaré, F. Second harmonic generation microscopy: A powerful tool for bio-imaging. Biophys Rev. 15 (1), 43-70 (2023).
  17. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
  18. Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt Express. 5 (8), 169-175 (1999).
  19. Oron, D., et al. Depth-resolved structural imaging by third-harmonic generation microscopy. J Struct Biol. 147 (1), 3-11 (2004).
  20. Débarre, D., et al. Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy. Nat Methods. 3 (1), 47-53 (2006).
  21. Tu, H., et al. Stain-free histopathology by programmable supercontinuum pulses. Nat Photonics. 10 (8), 534-540 (2016).
  22. You, S., et al. Label-free visualization and characterization of extracellular vesicles in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (48), 24012-24018 (2019).
  23. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  24. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  25. Masihzadeh, O., et al. Third harmonic generation microscopy of a mouse retina. Mol Vis. 21, 538-547 (2015).
  26. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  27. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: Why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
  28. Maiti, S., Shear, J. B., Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Measuring serotonin distribution in live cells with three-photon excitation. Science. 275 (5299), 530-532 (1997).
  29. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nat Commun. 11 (1), 5120(2020).
  30. Campagnola, P. J., Dong, C. Y. Second harmonic generation microscopy: Principles and applications to disease diagnosis. Laser Photonics Rev. 5 (1), 13-26 (2011).
  31. Pavone, F. S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging. , CRC Press. Boca Raton. (2016).
  32. Witte, S., et al. Label-free live brain imaging and targeted patching with third-harmonic generation microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 5970-5975 (2011).
  33. Weigelin, B., Bakker, G. J., Friedl, P. Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics. Intravital. 1 (1), 32-43 (2012).
  34. Carriles, R., et al. Imaging techniques for harmonic and multiphoton absorption fluorescence microscopy. Rev Sci Instrum. 80 (8), 081101(2009).
  35. Graf, B. W., Jiang, Z., Tu, H., Boppart, S. A. Dual-spectrum laser source based on fiber continuum generation for integrated optical coherence and multiphoton microscopy. J Biomed Opt. 14 (3), 034019(2009).
  36. Graf, B. W., et al. In vivo multimodal microscopy for detecting bone-marrow-derived cell contribution to skin regeneration. J Biophotonics. 7 (1-2), 96-102 (2014).
  37. Liu, Y., Tu, H., Benalcazar, W. A., Chaney, E. J., Boppart, S. A. Multimodal nonlinear microscopy by shaping a fiber supercontinuum from 900 to 1160 nm. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 18 (3), (2012).
  38. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nat Commun. 9 (1), 2125(2018).
  39. You, S., Chaney, E. J., Tu, H., Sun, Y., Sinha, S., Boppart, S. A. Label-free deep profiling of the tumor microenvironment. Cancer Res. 81 (9), 2534-2544 (2021).
  40. Cadena, A. D. L., Park, J., Tehrani, K. F., Renteria, C. A., Monroy, G. L., Boppart, S. A. Simultaneous label-free autofluorescence multi-harmonic microscopy driven by the supercontinuum generated from a bulk nonlinear crystal. Biomed Opt Express. 15 (2), 491-505 (2024).
  41. Lee, J. H., et al. Simultaneous label-free autofluorescence and multi-harmonic imaging reveals in vivo structural and metabolic changes in murine skin. Biomed Opt Express. 10 (10), 5431-5444 (2019).
  42. Shi, J., et al. Accelerating biopharmaceutical cell line selection with label-free multimodal nonlinear optical microscopy and machine learning. Commun Biol. 8 (1), 157(2025).
  43. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  44. Alhallak, K., Rebello, L. G., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N. Optical redox ratio identifies metastatic potential-dependent changes in breast cancer cell metabolism. Biomed Opt Express. 7 (11), 4364-4374 (2016).
  45. Ostrander, J. H., et al. Optical redox ratio differentiates breast cancer cell lines based on estrogen receptor status. Cancer Res. 70 (11), (2010).
  46. Cadena, A. D. L., Renteria, C. A., Aksamitiene, E., Boppart, S. A. Label-free hyperspectral multiphoton microscopy. Opt Lett. 50 (5), 1484-1487 (2025).
  47. Agrawal, G. Nonlinear fiber optics. , 5th ed, Academic Press. 553-612 (2013).
  48. Trebino, R., et al. Measuring ultrashort laser pulses in the time-frequency domain using frequency-resolved optical gating. Rev Sci Instrum. 68 (9), 3277-3295 (1997).
  49. Stewart, K., Schroeder, V. A. Diagnostic necropsy and tissue harvest in rodents. J Vis Exp. , e10294(2020).
  50. Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney Int. 65 (6), 2223-2227 (2004).
  51. Huttunen, M. J., et al. Multiphoton microscopy of the dermoepidermal junction and automated identification of dysplastic tissues with deep learning. Biomed Opt Express. 11 (1), 186-199 (2020).
  52. Fung, A. A., et al. Label-free multimodal optical biopsy reveals biomolecular and morphological features of diabetic kidney tissue in 2D and 3D. Nat Commun. 16 (1), 4509(2025).
  53. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  54. Kovesi, P. Good colour maps: How to design them. arXiv. , (2015).
  55. Kovesi, P. ColorCET perceptually uniform colour maps. , https://colorcet.com (2025).
  56. Tian, Z., Liang, M. Renal metabolism and hypertension. Nat Commun. 12 (1), 963(2021).
  57. Wang, G., Shi, J., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Tu, H. Fiber-optic nonlinear wavelength converter for adaptive femtosecond biophotonics. arXiv. , (2024).
  58. Lozovoy, V. V., Pastirk, I., Dantus, M. Multiphoton intrapulse interference. IV. Ultrashort laser pulse spectral phase characterization and compensation. Opt Lett. 29 (7), 775-777 (2004).
  59. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem. 58 (4), (2014).
  60. Theodossiou, A., et al. Autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism. J Vis Exp. (177), e63282(2021).
  61. Yang, L., et al. Label-free multimodal polarization-sensitive optical microscope for multiparametric quantitative characterization of collagen. Optica. 11 (2), 155-165 (2024).
  62. Smith, H. E., et al. The use of NADH anisotropy to investigate mitochondrial cristae alignment. Sci Rep. 14 (1), 5980(2024).
  63. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (4), (2011).
  64. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr Protoc Cytom. 61 (1), 9.39.1-9.39.18 (2012).
  65. Sorrells, J. E., et al. Label-free nonlinear optical signatures of extracellular vesicles in liquid and tissue biopsies of human breast cancer. Sci Rep. 14 (1), 5528(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Label Free MicroscopyNonlinear Optical MicroscopyMultiphoton MicroscopyHarmonic GenerationAutofluorescence ImagingPhotonic Crystal FiberPulse CompressionTissue ImagingMetabolic ImagingRedox Ratio

Related Articles