Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Génération de mutants maternels à l’aide du poisson-zèbre knock-in zpc :cas9

1.1K vues

⸱

DOI :

10.3791/68642

⸱

22 juillet 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Cell and Developmental Biology, School of Life Sciences Qilu Hospital (Qingdao), Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), UMR CNRS 8263, INSERM U1345, Development, Adaptation and Ageing, Sorbonne Université, 3College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, 4Key Laboratory for Experimental Teratology of the Ministry of Education, Shandong University, 5State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, 6Shandong University-Yuanchen Joint Biomedical Technology Laboratory

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole de génération de mutant maternel qui couple une ligne d’entraînement stable zpc :cas9 avec l’administration médiée par Tol2 de cassettes d’expression d’ARNsg.

Résumé

L’ovogenèse et le développement embryonnaire précoce dépendent de manière critique des ARNm et des protéines d’origine maternelle. L’élimination de ces facteurs maternels nécessite des mutations homozygotes chez les poissons-zèbres femelles, entraînant souvent des phénotypes létaux ou infertiles, qui empêchent l’acquisition d’embryons mutants maternels. Nos travaux précédents ont introduit une approche rapide pour contourner la létalité zygotique par l’édition du génome spécifique aux ovocytes. Cependant, le transgène cas9 précédemment signalé présente une instabilité et subit un silence progressif au fil des générations. De plus, la présence d’éléments transposables Tol2 flanquant la cassette zpc :cas9 dans cette ligne entrave le potentiel de transgenèse ultérieure de l’ARNsg à l’aide du système Tol2, qui est actuellement le système transgénique le plus efficace chez le poisson zèbre. Par conséquent, il existe un besoin critique d’une lignée de poisson-zèbre sans Tol2 qui assure une expression stable et robuste de Cas9 spécifique aux ovocytes. Ici, nous présentons une ligne avec zpccas9 knock-in au locus rbm24a qui répond à cette exigence. À l’aide de cet outil amélioré, nous fournissons un pipeline pour la génération rapide de mutants maternels de gènes avec des phénotypes mutants zygotement létaux dans le modèle du poisson zèbre.

Introduction

Le développement embryonnaire précoce des vertébrés dépend fortement de l’ARN et des protéines stockés dans l’œuf, collectivement appelés facteurs maternels. Ces produits maternels sont principalement synthétisés au cours du stade diplotène de la méiose I 1,2,3. Pour étudier leurs rôles fonctionnels, il est essentiel de générer des individus femelles mutants homozygotes, car seule une mutation homozygote dans les ovocytes peut épuiser complètement ces facteurs maternels. Cependant, l’obtention de telles femelles mutantes homozygotes devient difficile lorsque les mutations homozygotes zygotes entraînent une létalité ou une stérilité 4,5. Cela constitue un obstacle important à l’élucidation des fonctions des produits maternels codés par des gènes zygotiques, létaux ou stériles. Pour pallier cette limitation technique, plusieurs approches innovantes ont été développées 6,7,8. Néanmoins, ces techniques souffrent souvent de délais expérimentaux prolongés ou de défis techniques importants.

Dans nos travaux précédents, nous avons également développé une stratégie d’élimination conditionnelle qui permet de générer des mutants maternels au sein d’une seule génération 9,10. Le système comprend deux composants clés : le poisson-zèbre transgénique Tg(zpczcas9) et un système plasmidique transgénique I-SceI hébergeant 3 à 4 cassettes d’expression d’ARNsg. En s’appuyant sur ce système, nous avons réussi à obtenir l’inactivation conditionnelle des facteurs maternels dans les ovocytes 9,10, mais il y a encore place à l’amélioration. Tout d’abord, l’efficacité de l’édition du génome de la lignée transgénique Tg(zpczcas9) précédemment rapportée n’était pas stable dans le maintien de l’expression transgénique de Cas9. De plus, puisque cette lignée transgénique a été générée à l’aide du système de transposon Tol2, la transposition de Tol2 ne peut pas être utilisée pour l’intégration de la cassette d’expression de l’ARNsg ; au lieu de cela, une transgenèse médiée par I-SceI est requise. Cependant, cette approche est moins efficace que Tol2 et est également plus sensible au silence transgénérationnel.

Pour surmonter ces limitations, nous avons cherché à établir une ligne d’injection permettant une expression robuste et stable de Cas9 spécifique aux ovocytes. Cette lignée permet l’utilisation du système de transposon Tol2 pour l’administration très efficace de plasmides d’expression d’ARNsg chez le poisson zèbre. En utilisant une stratégie d’édition du génome basée sur les introns11, nous avons réussi à générer une ligne d’insertion zpccas9 avec le site intégré dans le dernier intron du gène rbm24a (Figure 1A,B). Nous avons choisi ce locus comme refuge génomique candidat pour l’expression du transgène maternel sur la base de deux observations indépendantes. 1) Intégration inoffensive : dans notre étude récente12, les poissons homozygotes porteurs d’ADN exogène sur ce site sont restés pleinement viables et fertiles. 2) Expression robuste : lorsqu’une cassette zpccas9 a été insérée au même locus, Cas9 a été exprimé à des niveaux élevés, ce qui a permis d’obtenir une efficacité d’édition du génome constamment forte d’une génération à l’autre (Figure 1C). En tant que composant central du plasma germinal, la protéine de liaison à l’ARN Rbm24a s’associe à Buc pour incorporer les ARN du plasma germinatif dans les granules germinaux. Par conséquent, le déficit maternel en Rbm24a entraîne une absence totale de cellules germinales primordiales (PGC)12. Ici, en ciblant rbm24a comme exemple dans nos travaux récents, nous fournissons un protocole vidéo amélioré pour générer et caractériser des mutants maternels pour les gènes létaux zygotiques.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Les expériences ont été menées conformément aux directives d’ARRIVE et ont été approuvées éthiquement par le comité institutionnel de protection des animaux de l’Université du Shandong (approbation n° 100). SYDWLL-2021-15). La figure 2 présente la vue d’ensemble de ce protocole.

1. Génération de la ligne de knock-in rbm24a-RFP zpc :cas9

  1. Criblage de l’ARNsg pour knock-in
    1. Sélectionner et synthétiser des candidats à ARNsg knock-in
      1. Soumettez la séquence du dernier intron de rbm24a à CRISPRscan (http://www.crisprscan.org) pour identifier les candidats sgRNA optimaux présentant à la fois des scores CRISPRscan élevés (indiquant l’efficacité sur cible) et des scores CFD faibles (reflétant des effets hors cible). Synthétisez l’oligo long pour chaque ARNsg (oligo d’ARNsg).
        REMARQUE : CRISPRscan génère des oligonucléotides d’ARNsg contenant des éléments fonctionnels essentiels, notamment la séquence promotrice T7, la séquence cible de l’ARNsg à 20 nucléotides et une séquence d’échafaudage d’ARNsg à 16 nucléotides. Ici, nous avons sélectionné un ARNsg avec la séquence suivante : 5'-taatacgactcactataGGGCTGCTGTCATGTTGG
        GTgttttagagctagaa-3′ (promoteur T7 minuscule, guide 20-nt majuscule, minuscule échafaudage partiel).
      2. Pour obtenir la matrice d’ADN pour la synthèse de l’ARNsg, préparez 50 μL de réaction PCR de remplissage : 2x Taq Master mix 25 μL ; amorce d’ARNsg (10 μM) 2 μL ; Amorce universelle (10 μM) 2 μL ; H2O 21 μL désionisé.
        REMARQUE : Les séquences de toutes les amorces sont indiquées dans le tableau des matériaux.
      3. Bien mélanger et transférer le mélange réactionnel dans un thermocycleur préprogrammé et lancer le protocole d’amplification à l’aide des paramètres de cyclage suivants : 1 cycle à 94 °C pendant 3 min, 35 cycles (94 °C pendant 15 s, 50 °C pendant 15 s, 72 °C pendant 30 s) et 1 cycle à 72 °C pendant 5 min.
      4. Préparez le mélange réactionnel pour la synthèse de l’ARNsg dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL ; combiner tous les composants à température ambiante dans l’ordre suivant : 11 μL d’eau distillée, 2 μL d’ATP/GTP/CTP/UTP (10 mM chacun), 10 μL de produit PCR, 4 μL de tampon de réaction 10x ARN polymérase, 2 μL d’ARN polymérase T7 et 1 μL d’inhibiteur de RNase. Le volume total de réaction est de 40 μL. Mélangez soigneusement par effleurement et effectuez une brève centrifugation.
      5. Incuber à 37 °C pendant 1,5 h. Ajouter 1 μL de DNase I, mélanger en effleurant et centrifuger brièvement. Incuber à 37 °C pendant 15 min pour assurer le retrait complet de la matrice d’ADN.
      6. Ajouter 5 μL de billes magnétiques de silice, puis 120 μL (4 fois le volume) de tampon de liaison à l’ARN (Gu-HCl 1 M 9,55 g, Tween-20 0,05 %, éthanol 100 mL). Bien mélanger par pipetage. Incuber sur un thermomixeur à 1 500 tr/min pendant 10 min à température ambiante.
      7. Placez le tube sur un support magnétique et retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette ou d’un système de vide.
      8. Ajouter 400 μL d’éthanol à 90 % et vortex pour remettre les billes en suspension. Placez le tube sur le support magnétique et jetez le surnageant.
      9. Répétez les étapes de lavage à l’éthanol pour effectuer un total de deux cycles de lavage.
      10. Retirez le surnageant résiduel et faites sécher à l’air libre le tube ouvert sur un bloc chauffant à 50 °C pendant 10 min.
      11. Ajouter 15 μL d’eau sans nucléases et incuber sur un thermomélangeur à 1 500 tr/min pendant 5 min à température ambiante.
      12. Placez le tube sur le support magnétique et transférez l’éluat dans un nouveau tube de microcentrifugation.
      13. Confirmer la bande d’ARNsg de 98 pb par électrophorèse à agarose. Quantifier la concentration d’ARN par micro-spectrophotomètre et électrophorèse d’agarose, étiqueter clairement et stocker à -20 °C.
    2. Tester l’efficacité de l’ARNsg
      1. Pour déterminer l’efficacité réelle des ARNsg, préparez le complexe ribonucléoprotéique (RNP) pour la micro-injection. Mélangez 1 μL de chaque ARNsg (concentration finale de 50 ng/μL) avec 1 μL de protéine Cas9 (concentration finale de 100 ng/μL) sur de la glace par pipetage. Administrer 2 nL du complexe RNP dans chaque embryon au stade d’une cellule par microinjection.
      2. 24 h après la fécondation (hpf), prélever 10 embryons pour chaque RNP Cas9 injecté dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, et retirer soigneusement l’excès de milieu. Ajouter 100 μL de 50 mM de NaOH (10 μL par embryon) et incuber à 95 °C pendant 15 min à l’aide d’un bloc chauffant ou d’un thermocycleur. Neutralisez le lysat en ajoutant 10 μL de 1 M de Tris-HCl (pH 7,0).
      3. Utilisez le lysat d’embryon neutralisé directement comme modèle pour l’amplification par PCR. Concevez des amorces pour amplifier un fragment contenant le site cible avec des séquences flanquantes de ≥100 pb des deux côtés. Vérifier les produits PCR par électrophorèse sur gel d’agarose et les purifier par extraction sur gel si nécessaire. Effectuez le séquençage de Sanger des produits amplifiés.
      4. Quantification de l’efficacité de l’édition CRISPR : analysez les chromatogrammes de séquençage à l’aide de l’outil d’analyse ICE (Inference of CRISPR Edits) (https://ice.synthego.com/#/). Normalisez l’efficacité de l’édition par rapport aux échantillons de contrôle non injectés suivant les protocoles recommandés par le site Web.
  2. Construction d’un plasmide donneur pour knock-in
    1. Utilisez la méthodologie TEDA (T5 exonucléase DNA assembly) pour effectuer la réaction de ligature13.
    2. Utiliser une stratégie d’assemblage Gibson à trois fragments pour la construction du plasmide donneur knock-in rbm24a-RFP KIzpc :cas9 . Le premier fragment comprend un bras d’homologie 5' de 1 704 pb englobant la région génomique immédiatement en amont du codon stop rbm24a . La seconde est la séquence de codage GFP. Le troisième contient un bras d’homologie 3' de 2 274 pb en aval du codon stop rbm24a , suivi de la cassette d’expression zpccas9 positionnée dans la direction 3' distale par rapport au rbm24a 3'-UTR.
    3. Assemblez les trois fragments dans le site ApaI du vecteur SK- de pBluescript à l’aide de l’assemblage Gibson.
    4. Vérifiez le plasmide final par digestion par restriction et séquençage de Sanger.
  3. Micro-injection et sélection d’embryons avec intégration précoce
    1. Préparez le mélange injectable contenant 12 pg de plasmide donneur knock-in rbm24a-RFP KIzpc :cas9 , 200 pg d’ARNsg et 600 ng de protéine Cas9 recombinante dans de l’eau sans nucléases. Administrer 1 à 2 nL du mélange dans le blastodisque d’embryons au stade unicellulaire en utilisant des techniques de micro-injection standard. À 30 hpf, dépister les embryons pour les modèles d’expression RFP qui imitent l’expression endogène de rbm24a, ce qui indique l’intégration du plasmide du donneur dès le stade de clivage. Sélectionnez ces embryons avec une intégration précoce pour la reproduction, qui a montré un signal RFP dans le cristallin, le cœur, le muscle squelettique et les cellules ciliées de l’oreille interne (Figure 3A, B).
      REMARQUE : Purifier le plasmide par extraction au phénol-chloroforme avant l’injection afin d’éliminer toute RNase résiduelle introduite lors de la préparation du plasmide.
    2. Analyser les profils d’expression de Rbm24a-RFP maternel dans des embryons de génération F1 dérivés de croisements de rbm24a-RFP KIzpc :cas9 (Figure 4A,B).
  4. Évaluation de l’expression de la protéine Cas9 et de l’efficacité d’édition
    1. Pour évaluer l’efficacité de l’édition de Cas9, micro-injectez 200 pg d’ARNsg bmp2b dans des embryons rbm24a-RFP KIzpc :cas9 à 1 cellule (Figure 1C,D).
    2. Pour évaluer la stabilité de l’édition Cas9, quantifiez le nombre d’embryons présentant des phénotypes de dorsalisation et effectuez une analyse de séquençage de Sanger pour évaluer l’efficacité de l’édition (Figure 5A-D).
      REMARQUE : Bien que nous n’ayons détecté aucune réduction de l’expression de Cas9 sur trois générations, nous vous recommandons tout de même de vérifier l’efficacité de l’édition dans chaque génération de cette ligne d’intégration.

2. Transgenèse de l’ARNsg dans la lignée rbm24a-RFP KI zpc cas9

  1. Sélectionner et synthétiser des ARNsg pour l’inactivation de rbm24a .
    1. Sélectionner et synthétiser les candidats ARNsg comme décrit à l’étape 1.1.1.
      REMARQUE : Il est crucial de sélectionner des ARNsg qui ciblent la moitié antérieure de la région codante pour assurer une perte de fonction très efficace. De plus, si des domaines protéiques critiques sont identifiés dans la région C-terminale, les ARNsg ciblant l’extrémité 3' de la séquence codante sont également acceptables. CRISPRscan génère des oligonucléotides d’ARNsg contenant des éléments fonctionnels essentiels, notamment la séquence promotrice T7, la séquence cible de 20 nucléotides d’ARNsg et une séquence d’échafaudage d’ARNsg de 16 nucléotides. Pour obtenir un knock-out efficace du gène maternel, il est conseillé de concevoir 6 à 8 candidats pour identifier de manière fiable 3 à 4 ARNsg très efficaces. Un protocole détaillé peut être trouvé dans un document précédent9.
    2. Testez l’efficacité de l’ARNsg dans l’embryon précoce de poisson-zèbre comme décrit à l’étape 1.1.2.
      REMARQUE : les sgRNA ayant une efficacité d’édition supérieure à 50 % sont préférés.
  2. Construction d’un plasmide transgénique exprimant un ARNsg
    REMARQUE : Pour maximiser l’efficacité de l’édition, nous vous recommandons d’utiliser quatre ARNsg distincts et non chevauchants, chacun séparé d’au moins 36 pb. Ces ARNsg sont ligaturés individuellement en vecteurs pU6x :sgRNA (pU6x :sgRNA #1, #2, #3, #4), chacun hébergeant un promoteur U6 unique avec l’échafaudage 3'14. Par la suite, ces quatre vecteurs U6, contenant chacun une cassette d’expression d’ARNsg, sont assemblés dans le vecteur de destination pGGDestISceIEB-4sgRNA via la ligature Golden Gate.
    Les vecteurs pU6x :sgRNA doivent être sélectionnés séquentiellement. Par exemple, si vous clonez trois ARNsg, utilisez les vecteurs #1 à #3 ; si vous clonez quatre ARNsg, utilisez les vecteurs #1 à #4.
    1. Sous-clonage de la séquence cible de l’ARNsg en vecteurs pU6x :ARNsg
      1. Selon la séquence de l’ARNsg sélectionné, synthétiser les amorces de recuit : Amorce directe : TTCGN(19) ; Amorce inversée : AAAC[N(19)]*. Où GN(19) est la séquence cible de 20 nt de l’ARNsg. [N(19)]* représente la séquence inverse du complément des 19 nt de la cible de l’ARNsg dans la direction 3'.
      2. Pour recuire les amorces, préparez le mélange comme suit : 1 μL d’amorce directe (100 μM), 1 μL d’amorce inverse (100 μM), 2 μL de tampon 10x et 16 μL de H2O désionisé pour atteindre un volume total de 20 μL. Mélangez soigneusement.
        REMARQUE : Les séquences de toutes les amorces ont été indiquées dans la table des matériaux.
      3. Placez le mélange dans un thermocycleur et exécutez le programme comme suit : 1 cycle à 95 °C pendant 15 min, puis refroidir progressivement à 50 °C à une vitesse de rampe contrôlée de 0,1 °C/s, et maintenir cette température pendant 10 min ; maintenir à 4 °C pendant 10 min.
      4. Préparez le mélange réactionnel pour le clonage de la séquence cible de l’ARNsg recuite dans des vecteurs d’ARNsg pU6x, comme indiqué : 1 μL de tampon d’enzyme de restriction 10x, 1 μL de tampon 10x T4 ligase, 0,3 μL de T4 ligase, 0,3 μL de BsmBI, 0,2 μL de PstI, 0,2 μL de SalI, 1 μL d’amorce d’ARNg recuite, 5 μL de pU6x :sgRNA#x (20 ng/μL), et 1 μL de H2O désionisé, en ajustant le volume de réaction final à 10 μL.
      5. Mélangez soigneusement les composants de la réaction et exécutez le programme de thermocycleur suivant : 6 cycles (37 °C pendant 20 min, 16 °C pendant 15 min), 1 cycle à 37 °C pendant 10 min, 1 cycle à 55 °C pendant 15 min, 1 cycle à 80 °C pendant 15 min.
      6. Pour la transformation, décongelez les cellules compétentes DH5α sur de la glace, mélangez doucement 50 μL des cellules avec le mélange de ligature en agitant le tube et incubez le mélange sur de la glace pendant 30 min. Effectuez un choc thermique à 42 °C pendant 60 s, puis transférez immédiatement le tube dans la glace pendant 2 min. Étalez les cellules transformées sur une plaque LB contenant 100 μg/mL de spectinomycine et incubez la plaque à l’envers à 37 °C pendant au moins 16 h pour permettre la formation de la colonie.
      7. Pour la PCR de colonie, prélever chaque colonie bactérienne à l’aide d’une pointe de pipette et la transférer dans 10 μL de H2O désionisé. Préparez le mélange réactionnel PCR en combinant 5 μL de 2x Taq Mix, 2 μL de liquide de colonie, 0,4 μL d’amorce directe M13 (10 μM) et d’amorce inverse (10 μM), et 2,2 μL de H2O désionisé, ce qui donne un volume de réaction total de 10 μL.
      8. Exécutez le programme comme indiqué ci-dessous : 1 cycle à 94 °C pendant 3 min, 23 cycles (94 °C pendant 15 s, 55 °C pendant 15 s, 72 °C pendant 30 s) et 1 cycle à 72 °C pendant 5 min.
      9. Soumettre les produits PCR à l’électrophorèse. Sélectionnez la colonie positive avec la taille attendue de 482 pb (Figure 6).
      10. Inoculer le reste du liquide de colonie dans 3 mL de milieu LB complété par 100 μg/mL de spectinomycine. Incuber à 37 °C en secouant à 200 tr/min pendant 14 h.
      11. Extrayez les plasmides de la culture bactérienne à l’aide du kit Plasmid Miniprep selon les instructions du fabricant. Mesurez la concentration plasmidique à l’aide d’un microspectrophotomètre.
      12. Soumettez les plasmides extraits au séquençage de Sanger à l’aide de l’amorce directe M13. Alignez les résultats du séquençage sur la carte vectorielle U6 attendue pour vérifier l’insertion correcte de la cible de l’ARNsg.
    2. Assemblage du vecteur pGGDestEB-4sgRNA
      REMARQUE : Comme illustré à la figure 7, quatre cassettes d’expression d’ARNsg pilotées par U6 peuvent être efficacement ligaturées dans le vecteur squelette pGGDestEB-4sgRNA à l’aide de l’assemblage Golden Gate. Le nombre d’ARNsg à ligaturer détermine l’utilisation des vecteurs. Par exemple, lors de l’assemblage de quatre cassettes d’ARNsg, utilisez pU6a :sgRNA#1, pU6a :sgRNA#2, pU6b :sgRNA#3, pU6c :sgRNA#4 et pGGDestEB-4sgRNA.
      1. Préparez les 20 μL de mélange réactionnel Golden Gate contenant : 2 μL de tampon enzymatique de restriction 10×, 2 μL de tampon d’ADN ligase 10x T4, 100 ng de chaque construction pU6x :sgRNA#x, 50 ng de vecteur de destination pGGDestIEB-4sgRNA, 1 μL de BsaI, 1 μL d’ADN ligase T4 et de l’eau déminéralisée pour ajuster le volume final à 20 μL.
      2. Exécutez la réaction d’assemblage du Golden Gate à travers 3 cycles de 20 min à 37 °C suivis de 15 min à 16 °C, puis complétez avec une incubation finale de 15 min à 80 °C pour l’inactivation de l’enzyme.
      3. Pour transformer, transférez 5 μL du mélange réactionnel dans des cellules et une plaque compétentes sur un milieu LB supplémenté en ampicilline.
      4. Effectuer la PCR des colonies en criblant les colonies à l’aide d’amorces Dest forward et Reverse (voir la Table des matériaux) pour confirmer la présence de l’insert (figure 8).
        REMARQUE : La bande principale de 2 415 pb et un modèle d’échelle doivent être présents pour un clone positif.
      5. Extrayez les plasmides des colonies et des séquences positives à l’aide des amorces Dest forward et Reverse pour chaque cible d’ARNsg.
      6. Alignez les résultats du séquençage de Sanger sur la séquence vectorielle prédite pour vérification.
  3. Microinjection et présélection de fondateurs transgéniques
    1. Collecter des embryons engendrés par des poissons homozygotes rbm24a-RFP KIzpc :cas9 .
    2. Préparez le mélange d’injection en combinant 1 μL d’ARNp pGGDestEB-rbm24a-4sg (12 ng/μL) avec 1 μL d’ARNm de la transposase Tol2 (50 ng/μL).
      REMARQUE : Purifier le plasmide à l’aide de l’extraction au phénol-chloroforme avant l’injection afin d’éliminer toute RNase résiduelle qui aurait pu être introduite pendant le processus d’extraction du plasmide. Le plasmide et l’ARNm de Tol2 ont été dilués directement dans de l’eau pure.
    3. Placez une lamelle en verre dans un plat de 15 cm. Alignez les embryons le long du bord de la lamelle et retirez soigneusement l’excès d’eau à l’aide d’une pipette. Injectez 2 nL du mélange dans le blastodisque de chaque embryon au stade 1 cellule. Après l’injection, rincez doucement les embryons à l’eau bleue et transférez-les dans un plat frais. Enfin, placez le plat dans un incubateur à 28 °C pour la culture.
      REMARQUE : Préparez la solution de travail du bleu de méthylène (eau bleue) comme suit : Dissoudre 180 g de sel de mer dans 2,7 L d’eau distillée et stériliser pour obtenir 100 fois plus de bouillon d’eau de mer. Diluez ce bouillon 200 fois avec de l’eau distillée stérile pour obtenir de l’eau de mer 1/100x. Ajouter 10 μL de solution mère de bleu de méthylène à 5 % (m/v) à 1 L de cette eau de mer 1/100x pour préparer la solution de travail finale.
    4. À 24 hpf, sélectionner les embryons présentant une expression BFP robuste et ubiquitaire. À 4 dpf, ne remontez que ceux qui maintiennent de forts signaux fluorescents transgéniques (Figure 9).

3. Caractérisation des embryons transgéniques doubles

  1. Phénotypage d’embryons doubles transgéniques
    1. Collectez des embryons de femelles fondatrices transgéniques en mosaïque s’accouplant avec des mâles de type sauvage.
    2. Prélever les embryons BFP-positifs (BFP+) au stade unicellulaire au microscope à fluorescence.
    3. Identifier les défauts de développement qui apparaissent chez les embryons BFP+ , mais pas chez les embryons BFP- .
    4. Fixer les embryons dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) à 4 °C pendant la nuit. Effectuer une hybridation in situ sur l’ensemble du montage, une coloration par immunofluorescence ou d’autres analyses histologiques si nécessaire.
      REMARQUE : Seuls les phénotypes défectueux qui apparaissent exclusivement dans les embryons exprimant des ARNsg positifs à la GFP ou à la BFP sont fiables. Les conclusions doivent être tirées avec prudence, et les phénotypes mutants maternels doivent être corroborés par plus de 10 cas.
  2. Génotypage d’embryons mutants maternels
    REMARQUE : Pour l’identification de Mrbm24a embryons, ils peuvent être facilement détectés par l’absence de Rbm24a-RFP au microscope à fluorescence. En revanche, l’identification des mutants maternels d’autres gènes repose principalement sur une stratégie d’aspiration cellulaire avant l’activation du génome zygotique, suivie de l’analyse RT-PCR des ARNm maternels dans les cellules collectées (Graphique 10).
    1. Aspiration cellulaire
      1. Préparez une solution d’agarose à 1,5 % en la dissolvant dans un tampon de Ringer 1/3x et en la faisant bouillir jusqu’à ce qu’elle soit fondue. Versez la solution dans une boîte de Pétri de 90 mm et insérez un moule (WPI, moules en Z) dans l’agarose fondu. Une fois solidifié, retirez délicatement le moule, ce qui permet d’obtenir une plaque prête à l’emploi.
      2. Utilisez des capillaires en verre et un extracteur pour créer des aiguilles scellées à l’état fondu. Pour des aiguilles d’aspiration cellulaire optimales, réglez deux poids légers et la puissance de chauffage à Lv1 : 60 et Lv2 : 90, puis sélectionnez la procédure Step2. Coupez les pointes capillaires à l’aide d’une pince à épiler pointue (voir tableau des matériaux) pour obtenir un diamètre d’ouverture de 30-40 μm. Par la suite, créez une pointe à l’extrémité de l’aiguille à l’aide d’une microforge, ce qui facilite la pénétration et minimise les dommages à l’embryon.
      3. Accouplez les femelles fondatrices présumées avec des poissons-zèbres de type sauvage et collectez les embryons. Isolez les embryons BFP positifs au stade unicellulaire.
      4. À 3 hpf, déchorionner les embryons par incubation dans 1 mg/mL de Pronase dans un tampon de Ringer 1/3x pendant 10 min et un pipetage doux, et placer soigneusement les embryons sur la plaque d’agarose inondée de tampon de Ringer 1/3x complétée par 1x pénicilline-streptomycine. Réorientez les embryons de manière à ce que le blastomère soit dirigé vers l’extrémité capillaire.
        REMARQUE : Il est crucial de transférer les embryons avec soin, car ils sont extrêmement fragiles sans la protection du chorion. Ne les laissez pas toucher la surface du support !
      5. Utilisez un micro-injecteur pour aspirer 20 à 40 cellules de chaque embryon en réduisant soigneusement la pression d’équilibre qui compense la force d’aspiration de l’action capillaire15. Libérez ces cellules dans 2 μL de H2O désionisé sur le bord d’ouverture des tubes PCR en augmentant la pression d’équilibre.
        REMARQUE : Pour éviter la contamination croisée, l’aiguille de verre doit être nettoyée par aspiration et éjection désionisée H2O 3x avant chaque aspiration.
      6. Ajoutez 200 μL de réactif d’extraction d’ARN pour laver les cellules et stockez temporairement les tubes sur de la glace. Par la suite, analysez les génotypes des cellules d’embryons avec ou sans défauts de développement.
        REMARQUE : Les cellules conservées dans le réactif d’extraction peuvent être stockées à -20 °C jusqu’à ce que les embryons correspondants présentent des phénotypes aberrants.
      7. Laissez les embryons après l’aspiration cellulaire dans la plaque d’agarose ou placez-les individuellement dans des plaques à 24 puits inondées de 1/3 de solution de Ringer contenant 1 fois de pénicilline-streptomycine.
        REMARQUE : Des précautions doivent être prises lors du transfert des embryons déchorionnés ! En règle générale, nous examinons 20 à 40 embryons dans une expérience, qui dure environ 1 h.
    2. Analyse de l’ARNm maternel d’intérêt dans les cellules aspirées
      1. Ajouter 40 μL de chloroforme dans les cellules du réactif d’extraction et mélanger délicatement. Centrifuger le mélange à 12 000 × g pendant 1 min à 4 °C.
      2. Récupérez soigneusement le surnageant. Ajouter 1 μL de solution de glycogène (20 mg/mL) et un volume égal d’isopropanol (si le volume du surnageant est de 100 μL, ajouter 100 μL d’isopropanol) et bien mélanger. Incuber le mélange à -20 °C pendant 30 min pour faciliter les précipitations.
        REMARQUE : En raison de la petite quantité d’ARN total dans les cellules aspirées, du glycogène doit être ajouté pour améliorer l’efficacité de la précipitation et faciliter la visualisation du précipité.
      3. Centrifuger l’échantillon à 12 000 × g pendant 10 min à 4 °C et jeter le surnageant.
      4. Laver le granulé 2 fois par l’ajout de 500 ml d’éthanol à 70 % et la centrifugation à 12 000 × g pendant 1 min.
      5. Jetez le liquide et ouvrez le couvercle pour laisser sécher la pastille à température ambiante pendant 5 min.
      6. Ajouter 7 μL d’eau pour dissoudre la pastille. Effectuez la transcription inverse à l’aide du kit de synthèse d’ADNc premier brin, en suivant le protocole détaillé fourni dans le manuel d’instructions.
      7. Amplifiez toute la région codante avec des amorces appropriées (voir le tableau des matériaux) et effectuez une électrophorèse à agarose.
      8. Clonez les produits de PCR et séquencez au moins 30 clones pour chaque embryon afin d’analyser la mutation apparue dans les ARNm.
        REMARQUE : Pour confirmer que la présence d’un phénotype défectueux est causée par une mutation ciblée du facteur maternel intéressé, tous les embryons (n > 5) présentant des phénotypes défectueux doivent montrer l’absence de transcrits maternels de type sauvage. À l’inverse, les ARNm maternels de type sauvage doivent être présents dans tous les embryons exprimant des ARNsg en développement normal (n > 5). Dans le même temps, chez les embryons négatifs à l’ARNsg, seuls les ARNm de type sauvage sont détectables (n > 5).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Génération rapide de mutants maternels rbm24a
Nous avons construit un vecteur transgénique permettant l’expression d’un marqueur BFP maternel et de quatre ARNsg très efficaces ciblant la séquence codante rbm24a. Suite à l’introduction de ce vecteur dans des embryons homozygotes de rbm24a-RFP KIzpc :cas9 par transposition de Tol2, Mrbm24a a été facilement et rapidement identifié parmi les embryons F1 BFP-positifs...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les mutations zygotiques létales entravent l’analyse de la contribution maternelle d’un gène. Les stratégies alternatives, notamment le remplacement germinal et la micro-injection d’ovocytes in situ (OMIS), sont techniquement exigeantes 6,8. Dans le processus de transplantation cellulaire de remplacement germinal, l’embryon receveur reçoit très peu de PGC, empêchant souvent le développement normal de la femelle 16,17,18.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Ce protocole a été accordé en tant que brevet par l’Administration nationale chinoise de la propriété intellectuelle, ce qui permettra de lever l’utilisation restreinte de la méthode après avoir obtenu l’autorisation des auteurs. Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’autres intérêts concurrents ou financiers.

Remerciements

Nous remercions Jianlin Shen, Yiteng Xu et Qingqing Wei de la plateforme d’installation et de services de base de l’École des sciences de la vie. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions 32170816, 32370860, 32450630 et 31871451), le Programme des chercheurs exceptionnels d’âge moyen et jeunes de l’Université du Shandong, les érudits Taishan de la province du Shandong.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2x mélange PCR M5 HiPer TaqMei5bioRéf. : #MF001-BD-100
AgaroseMDbioN° de chat#A006L
AxyPrep Plasmid Miniprep KitAxygenRéf.#AP-MN-P-4
Instrument d’électrophorèse capillaire (Qsep400)BiOptiqueN/A
Mélange d’étiquetage DIGRocheRéf. #11277073910
DNase IRocheRéf. #4716728001
La TNTThermo Fisher ScientificRéf. #R0861
Kit de synthèse d’ADNc premier brinTransGen BiotechN° de catalogue (Cat#AT301)
Nucléase GenCrispr NLS-Cas9-NLSGenScriptRéf. #Z03389
Capillaires en verre (1,0 x 100 mm)Usine d’équipement éducatif RantaiRéf.#OS-2B
GlycogèneBBI Sciences de la vieRéf. #28985
GraphPad Prism 9Pavé graphiquehttps://www.graphpad.com/
ImageJLibrehttps://imagej.net/software/fiji/
Agarose à bas point de fusionBiotechnologieRéf. #CA1351
Microforge (MF2)NARISHIGEN/A
Micro-spectrophotomètre (Nano-300)ALLSHENGN/A
OlyVIAOLYMPEN/A
Pénicilline-streptomycineGibcoRéf. #15140122
Injecteur de picolitres (PLI-100A)  ;Appareil de HarvardN/A
Pince à épiler pointueWPIRéf. #500341
Pince à épiler pointue  ; WPI  ;500341
Extracteur (PC-100)NARISHIGEN/A
Inhibiteur de la RNase RiboLockThermo Fisher ScientificRéf.#EO0381
rNTPThermo Fisher ScientificRéf. #R0481
Perles magnétiques hydroxyles de siliciumSangon BiotechRéf. #B518720-0001
ARN polymérase T7ONÉRéf. #M0251L
ZoldWPIMoules en Z Cat#

Références

  1. Fuentes, R., et al. The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish. Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).
  2. Yan, L., et al. Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates. Science. 362 (6417), eaat1045(2018).
  3. Abrams, E. W., et al. Molecular genetics of maternally-controlled cell divisions. PLoS Genet. 16 (4), e1008652(2020).
  4. Shao, M., et al. Rbm24 controls poly(A) tail length and translation efficiency of crystallin mRNAs in the lens via cytoplasmic polyadenylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (13), 7245-7254 (2020).
  5. Weidinger, G., et al. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13 (16), 1429-1434 (2003).
  6. Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14919-14924 (2002).
  7. Xing, Y. Y., et al. Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements. PLoS Genet. 14 (8), e1007551(2018).
  8. Wu, X., Shen, W., Zhang, B., Meng, A. The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary. J Mol Cell Biol. 10 (6), 479-493 (2018).
  9. Zhang, C., et al. Generation of zebrafish maternal mutants via oocyte-specific knockout system. Bio Protoc. 14 (21), e5092(2024).
  10. Zhang, C., et al. Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish. Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).
  11. Li, J., et al. Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Cell Res. 25 (5), 634-637 (2015).
  12. Zhang, Y., et al. Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish. EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).
  13. Xia, Y., et al. T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).
  14. Yin, L., et al. Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs. Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).
  15. Shao, M., Cheng, X. N., Liu, Y. Y., Li, J. T., Shi, D. L. Transplantation of zebrafish cells by conventional pneumatic microinjector. Zebrafish. 15 (1), 73-76 (2018).
  16. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  17. Aharon, D., Marlow, F. L. Sexual determination in zebrafish. Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).
  18. Ye, D., et al. Abundance of early embryonic primordial germ cells promotes zebrafish female differentiation as revealed by lifetime labeling of germline. Mar Biotechnol (NY). 21 (2), 217-228 (2019).
  19. Wang, X., et al. Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors. Nat Commun. 14 (1), 7918(2023).
  20. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  21. Bertho, S., et al. Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition. Development. 148 (7), dev.187773(2021).
  22. Houwing, S., et al. A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish. Cell. 129 (1), 69-82 (2007).
  23. Shao, M., et al. Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish. Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

dition du g nome du poisson z breInactivation sp cifique aux ovocytesPoissons z bres sans Tol2D l tion des facteurs maternelsMicroinjection d embryonsAspiration cellulaireMarqueur prot ine fluorescentePCR apr s transcription inverse
Génération de mutants maternels à l’aide du poisson-zèbre knock-in zpc :cas9
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.