Article de méthode

Un modèle murin de l’administration continue continue de pression positive des voies respiratoires néonatales et la méthode de la tranche pulmonaire de précision pour mesurer la contractilité des voies respiratoires

DOI :

10.3791/68643

⸱

13 mars 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, UH Rainbow Babies & Children's Hospital, 2Department of Pediatrics, Case Western Reserve University School of Medicin, 3Department of Anesthesiology & Perioperative Medicine, Mayo Clinic, 4Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous démontrons une méthode non invasive pour administrer des niveaux variables de CPAP à des souris néonatales non anesthésiées. La technique vise à imiter partiellement l’administration de CPAP pour de nombreux nourrissons prématurés afin d’évaluer ses effets sur le développement pulmonaire. Nous démontrons également les effets du CPAP sur la contractilité des voies respiratoires en utilisant la méthode de la tranche pulmonaire de précision.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les forces mécaniques associées au soutien respiratoire à pression positive utilisé en soins intensifs chez les nourrissons prématurés peuvent avoir des conséquences positives ou involontaires sur le développement pulmonaire. Le soutien de pression positive améliore l’échange gazeux pulmonaire, limite l’atélectasie et améliore l’oxygénation systémique, mais les effets nocifs des modalités invasives, telles que la ventilation mécanique, sur le développement pulmonaire sont également bien connus. Cependant, il existe d’importantes lacunes dans notre compréhension des effets néfastes des formes de ventilation moins invasives. Ici, la pression positive continue des voies respiratoires (CPAP) est l’une des modalités de soutien respiratoire les plus courantes, représentant la moins invasive du spectre de la pression positive. Une limitation majeure dans l’étude du développement des voies respiratoires humaines est l’absence de modèles adaptés à l’âge et la capacité d’administrer le CPAP aux petits animaux nouveau-nés. Nous avons résolu ce problème en développant un modèle murin de CPAP néonatal administré quotidiennement à des souris nouveau-nées éveillées et non anesthésiées — un modèle qui utilise des niveaux cliniquement pertinents de CPAP à un stade du développement pulmonaire de souris correspondant aux nourrissons prématurés lorsqu’ils sont susceptibles de recevoir un CPAP en réanimation. Ici, nous présentons notre modèle de CPAP, qui inclut un système pratique et conçu sur mesure capable de délivrer le CPAP de manière non invasive au nouveau-né non anesthésié avec des niveaux facilement ajustables. Nous fournissons également une démonstration de la méthode de la tranche pulmonaire de taille de précision pour la mesure de l’hyperréactivité des voies respiratoires ex vivo. Le PCLS est décrit ici car il offre une lecture fonctionnelle pratique du système pulmonaire, ce qui peut être techniquement difficile dans les petits modèles animaux (néonatals), et a également une large applicabilité à d’autres modèles sans lien avec le CPAP. Nous montrons des données démontrant que le CPAP provoque une hyperréactivité des voies respiratoires, ce qui peut avoir des implications cliniques importantes pour le choix de la modalité de soutien respiratoire en soins intensifs chez les nourrissons prématurés.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les problèmes respiratoires, tels que l’apnée et la détresse respiratoire, nécessitent pour de nombreux nourrissons prématurés des modes de soutien respiratoire qui sauvent la vie, ce qui, malheureusement, contribue à la morbidité infantile et à des séjours hospitaliers prolongés. Le soutien respiratoire à pression positive et l’oxydo2 supplémentaire, y compris la ventilation mécanique (MV) et le CPAP moins invasif, sont des modalités courantes de soutien respiratoire. Cependant, le principal problème à court et long terme pour les survivants de la période critique de la prématurité reste la maladie bronchiquechronique des voies respiratoires 1,2,3,4, manifestée par une respiration sifflante/asthme à vie, une mauvaise fonction pulmonaire et une diminution de la capacité d’exercice. Bien que les effets nocifs de l’oxygèneO2 et de la MV supplémentaires soient largement impliqués dans la pathogenèse de la dysplasie bronchopulmonaire (BPD) et des morbidités respiratoires à long terme depuisdes décennies 5,6,7,8, certaines preuves suggèrent que des formes non invasives de soutien respiratoire, telles que le CPAP, pourraient également avoir des effets indésirables sur le poumon en développement 6,9,10.11,12. Cependant, très peu de choses sont connues sur les effets indésirables de la CPAP, principalement en raison des défis techniques liés à son administration non invasive aux nouveau-nés.

Compte tenu de l’augmentation globale du taux d’asthmepédiatrique 13, et de l’augmentation des taux de survie des nourrissons prématurés au-delà du séjour en néonatologie, il faut comprendre les mécanismes initiant les changements structurels et fonctionnels néfastes des voies respiratoires trachéobronchiennes immatures et comment elles contribuent aux troubles pulmonaires à vie indépendamment de l’oxygèneO2 supplémentaire est un besoin clinique et de recherche important non satisfait. Les preuves émergentes suggèrent que le CPAP néonatal pourrait avoir des effets indésirables à long terme sur la fonction des voies respiratoires et contribuer aux troubles de la respiration sifflante, ce qui est significatif puisque le CPAP est devenu la modalité de soutien respiratoire privilégiée pour éviter la toxicité à l’O2 par le supplémentO2. Les défis techniques liés à l’administration du CPAP à des nouveau-nés petits et adaptés à leur âge ont freiné nos progrès dans notre compréhension des effets du CPAP (bénéfiques ou nuisibles) sur le développement pulmonaire. Nous avons résolu ce problème en développant le premier modèle néonatal de la CPAP 10,11,12,14,15 délivrée quotidiennement (avec des niveaux variables de CPAP pendant 3 heures par jour) à des souris éveillées et non anesthésiées dès la naissance, permettant ainsi l’étude des niveaux cliniquement pertinents de CPAP à un stade de développement pulmonaire comparable à celui des nourrissons très prématurés (~24-28 semaines de fœtus) susceptibles de recevoirla CPAP 16, 17. Nous avons réalisé des IRM dans le modèle infantile et confirmé que le CPAP entraîne un gonflementpulmonaire 11 et que le CPAP lors de la première semaine postnatale provoque une augmentation à long terme (3 semaines d’âge) de la réactivité des voies respiratoires (c’est-à-dire 2 semaines après le CPAP)10,11,12,14, ce qui correspond à la respiration sifflante chez les tout-petits (3-4 ans). Ici, nous proposons une démonstration détaillée de notre système CPAP conçu sur mesure pour les souris nouveau-nées et décrivons une méthode pratique pour évaluer la contractilité des voies respiratoires en utilisant la méthode de la tranche pulmonaire de précision ex vivo (PCLS).

Le PCLS offre une excellente et pratique opportunité d’étudier les mécanismes d’hyperréactivité des voies respiratoires et leurs voies respectives. En utilisant la méthode PCLS, les voies respiratoires individuelles sont imagées en temps réel pour mesurer le rétrécissement des voies respiratoires en réponse à un bronchoconstricteur tel que la méthacholine après un prétraitement des voies respiratoires avec des inhibiteurs spécifiques des récepteurs/canaux. Ces études sont importantes pour comprendre les conséquences physiopathologiques du CPAP en prématurité afin de fournir des interventions ciblées et exploitables permettant d’optimiser les soins cliniques nécessaires tout en atténuant les conséquences potentielles à vie.

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Protocole

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Des expériences sont réalisées sur des souris enceintes en temps interminable, surveillées quotidiennement pour déterminer le jour de naissance. Les souris sont traitées avec ou sans CPAP dans 21 % deO2 pendant la première semaine de vie postnatale. En général, les poumons sont retirés en préparation de la mesure de la réactivité de l’AW à l’aide de la méthode de la coupe pulmonaire de précision (PCLS) 2 semaines après la CPAP, bien que ces mesures soient possibles dès P8 jours (immédiatement après la CPAP) ou à l’âge adulte. Toutes les procédures ont été réalisées conformément aux directives de l’Institut national de la santé (NIH) pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Case Western Reserve.

1. Montage du masque CPAP

  1. Construisez un masque individuel à partir de l’extrémité coupée d’une seringue de 5 mL contenant la section Luer lock pour la connexion des tubes afin de permettre la délivrance d’un flux d’air et d’une pression positive aux voies respiratoires de la souris (Figure 1A).
  2. Prépercez la partie seringue du masque pour accueillir un Luer-Lock fileté relié à un coude, un raccord de pointe Luer vers le tuyau, et un tube d’aquarium standard (diamètre de 3/8").
  3. Utilisez le tube latéral pour permettre au flux d’air courant de passer par une fuite réglable en aval afin de régler la contre-pression dans les poumons de la souris et un manomètre sur mesure pour surveiller le niveau CPAP en temps réel.

2. Conception du col

  1. Construisez le col à partir de sections coupées du bout des doigts de gants de laboratoire standards de petite taille. Utilisez-le pour connecter la souris à l’unité de masque.
  2. Utilisez une perforatrice (1/4 de pouce) pour créer un trou à l’apex du bout du doigt coupé, qui forme une ouverture de taille uniforme et uniforme pour accueillir la face et la tête de la souris.
    REMARQUE : Le perforateur assure une taille de masque uniforme, mais des perforateurs plus grands sont nécessaires autour de P4 pour s’adapter à la croissance de la souris.

3. Construction du manomètre

  1. Construisons un manomètre à partir de deux pipets sérologiques jetables reliés par un tuyau d’aquarium courbé (Figure 1A). Assurez-vous que le manomètre est à moitié rempli d’eau contenant une goutte de colorant coloré pour faciliter la visualisation du niveau CPAP.
  2. Reliez le manomètre en série avec, et en aval, d’un régulateur de débit (débit ~600-700 mL/min) et du masque.

4. Ajustement du collier et du masque sur la souris

  1. Pour placer le collier sur la souris (âgée d’un jour), positionnez-le d’abord sur l’extrémité ouverte du masque, qui, grâce à une manœuvre prudente, doit être étiré pour pouvoir accueillir le visage et la tête de la souris.
  2. Insérez la face de la souris par l’ouverture du collier, qui est doucement relâchée depuis sa position tendue sur le visage ou la tête. À ~4 jours, découpez de petites fentes dans l’ouverture du collier pour accueillir la croissance et la grosse tête de la souris, bien qu’un coup entier de taille plus grande soit également recommandé.

5. Administration simultanée de CPAP à plusieurs souris

  1. Fabriquer un système capable de délivrer la CPAP à plusieurs souris néonatales (jusqu’à 10) en utilisant une série de contrôleurs de débit et de manomètres (Figure 1B). Fournir le flux d’air en amont par un réservoir d’air classique avec un régulateur standard et le faire passer à travers un régulateur de débit qui fournit le débit global à tous les appareils CPAP et aux unités masque/collier.
  2. Faites bouillonner l’air dans un réservoir d’eau pour l’humidification avant de le transmettre directement aux unités CPAP, et administrez le CPAP à chaque animal indépendamment.
    REMARQUE : Une souris témoin reçoit un masque, le même flux d’air, mais sans contre-pression ni CPAP.
  3. Effectuez toutes les expériences sur un coussin chauffant avec de l’eau recirculée à ~38 °C pour maintenir une température corporelle stable.

6. Chronologie

  1. Surveillez quotidiennement les souris enceintes pour déterminer la date de naissance, puis effectuez la première séance CPAP le lendemain (P1 jour d’âge) pendant 2 heures (Figure 2) afin de minimiser la durée pendant laquelle les chiots sont absents d’une mère allaitante.
  2. Pour les jours suivants (P2-P7), effectuez chaque séance CPAP pendant une durée de 3 heures. Effectuer la CPAP plus de 7 jours, si nécessaire, et à n’importe quel niveau donné, bien que 7 jours de CPAP à 6 cmH2O soient utilisés de manière routinière.
  3. Ensuite, évaluer les animaux pour détecter les effets du CPAP sur la réactivité des voies respiratoires, soit immédiatement après (P8) la fin du CPAP (P7), soit pour des effets à plus long terme (par exemple, P21 ou âge adulte) en utilisant la préparation pulmonaire de précision (section 8).

7. Prélèvement de tissu et contractilité des voies respiratoires

  1. Prélève les poumons pour des techniques moléculaires ou physiologiques (par exemple, réaction en chaîne par polymérase (PCR), western blots, immunohistochimie, RNASeq, protéomique, métabolomique, etc.).
    REMARQUE : L’accent principal est mis sur les effets du CPAP sur la contractilité des voies respiratoires, qui peuvent être évalués in vivo (anesthésié et ventilé mécaniquement, P21 jours ou plus) pour la mécanique du système respiratoire ou ex vivo à l’aide du PCLS (P8 jours ou plus). Ce dernier présente des avantages majeurs pour étudier des composés ou agents ciblant des voies spécifiques qui peuvent ne pas être adaptées à des études in vivo .

8. Extraction/préparation du poumon entier pour la méthode de la tranche pulmonaire de précision (PCLS)

  1. Euthanasiez la souris par overdose anesthésique (injection intrapéritonéale d’un mélange kétamine/xylazine ; respectivement 100 mg/kg/10 mg/kg) afin de préparer les poumons à des mesures ex vivo de la réactivité des voies respiratoires à la méthacholine appliquée dans le bain.
  2. Placez la souris sur le dosé pour la canulation de la trachée à l’aide d’une seringue remplie d’agarose. Insérez la canule par une petite incision ventrale du cou et avancez-la de ~3 mm avant de la fixer par une suture.
  3. Injectez doucement de l’agarose liquéfiée (40 °C) pour gonfler les poumons (0,4 mL pour les souris P8 ; 0,8 mL pour les souris P21) et placez la souris au réfrigérateur pendant 30 minutes pour laisser l’agarose refroidir et gélifier.

9. Sectionnement pulmonaire pour la méthode PCLS

  1. Une fois l’agarose refroidie, insérez un lobe pulmonaire (de votre choix) dans de l’agarose à 2 %, placez-le sur un vibratome, coupez en sections de 300 μm, puis immergez-le dans une solution DMEM + Pen/streptocoque pour une incubation nocturne (5 % CO2, 37°C).
  2. Le lendemain, rincez les tranches pulmonaires avec du HBSS et montez-les dans une chambre d’enregistrement pour une imagerie en direct des réponses des voies respiratoires au défi de la méthacholine.
    REMARQUE : Les résultats présentés représentent un traitement naïf (témoin, c’est-à-dire pas de CPAP) et uniquement un traitement CPAP, et aucun agoniste ni antagoniste/inhibiteur n’est utilisé.
    1. Réalisez des images des voies respiratoires.
      1. Placez les tranches de poumon sur une chambre de perfusion sur mesure et recouvrez-les d’une fine feuille légère de maille et d’une enveloppe de protection, qui sont maintenus en place avec de la graisse de silicone.
      2. Ensuite, montez la chambre d’enregistrement contenant la tranche au microscope et perfusez (7 mL/min) en continu avec du HBSS à température ambiante à l’aide d’une pompe à perfusion.
      3. Utilisez un microscope monté avec une caméra pour identifier les voies respiratoires individuelles. Après une période initiale de 3 minutes d’enregistrement de base, perfusez la chambre avec des concentrations croissantes de méthacholine (2 min chacune) et notez continuellement les variations de la surface de la lumière des voies respiratoires.
    2. Quantifiez la taille des voies respiratoires.
      1. Identifiez une image unique (logiciel ImageJ) d’une voie respiratoire pour une concentration donnée de méthacholine (et de base) et quantifiez la surface lumineuse en sélectionnant le seuil d’ajustement pour garantir que la surface lumineuse est entièrement capturée (Figure 3A).
      2. Ensuite, appliquer ces réglages aux images suivantes de la même voie respiratoire à différentes concentrations (c’est-à-dire que le même seuil est utilisé pour une voie respiratoire donnée).
      3. Ensuite, sélectionnez la surface de lumen à mesurer à l’aide de l’outil de traçage de baguette (Figure 3B), puis appuyez sur Ctrl + M (Figure 3C) pour quantifier automatiquement la surface de lumen en pixels. Répétez cela pour chaque concentration de méthacholine ; les données sont numériquement disponibles pour une représentation graphique avec la réactivité des voies respiratoires exprimée en fraction de la taille de la lumière de base (Figure 3).
    3. Taille de l’échantillon
      1. Choisissez les voies respiratoires au hasard et effectuez la réponse à la méthacholine sur une section de poumon/a-a, bien que généralement plusieurs sections par animal puissent être évaluées. Ainsi, les groupes de traitement peuvent être composés de plusieurs voies respiratoires/animaux issus de plusieurs portées.
      2. Classez les voies respiratoires en grandes (>0,05 mm2) ou petites (<0,05 mm2), car il a déjà été déterminé que le CPAP affecte les voies respiratoires de différentes tailles.

10. Livraison de médicaments

  1. Analysez en utilisant des sections exposées (ou incubées avec) des siRNA ciblant des voies spécifiques pendant 48 heures après l’excision et la coupe.
    REMARQUE : Des agonistes et antagonistes spécifiques à divers récepteurs peuvent également être appliqués de façon pratique aux sections pulmonaires, ce qui est un avantage si ces composés ne sont pas appropriés ou sûrs pour une administration in vivo .
  2. Alternativement, les poumons peuvent être fixés par l’inflation (formol) à des pressions d’inflation standardisées (25 cmH2O), conservés, et préparés pour une immunohistochimie et une coloration pour une analyse ultérieure à l’aide de la microscopie confocale.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analyse par IRM du volume pulmonaire lors du CPAP néonatal
L’analyse IRM a été utilisée pour visualiser les changements de volume pulmonaire chez des souris de 3 jours, non anesthésiées, respirant spontanément (n = 4 souris). Le volume pulmonaire augmentait avec l’augmentation des pressions de gonflage (c’est-à-dire CPAP) jusqu’à 9cmH 2O (Figure 4A). Des images représentatives d’une souris de 3 jours à 0 et6 cmH2 O C...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le CPAP est une modalité de soutien respiratoire nécessaire pour les nourrissons prématurés présentant des détresses respiratoires. La CPAP est superposée à la respiration spontanée et sert à améliorer l’oxygénation systémique en maintenant un volume pulmonaire élevé et à prévenir l’effondrement alvéolaire ainsi que l’atélectasie. Ainsi, il existe des bénéfices majeurs et vitales du CPAP, et il a été démontré qu’il améliore le développement alvéolaire, bien que les bénéfices puissent dép...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les études ont été financées par des subventions de l’Institut national de la santé R01 HL177837 et R01 HL056470.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue de 5 mLFisher Scientific149556458
Seringue de 1 mLFisher Scientific309659Injecter de l’agarose par la canule
Perforatrice de trou de 1/4"McMaster Carr3427A57
Moules d’encastrement 22 x 22 x 20Fisher Scientific22-19
Aiguilles de 23 GFisher Scientific305193Pour fixer la canule à une seringue, d’autres tailles seraient nécessaires pour des âges autres que P21 et nbsp ;
Pipettes sérologiques de 2 mLFisher Scientific13-678-12cPour fabriquer un moanomètre
Vannes de fuite réglablesN’importe quel magasin d’animauxhttps://www.petco.com/shop/
en/petcostore/produit/imagi
tarium-air-contrôle-valve
Tubulure d’aquariumN’importe quel magasin d’animauxhttps://www.petsmart.com/fish/
filtres-et-pompes/air-et-eau
-pompes/haut-nage-aquarium-avion
-tubing-5291863.html
CaméraAmscopeMU300
Tubulure à canuleFisher Scientific427411Pour les souris P21. D’autres tailles seront nécessaires pour d’autres âges. Le tube doit s’adapter parfaitement à la trachée
CouverturesFisher Scientific12-541-01418 mm x 18 mm
DMEM : F12Invitrogen11039-021
Contrôleurs de débitInstruments clésGS10510AVBPour le flux d’air vers des souris individuelles
DébitmètreAvantorMFLX68560-04Pour le flux d’air vers l’ensemble du système
Pompe Gaymar TBraintree ScientificTP-700Pour maintenir la température corporelle pendant le CPAP
Solution salée équilibrée de HanksFisher ScientificMT-20023cvDiluer à 1x pour une utilisation
ImageJNIHtéléchargement gratuithttps://imagej.net/ij/download.html
Gants en latex taille petiteFisher ScientificMF-300-SPour fabriquer des masques CPAP
Point de rencontre bas agaroseInvitrogen165200-100
MaillageAmazonhttps://www.amazon.com/Top-
Trimming-Polyester-Horsehair
-vending/dp/B01AC93LJ0/ref=sr
_1_fkmr2_1 ?keywords=dritz %2
Bpolyester %2Bhorsehair %2Bbr
aid& qid=1562072725& s=gatew
ay& sr=8-1-fkmr2& ; th=1
MéthacholineMilliporeA2251
MicroscopeLeicaDMLFS
Pénétro/streptocoqueInvitrogen15140-148
Pompe à perfusionAppareil de Harvard70-2027
Chambre d’enregistrementInstruments WarnerRC-27Ou quelque chose de similaire
Bouillotte réutilisableBraintree ScientificTP-RPour une utilisation avec la pompe T Gaymar
Graisse siliconée (Molykote111)Amazonhttps://www.amazon.com/Molykote
-Résistance-Composantes-lubrifiants-
Volatilité/dp/B0DYDFLXGZ/ref=sr_1
_1_sspa ?crid=2D4LQC7SRX07P& ;
dib=eyJ2IjoiMSJ9.HcWWXlt8ThxcB
eGCZ6iH5jwumyClyFGkW141klcjnn
OH3hc60r0hy53Ji-9HDW0TtH33nJ-
7UmalEzJGg59qB2gzsGNzFMelw
Plaques stériles à 6 puitsFisher Scientific3516Pour la culture des tranches
Fil de suture 3-0Fisher ScientificSP117Attacher la canule à la trachée
Raccords de tuyauterieAppareil de Harvard72-1406
Vibratome (découpeur pelco)Ted Pella11000Ou équivalent

Références

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