Réduire l’échelle pour un impact important : production rationalisée de virus adéno-associés recombinants à haut débit

Résumé

Bien qu’ils soient largement utilisés dans l’administration de gènes, les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV) sont confrontés à des défis de production notables. Ce protocole décrit les méthodes de production à l’échelle microscopique et à l’échelle miniature utilisant à la fois des cellules adhérentes et des cellules en suspension. Les méthodes rationalisent la génération, la purification et l’optimisation des vecteurs, accélérant ainsi la recherche préclinique et facilitant les progrès dans le pipeline de thérapie génique.

Résumé

Ces dernières années, les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV) sont devenus une plate-forme de premier plan pour les applications de thérapie génique. Cependant, la lourdeur des processus de production et de purification reste un goulot d’étranglement important dans le développement de médicaments. La production de rAAV à haut débit et à petite échelle, sans procédures de purification longues et à forte intensité de main-d’œuvre, offre une stratégie alternative précieuse pour accélérer la recherche préclinique et le dépistage thérapeutique à un stade précoce. Cette approche permet de générer rapidement divers variants de rAAV ou constructions thérapeutiques avec une qualité suffisante pour une évaluation initiale in vitro et in vivo . Ce protocole introduit deux méthodes distinctes par le type de cellule et l’échelle de production : la production rAAV à l’échelle microscopique et à l’échelle mini. La production à l’échelle microscopique est réalisée dans un format à 6 puits à l’aide de cellules 293T de rein embryonnaire humain (HEK) adhérentes (micro-6 puits), tandis que la production à l’échelle miniature utilise des cellules en suspension dans des plaques à 24 puits (mini-HT24). Les vecteurs générés par ces méthodes font l’objet d’analyses en aval afin d’optimiser les conditions de culture cellulaire et/ou sont utilisés pour évaluer l’activité biologique des transgènes. Les principales lectures analytiques comprennent le titrage du génome du vecteur (vg/mL), la détermination du titre de capside (vp/mL), l’analyse par transfert Western et les tests de transduction cellulaire. De plus, les vecteurs produits à l’échelle miniature et semi-purifiés à l’aide de résines d’affinité sont comparés à des préparations à l’échelle midi purifiées par des gradients de densité de chlorure de césium. Les méthodes simplifiées décrites ici démontrent un potentiel important pour affiner les paramètres de culture cellulaire, identifier les principaux candidats lors des criblages (c’est-à-dire des cassettes de transgènes optimisées ou des capsides AAV supérieures) et améliorer l’expression des transgènes. Collectivement, les flux de travail présentés soutiennent la mise en place d’une plate-forme robuste et efficace pour le développement itératif dans le pipeline de thérapie génique qui peut être facilement mise en œuvre dans n’importe quel laboratoire de recherche.

Introduction

Le développement de médicaments est un processus complexe et gourmand en ressources qui nécessite l’intégration de données de haute qualité provenant de différentes étapes, notamment l’identification des cibles, la validation préclinique et les essais cliniques¹. En réponse aux demandes croissantes de délais plus rapides et de coûts réduits², l’industrie pharmaceutique a de plus en plus adopté des tests à grande échelle (HT) en combinaison avec une intelligence artificielle (IA) avancée comme pierre angulaire des stratégies de développement modernes ^3,4,5. Les tests HT permettent le dépistage et l’évaluation rapides d’un grand nombre de candidats médicaments ou de variables de dosage à une fraction du temps et du coût par rapport aux méthodes traditionnelles ^5,6.

Dans les applications de thérapie génique, en particulier celles utilisant des vecteurs viraux adéno-associés (AAV), le coût élevé des marchandises et les longs délais de fabrication posent des défis importants⁷. Le processus de développement commence par la production du matériel plasmidique nécessaire à la transfection, suivie de la croissance cellulaire jusqu’à des densités élevées suffisantes pour la production de vecteurs viraux. Après la transfection, une période d’incubation de deux à cinq jours est nécessaire avant la récolte, et le processus se termine par la purification et la caractérisation des lots ^8,9. Collectivement, ce flux de travail peut prendre jusqu’à un mois et est généralement limité à un nombre limité de préparations qui peuvent s’exécuter en parallèle lors de l’utilisation de colonnes d’affinité ou d’ultracentrifugation de gradient 9,10,11,12.

Reconnaissant la nécessité de protocoles de production d’AAV à petite, mini-ou micro-échelle, le domaine a adapté plusieurs approches pour produire des AAV recombinants (rAAV) dans de petites installations à l’échelle du laboratoire. Ces approches impliquent généralement l’utilisation de plusieurs boîtes de 15 cm pour les cellules adhérentes de^{13, 14} ou^{de 50} à 2000 ml de 15 flacons agités pour les cultures en suspension. Dans le passé, des méthodes de purification AAV, telles que l’ultracentrifugation par gradient (par exemple, iodixanol¹⁶, chlorure de césium (CsCl)¹⁷ ou gradients de saccharose¹⁸), étaient utilisées. Cette méthode peu coûteuse et indépendante du sérotype était parfaitement adaptée à la production de rAAV à l’échelle du laboratoire, mais sa nature laborieuse et sa capacité limitée d’ultracentrifugeuse la rendent moins propice aux applications à haut débit^19,20.

La demande continue pour un débit plus élevé a conduit à l’exploration d’approches alternatives pour réduire la production de rAAV. À l’aide de cellules adhérentes, des formats tels que^{6 puits 13, 21, 22, 96} puits²³ et même 384 puits²⁴ ont été étudiés. Plus récemment, les cellules en suspension ont été adoptées, compte tenu de leur évolutivité améliorée et de la puissance comparable, voire supérieure, des préparations de vecteurs⁸.

Cependant, la production à haut débit de rAAV dans des cellules en suspension avec des volumes de culture inférieurs à 15 mL reste un domaine spécialisé, avec des protocoles publiés limités ^7,25,26. La plupart des études se concentrent sur des volumes plus importants afin d’obtenir des rendements suffisants pour les applications en aval ^8,9,27, mais comme pour les cellules adhérentes, les formats à mini-échelle offrent des réductions significatives de la consommation de ressources et du temps de traitement, répondant ainsi à un besoin critique sur le terrain. Il est important de noter que les protocoles à l’échelle mini- et microscopique utilisent souvent des « lysats bruts », ou des récoltes de cultures cellulaires non purifiées contenant des particules vectorielles, pour la caractérisation et les analyses en aval.

Cette étude décrit deux protocoles utilisant à la fois des cellules productrices adhérentes et en suspension (Figure 1). Les lysats rAAV bruts produits à partir de cellules HEK293T adhérentes sont utilisés directement pour des applications ultérieures, telles que la transduction de cellules cibles. En revanche, les rAAV générés dans les cellules en suspension subissent un traitement supplémentaire via une purification de résine d’affinité à haut débit. Ces méthodes ont été spécifiquement développées pour améliorer le rendement, évaluer la qualité des vecteurs et surveiller l’expression des transgènes, tout en minimisant la consommation de réactifs et de matériaux coûteux. Les résultats présentés ici montrent que les lysats bruts (provenant de cellules adhérentes) et les matériaux purifiés par affinité (à partir de cellules en suspension) conviennent, en fonction du domaine d’application. De plus, le rAAV obtenu à l’aide de résines d’affinité a été directement comparé à des homologues purifiés par ultracentrifugation traditionnelle au chlorure de césium en termes de rendement, de pureté et d’efficacité de transduction dans des co-cultures neuronales dérivées de l’homme.

L’adoption de tests à haut débit et à petite échelle dans le développement de médicaments de thérapie génique représente une avancée indispensable, accélérant l’innovation et comblant le fossé entre la découverte scientifique et la réalité thérapeutique. Ces méthodes permettent non seulement de réduire les coûts et les délais, mais aussi de tester en parallèle de nombreuses affections, contribuant ainsi au développement efficace de thérapies transformatrices.

Protocole

1. Production de vecteurs rAAV à 6 puits dans les cellules adhérentes

REMARQUE : La production de rAAV par des micro-6 puits est une version adaptée d’un protocole précédemment publié par Fakhiri et ^al.21.

1. Ensemencement et transfection de cellules HEK293T
   1. Décongeler un flacon de cellules^{HEK293T 28} dans un bain-marie à 37 °C.
   2. Transférer les cellules dans 30 mL de milieu de culture cellulaire adhérent dans des flacons T175 et les maintenir dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco + 10 % de sérum de veau fœtal (SCF), à 37 °C et 5 % de CO₂.
   3. Divisez HEK293T tous les 2-3 jours : Aspirez le milieu de culture cellulaire et ajoutez soigneusement 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour laver les cellules.
      REMARQUE : Seuls les passages cellulaires inférieurs au numéro de passage 15 ont été utilisés dans ce protocole pour assurer l’intégrité et la santé des cellules, ce qui affecte directement la production de rAAV.
   4. Ajouter 2 ml de trypsine/acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,025 % dans les cellules et incuber pendant 2 minutes à 37 °C (ou jusqu’à ce que les cellules se détachent).
   5. Arrêtez la réaction en ajoutant 20 ml de milieu frais et en suspendant les cellules dans le milieu à l’aide d’une pipette de 25 ml. Selon la confluence, les cellules peuvent être diluées 1:10 ou 1:20 dans 24 mL de milieu à haute teneur en glucose DMEM. Pour obtenir une densité cellulaire suffisante pour la transfection, ensemencez 7 ×^{10 6} cellules HEK293T dans une fiole T175.
   6. Après 72 h à 37 °C, récolter les cellules par trypsinisation (comme décrit aux étapes 1.1.3-1.1.5), remettre en suspension dans 20 mL de milieu et compter les cellules.
      REMARQUE : Les cellules peuvent être comptées à l’aide de différentes méthodes, en fonction de la précision souhaitée, du débit et de l’équipement disponible. Deux approches sont principalement utilisées : le comptage manuel (chambre de Neubauer) et les compteurs de cellules automatisés. Ce protocole utilise un analyseur de cellules entièrement automatisé basé sur l’image pour mesurer les paramètres critiques des cellules tels que la viabilité, la densité des cellules et le taux d’agrégation.
   7. Cellules d’amorçage à une densité de 0,5 × 10⁶ cellules/puits dans une plaque à 6 puits. Pour répartir uniformément les cellules, secouez doucement la plaque et placez-la dans l’incubateur de CO₂ .
   8. Après 24 heures, les cellules atteignent une confluence de 60 à 70 % et peuvent être transfectées trois fois.
   9. Pour chaque puits, mélangez 90 μL de milieu exempt de sérum avec un total de 2,6 μg d’ADN plasmidique, y compris pTransgene, pRep/Cap et pHelper dans un rapport molaire de 1:1:1.
   10. Dans un deuxième tube, ajoutez 5 μL de polyéthylénimine (PEI) à 90 μL de milieu sans sérum juste avant la transfection.
   11. Après avoir combiné les deux solutions, agitez le mélange et incubez à température ambiante (RT) pendant 10 min.
   12. Ajouter le mélange de transfection goutte à goutte dans chaque puits. Secouez doucement les plaques avant de les remettre dans l’incubateur.
       REMARQUE : Un changement de milieu après la transfection peut être effectué, mais il n’a pas été appliqué comme pratique standard, car les cellules ont maintenu une bonne viabilité tout au long de l’expérience.
2. Récolte et lyse des cellules
   1. 72 h après la transfection, aspirer soigneusement le milieu cellulaire de la ou des plaques.
   2. Détachez les cellules en ajoutant 500 μL de PBS dans chaque puits, et pipetez soigneusement de haut en bas.
   3. Transférez la suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml.
   4. Mesurez la viabilité et la densité des cellules manuellement ou automatiquement en suivant les instructions du fabricant.
   5. Transférer 50 μL de la suspension dans une plaque à fond en U de 96 pour déterminer l’efficacité de la transfection en quantifiant les populations rapporteures positives par cytométrie en flux.
      REMARQUE : Il est toujours recommandé d’effectuer un contrôle de transfection en parallèle, c’est-à-dire une transfection de 1 à 2 puits avec un transgène portant une protéine fluorescente (par exemple, protéine fluorescente verte (GFP), mCherry, etc.) pour surveiller l’efficacité de la transfection sur la plaque. Les puits avec des cellules non transduites servent de contrôle négatif.
   6. Centrifuger la suspension cellulaire restante à 800 × g pendant 10 min à RT vers des cellules à granulés, qui contiennent la majeure partie des vecteurs produits.
   7. Jeter les cellules surnageantes et les remettre en suspension dans 100 μL de PBS. La suspension cellulaire peut être stockée à -80 °C.
      REMARQUE : Pour obtenir un lysat brut à partir des cellules récoltées, utilisez l’une des deux approches décrites ci-dessous.
   8. Dans la première approche, les cellules peuvent être soumises à cinq cycles de congélation-décongélation, chacun de 5 minutes, à l’aide d’un bain-marie préchauffé à 37 °C et d’azote liquide. Agiter brièvement les échantillons entre les cycles pendant 2 à 3 s.
   9. La deuxième option, la plus utilisée dans ce protocole, est la sonication. Ici, transférez la suspension cellulaire dans des plaques ou des tubes de réaction en chaîne par polymérase (PCR) à paroi mince et placez-la à 4 °C dans un sonicateur à bain d’eau.
      1. Sonicate échantillonne pendant un total de 3 min avec des incréments de 30 s à 25 % d’amplitude (intensité).
   10. Après sonication, granuler les cellules à l’aide d’une centrifugeuse de table (16 100 × g pendant 10 min à 4 °C) pour éliminer les débris cellulaires et obtenir une suspension de vecteur acellulaire.
   11. Transférez les surnageants dans des tubes de 1,5 mL et pipetez 10 μL de chaque échantillon dans une plaque à 96 puits à faible liaison pour l’analyse par PCR numérique par gouttelettes ou par (d)PCR numérique.
   12. Stockez les tubes et les plaques à 96 puits à -80 °C jusqu’à nouvel ordre.
3. Transduction de cellules HEK293A à l’aide de lysats bruts
   REMARQUE : HEK293A cellules peuvent ne pas convenir à tous les sérotypes AAV. Pour identifier une lignée cellulaire appropriée, veuillez consulter des bases de données telles que SPIRIT²⁹ (voir la table des matériaux pour un lien vers la base de données SPIRIT) ou des articles de recherche originaux pertinents^30,31.
   1. Ensemencer HEK293A cellules dans trois plaques de 96 puits un jour avant la transduction à des densités de 1,5 × 10⁶ cellules par plaque.
   2. Le lendemain, mélangez 10 μL des vecteurs produits avec différents volumes de PBS pour générer des dilutions de 1:2, 1:10 et 1:100.
   3. À l’aide d’une pipette multicanaux, transduisez les cellules en plaques de 96 puits en triplicats techniques.
   4. Incuber des cellules avec les rAAV sans échange de milieu pendant 72 h. Après cela, effectuez les expériences en aval en fonction du transgène exprimé, telles que les mesures de niveau de protéines, l’analyse par cytométrie en flux pour l’expression de protéines fluorescentes, les analyses knockdown/knock-out, etc.
   5. Pour la cytométrie en flux standard telle qu’elle est effectuée dans ce protocole, aspirez le milieu et détachez les cellules en ajoutant 25 μL de trypsine/EDTA à 0,025 %.
   6. Incuber à 37 °C pendant 3 min.
   7. Arrêtez la réaction en ajoutant 175 μL d’albumine sérique bovine (BSA) à 1 % dans du PBS dans chaque puits.
   8. Utilisez 100 μL de suspension cellulaire pour l’analyse par cytométrie en flux.

2. Production Mini-HT24 de vecteurs rAAV dans des cellules en suspension

REMARQUE : Dans la configuration mini-HT24, contrairement à la production de micro-6 puits décrite précédemment, des préparations purifiées de vecteurs rAAV sont générées à l’aide de cellules en suspension. Les cultures en suspension produisent des quantités plus élevées de rAAV en raison de l’augmentation des densités cellulaires qui peut être obtenue dans le même volume de culture. Dans ce protocole, un format de puits de 24 profondeurs a été utilisé. Les lysats de cellules brutes sont purifiés à haut débit à l’aide de résines d’affinité AAVX dans le but de générer des produits plus propres nécessaires à certaines applications où les lysats bruts ne conviennent pas (voir la section Discussion).

1. Culture et triple-transfection de cellules de suspension dans des plaques à 24 puits de profondeur
   1. Décongeler un flacon de cellules de production virale (VPC) en suspension dans un bain-marie à 37 °C. Cellules de passage moins de 30 fois pour garantir la qualité constante des vecteurs produits.
   2. Transférez les cellules dans 30 mL de milieu de culture en suspension dans une fiole agitée et cultivez-les pendant 2 à 3 jours dans des conditions de culture d’entretien : 37 °C, 8 % de CO₂, 95 % d’humidité et 140 tr/min (rayon de la plate-forme d’agitation 25 mm).
   3. Déterminer la densité cellulaire viable après 2 à 3 jours (voir REMARQUE à l’étape 1.1.6). Poursuivez la sous-culture et l’expansion jusqu’à ce que le nombre souhaité de cellules viables requises pour la production d’AAV soit atteint.
      REMARQUE : Cellules de sous-culture à une densité viable de > 4 × 10⁶ cellules/mL et < 6 × 10⁶ cellules/mL, ou selon les instructions du fabricant en fonction de la lignée cellulaire individuelle utilisée. Grainez à une densité viable de 6 × 10⁵ cellules/mL pendant 3 jours, fendus ou 3 × 10⁵ cellules/mL pendant 4 jours. Fendre selon les instructions du fabricant.
   4. Ensemencez 3 × 10⁶ cellules/mL dans 2,5 mL de chaque puits de la plaque à 24 puits de profondeur et couvrez la plaque avec un couvercle à membrane stérile.
   5. Préparez le mélange à triple transfection pour chaque construction rAAV comme suit :
      1. Préparez un mélange d’ADN des plasmides de production (pHelper, pRep/Capsid, pTransgene) dans un rapport molaire de 1:1:1 à une masse finale de 600 ng d’ADN par 1 × 10⁶ cellules viables.
      2. Préparez le mélange dans un milieu de culture en suspension à un volume final de 2,5 % du volume de culture à transfecter.
      3. Préparez le PEI-Mix dans un milieu de culture en suspension à un volume final de 2,5 % du volume de culture à transfecter. Utilisez une masse finale de 1 ng d’IPE pour 1 ng d’ADN.
      4. Combinez à la fois DNA-Mix et PEI-Mix en transférant tout le volume de chaque PEI-Mix dans le DNA-Mix correspondant, ce qui permet d’obtenir un volume de mélange de transfection de 5 % du volume de culture.
      5. Mélanger en pipetant 10 fois de haut en bas.
         REMARQUE : Ne pas vortex sur le mélange de transfection après le temps d’incubation pour éviter de perturber les complexes PEI-ADN qui se sont formés pendant l’incubation³².
      6. Incuber à RT pendant 10 min.
   6. Ajoutez les mélanges de transfection goutte à goutte dans les puits correspondants tout en secouant soigneusement la plaque à puits profonds.
   7. Scellez la plaque à l’aide d’un film de rayonne stérile et respirant et couvrez-la en plus du couvercle à membrane correspondant pour minimiser l’évaporation.
   8. Assurez-vous que la plaque est placée sur un plateau d’agitation à puits profond approprié et fixez-la fermement.
   9. Incuber les cellules à 37 °C, 8 % CO₂, 95 % d’humidité et 225 tr/min pendant 72 h.
      REMARQUE : Différents formats de plaques à puits profonds nécessitent une évaluation individuelle de la vitesse d’agitation pour permettre un échange gazeux efficace et une culture efficace des cellules dans une suspension homogène sans que les cellules ne se déposent au fond au fil du temps. Cela nécessite des tests initiaux en fonction de l’équipement et de la configuration du laboratoire, ainsi que des lignées cellulaires utilisées pour la production. Tenez particulièrement compte du rayon d’agitation, du format de la plaque et de la forme du fond du puits pour maintenir la suspension cellulaire homogène et éviter que les cellules ne se déposent au fond.
2. Récolte et lyse
   1. Récoltez les cellules en transférant le volume de culture complet de chaque puits dans des tubes de 5 mL étiquetés individuellement, puis centrifugez-les à 800 × g pendant 20 minutes à 4 °C.
   2. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 550 μL de (D)PBS de Dulbecco et transférer la suspension dans un tube à bouchon à vis de 1,8 à 2,0 mL pour éviter les aérosols et les gouttes lors de l’ouverture des tubes.
      REMARQUE : Les granulés peuvent également être stockés à ce stade pour procéder au processus de purification plus tard. Conservez les granulés de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco à -80 °C et assurez-vous d’en tenir compte lors des étapes du cycle de congélation-décongélation.
   3. Préparez les lysats en plaçant les tubes dans de l’azote liquide pendant environ 2 min, puis en les décongelant dans un bain-marie à 37 °C. Répétez ce cycle 3 à 5 fois.
   4. Centrifuger les lysats pendant 5 min à 1000 × g à 4 °C. Couvrez les seaux de la centrifugeuse avec des couvercles étanches aux aérosols.
   5. Retirez délicatement les tubes de la centrifugeuse.
      REMARQUE : Les lysats doivent être clairs et exempts de débris visibles ou de turbidité pour éviter d’obstruer la résine utilisée dans le processus de purification. Évitez de secouer ou de déranger les granulés. Répétez l’étape de centrifugation si les surnageants ne sont pas clairs. Envisagez une vitesse de centrifugation plus élevée ou une durée plus longue dans le cas d’échantillons très concentrés ou d’échantillons contenant de grandes quantités de débris.
3. Purification rAAV à haut débit à base de résine d’affinité
   1. Dans un bécher, préparez le tampon d’élution en ajoutant 720 mg d’acide citrique à 50 mL d’eau ultrapure pour atteindre une concentration finale de 75 mM d’acide citrique.
   2. Remuez le tampon jusqu’à ce que la poudre soit complètement dissoute.
      REMARQUE : Assurez-vous que le volume du puits est suffisant pour accueillir les volumes tampons et les pointes de pipette sans déversement ni risque de contamination croisée des puits voisins.
   3. Ajustez le pH à 3,0 en ajoutant 1 M d’acide chlorhydrique (HCl) goutte à goutte tout en remuant continuellement le tampon et en mesurant avec une électrode de pH.
   4. Exécutez une filtration stérile sur le tampon en utilisant une taille de pores de 0,22 μm.
   5. Préparez des colonnes d’une plaque à 96 puits profonds d’un volume de puits de 2 à 2,2 mL pour la purification selon le schéma décrit dans le tableau 1.
      REMARQUE : Les échantillons ici ont été purifiés à l’aide d’une configuration de pipette électronique multicanaux. Le processus est compatible avec les systèmes automatisés de manipulation de liquides et peut être mis à l’échelle pour un débit d’échantillons plus élevé.
   6. Exécutez la purification dans une enceinte de biosécurité sur RT en utilisant les paramètres indiqués dans le schéma de purification (voir tableau 1) ou optimisez les paramètres en fonction des besoins individuels, en fonction du volume de résine ou d’échantillon, du titre prévu, etc.
   7. Après l’élution, ajoutez 1/4 de volume d’élution de tampon de neutralisation à chaque échantillon.
   8. Mélanger en pipetant 80 % du volume 10x de haut en bas.
   9. Préparez les plaques de dialyse en retirant les cassettes membranaires et en ajoutant 1600 μL de tampon de dialyse dans chaque puits.
      REMARQUE : Assurez-vous de ne pas mettre les membranes en contact avec du liquide avant d’effectuer la dialyse, car le reséchage peut nuire à l’intégrité et au fonctionnement de la membrane.
   10. Transférez le volume total de l’échantillon (300 μL maximum) dans une cassette de dialyse avec un format de volume et une taille de pores de membrane appropriés (≥ 20 000 poids moléculaire (MWCO)). Assurez-vous que les membranes sont chargées de manière homogène et qu’il n’y a pas de bulles d’air.
   11. Placez les cassettes dans les puits chargés de la plaque de dialyse et scellez la plaque avec une feuille d’étanchéité.
   12. Transférez la plaque de dialyse sur une plate-forme d’agitation et incubez à 300 tr/min, 4 °C pendant 30 min.
   13. Remplacer le tampon de dialyse et répéter l’incubation à 300 tr/min, 4 °C pendant 30 min.
   14. Renouvellement : Échange de tampon et incubation 3x au total.
   15. Transférez le volume total des échantillons dialysés dans des tubes de stockage marqués et stockez-les à 4 °C s’ils sont ensuite utilisés pour la caractérisation ou d’autres expériences.
   16. Conserver à -80 °C pour un stockage à long terme. Évitez les cycles de congélation et de dégel, car cela peut avoir un impact sur l’activité des AAV, et préparez des aliquotes de petit volume si nécessaire.
4. Titrage du titre génomique du rAAV à partir de lysats bruts et purification à base de résine par PCR numérique (dPCR)
   1. Pour déterminer le titre génomique des lysats bruts, c’est-à-dire les génomes viraux par mL (vg/mL), décongelez les échantillons de vecteurs récoltés à RT, puis pipetez 10 μL dans un tube.
      REMARQUE : Plusieurs méthodes sont disponibles pour déterminer le titre du génome viral (vg/mL) d’une préparation de vecteur, la quantification absolue reposant généralement sur deux approches principales : la méthode basée sur les gouttelettes ou les émulsions (ddPCR) et la méthode basée sur les microplaques, représentée par PCR numérique (dPCR)^33,34. En plus de ces méthodes numériques, la quantification absolue peut également être réalisée à l’aide de la PCR quantitative (qPCR). Bien que la qPCR soit traditionnellement une méthode de quantification relative, elle peut être adaptée à la quantification absolue en utilisant une courbe standard plasmidique. Il s’agit d’un plasmide contenant la séquence cible à une concentration connue, qui sert de référence pour extrapoler le titre du génome viral^21,33. Bien que la qPCR soit plus rapide et moins coûteuse que la ddPCR ou la dPCR, elle est moins précise et dépend fortement de la précision de l’étalon plasmidique¹⁶. Quelle que soit la méthode de quantification, les échantillons doivent être prétraités pour libérer les génomes viraux des particules. Ce protocole suit une méthode précédemment décrite par Dobnik, D. et al³⁵.
   2. Traitez les échantillons de rAAV avec une nucléase à 37 °C pendant 30 min pour dégrader l’ADN plasmidique libre du processus de transfection.
      REMARQUE : Facultatif, selon l’enzyme utilisée : chauffer les échantillons à 95 °C pendant 15 min pour inactiver l’enzyme et lyser la capside du vecteur.
   3. Après refroidissement à RT, ajoutez la protéinase K pendant 15 minutes pour digérer les fragments de capside.
   4. Pour l’inactivation de la protéinase K, chauffer à nouveau les échantillons à 95 °C pendant 15 min.
   5. Préparez les mélanges ddPCR ou dPCR en suivant les instructions du fabricant.
   6. Utilisez des sondes d’ADN marquées car elles fournissent un signal plus spécifique que les colorants intercalaires. Concevoir des sondes pour qu’elles se lient « centralement » dans le génome viral, c’est-à-dire dans le transgène (voir NOTE), plutôt que dans le promoteur ou la queue polyA, et sélectionner un fluorophore comme l’hexachloro-6-carboxyfluorescéine (HEX) ou la 6-carboxyfluorescéine (FAM) qui soit compatible avec le système de PCR respectif.
      REMARQUE : Récemment, la ddPCR multiplex ou dPCR, utilisant des ensembles d’amorces/sondes ciblant différentes régions du génome viral, a été utilisée pour améliorer la précision de la détermination du titre^36,37. Cette approche permet de quantifier des génomes intacts en appliquant les formules décrites dans les études référencées ou en utilisant des solutions logicielles intégrées.
   7. Effectuez une dilution en série de 10 fois des échantillons post-traités dans du ddH₂O à l’aide de plaques à 96 puits à faible liaison à l’ADN. Enfin, transférez 5,5 μL (pour la ddPCR) ou 2 μL (pour la dPCR) de la matrice (dilutions 10,⁴- et 10,⁵) sur la plaque ddPCR à 96 puits, qui contient déjà le master mix ddPCR/dPCR, y compris l’amorce/les sondes. Ajustez la plage de dilution en fonction de l’efficacité de production de chaque construction pour vous assurer que les mesures se situent dans la plage de détection linéaire.
      REMARQUE : La quantification dPCR/ddPCR étant une méthode très sensible, des dilutions de 10⁴ et^{5 dilutions} des échantillons sont nécessaires.
   8. Suivez les étapes décrites ci-dessous pour la ddPCR.
      1. Pour l’amplification par PCR, suivez les instructions du fabricant pour optimiser les conditions de test, y compris les ajustements des temps de recuit et d’amplification en fonction du ou des jeux d’amorces/sondes utilisés. Le protocole de cycle standard utilisé dans cette étude était le suivant : dénaturation initiale à 9 °C pendant 10 min (rampe °C/s) ; 35 cycles de dénaturation à 9 °C pendant 30 s et d’amplification à 6 °C pendant 60 s ; suivi d’un pas final d’allongement à 9 °C pendant 10 min (ramping °C/s).
      2. Après l’amplification par PCR des cibles du génome viral rAAV, transférez la plaque dans le lecteur de gouttelettes et suivez les instructions du fabricant pour mesurer l’intensité de fluorescence dans chaque puits. Le lecteur de gouttelettes permet une quantification absolue du nombre de copies du génome viral par réaction μL.
   9. Suivez les étapes décrites ci-dessous pour la dPCR.
      1. Comme décrit pour la quantification basée sur la ddPCR, suivez les instructions du fabricant pour optimiser les conditions de dosage.
      2. Comme point de départ, suivez le profil thermique prédéfini sur le dispositif dPCR, qui comprend une étape initiale de dénaturation à 9 °C pendant 2 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 9 °C pendant 15 s et d’un recuit/extension à 5 °C pendant 30 s.
         REMARQUE : Ce protocole a été mis en œuvre en utilisant les taux de rampe recommandés et les volumes de réaction spécifiés par le fabricant.
   10. Analysez les données ddPCR et dPCR à l’aide de diverses solutions logicielles, généralement fournies par le fabricant de l’instrument (par exemple, QX manager et QIAcuity Software Suite 1.2, respectivement). Pour les deux méthodes, ne sélectionnez que des dilutions d’échantillon avec un rapport adéquat de partitions/gouttelettes positives et négatives pour la quantification.
       REMARQUE : Pour la détermination des titres de particules rAAV (vp/mL ; vp = particules virales) à partir de lysats bruts et de matériaux purifiés à base de résine AAVX, un test immuno-enzymatique (ELISA) peut être utilisé., Divers kits ELISA sandwich standard disponibles dans le commerce pour la quantification des AAV sont disponibles (les kits utilisés dans ce travail sont répertoriés dans la table des matériaux). Effectuez le test conformément au(x) manuel(s) du fabricant. Assurez-vous que le kit ELISA utilisé est compatible avec le sérotype AAV produit.
5. Analyse du rapport de VP à partir de rAAV purifiés
   REMARQUE : Pour déterminer le rapport de protéine de capside virale (VP) de chaque échantillon provenant des puits individuels de la configuration de 24 puits profonds, il est possible d’effectuer un transfert Western standard ou des protocoles capillaires automatisés.
   1. Pour détecter les protéines de capside AAV2 VP1, VP2 et VP3, utilisez un anticorps monoclonal primaire anti-AAV VP1/VP2/VP3. Assurez-vous que l’anticorps primaire fonctionne avec le sérotype ou la variante de capside respective.
   2. Utilisez des témoins positifs appropriés, tels que les recombinants VP1, VP2 et VP3 ou un étalon de référence AAV.
   3. Préparez le témoin positif à un rapport moléculaire de 1:1:10 (VP1 :VP2 :VP3) pour imiter le rapport VP attendu. Cela sert également de référence pour la quantification du rapport VP à l’aide de l’intégration de la zone du signal.
   4. Sélectionnez un kit capillaire avec une gamme adaptée qui englobe les protéines de capside à détecter, y compris les plus petites (VP3 avec ~ 60 kDa) et les plus grandes (VP1 avec ~ 82 kDa). Cela peut varier en fonction du sérotype et de la variante de capside utilisée.
   5. Préparez les réactifs et l’échelle biotinylée fournis dans le kit selon les instructions du fabricant.
   6. Préparez une série de dilutions des échantillons (soit en fonction du titre génomique allant de 1 × 10,¹² vg/mL à 1 ×^{10, 10} vg/mL, soit des dilutions 1:2 à partir de l’échantillon non dilué à 1:64) dans le tampon de dilution fourni du kit afin d’assurer une bonne plage de détection pour chaque échantillon.
   7. Diluer l’anticorps primaire dans le tampon de dilution d’anticorps fourni conformément aux instructions du fabricant ou en fonction des tests précédents. Commencez par 1:100.
   8. Utilisez un kit de détection correspondant en fonction de la source de l’anticorps primaire.
   9. Chargez la plaque selon le schéma fourni avec le kit.
   10. Assurez-vous également de remplir les colonnes vides avec de l’eau ou un tampon de dilution d’échantillon pour ne pas endommager les capillaires de l’instrument en fonctionnant à sec.
   11. Couvrir la plaque d’un film d’étanchéité et centrifuger à 1200 × g, 5 min, à 4 °C.
   12. Transférez la plaque et les capillaires à l’instrument et utilisez des conditions standard prédéfinies pour le fonctionnement.
   13. Analysez la course à l’aide d’un logiciel d’analyse de données, tel que Compass (version 6.3.0)³⁸.
       REMARQUE : Pour analyser l’intégrité, la monodispersité et la pureté des particules, la microscopie électronique à transmission de coloration négative (ns-TEM) est recommandée. L’analyse TEM peut être effectuée comme décrit par Steininger et. al²⁵. Cependant, d’autres méthodes, telles que la photométrie de masse³⁹, la SEC-MALS⁴⁰ et la coloration des rubans⁴¹ , peuvent également fournir des lectures complémentaires pour évaluer la qualité des préparations rAAV.
6. Transduction avec des particules virales purifiées
   REMARQUE : Pour transduire des cellules avec des vecteurs viraux purifiés, une multiplicité d’infection (MOI) doit être déterminée. Le MOI est défini comme le nombre de génomes contenant des particules ajoutés par cellule. Il est important de noter qu’il s’agit d’une valeur théorique ; le nombre réel de génomes rAAV délivrés par cellule dépend de la capacité de la capside à transduire avec succès les cellules cibles. Par conséquent, le moment d’inertie optimal doit toujours être déterminé expérimentalement. Dans cette section, l’objectif était de comparer deux stocks de vecteurs viraux, produits à l’aide de méthodes de purification différentes (ultracentrifugation au chlorure de césium et résine d’affinité AAVX). À cette fin, des co-cultures neuronales d’origine humaine ont été transduites avec les deux préparations, et l’efficacité de la transduction a été évaluée à l’aide de la microscopie à fluorescence.
   1. Enduire une plaque inférieure optique noire à 96 puits de PLO à 0,1 % (Poly-L-Ornithine) pendant une nuit à 4 °C ou incuber à 37 °C pendant ≥ 1 h.
   2. Le jour de l’ensemencement, aspirer le réactif d’enrobage PLO et enrober avec la matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit et incuber à 37 °C pendant ≥1 h.
   3. Cultivez des motoneurones avec des astrocytes dans un rapport de 1:6 ou selon les recommandations du fournisseur.
   4. À 2 jours in vitro (DIV), transduire la co-culture à un MOI de 50 000.
   5. Décongeler les aliquotes virales à 4 °C.
   6. Préparez des milieux de transduction (vecteurs viraux au moment d’inertie souhaité sur la base des génomes viraux par cellule + milieux de culture cellulaire dans des volumes appropriés pour remplacer 50 % du milieu de culture par puits).
   7. Effectuez un échange de support de 50 % avec un support de transduction.
   8. À 5 DIV, effectuer un échange complet de milieu avec des milieux de culture réguliers.
   9. Maintenez les cellules avec un échange régulier de milieu de culture tous les 2-3 jours ou selon les recommandations du fournisseur.
   10. Surveillez les niveaux d’expression à l’aide d’un microscope à imagerie en direct équipé d’une excitation correcte pour le transgène rapporteur. Pour les neurones d’origine humaine, l’expression du plateau est observée entre 10 et 14 jours après la transduction (voir Figure 4A).

Pas	Tampon/Matériau	Volume du puits [μL]	Volume de travail [μL]	Cycles	Débit [μL/min]
1. Equilibration	Équilibration/ Laver I Tampon	1100	950	2	500
2.Chargement/ Capture	Échantillon de surnageant	550	500	4
3. Laver I	Équilibration/ Laver I Tampon	1100	950	2
4. Lavage II	Tampon Wash II	1100	950	2
5. Élution	Tampon d’élution	70 μL (20 μL Embouts en résine) 250 μL (80 μL d’embouts en résine)	60 μL (20 μL d’embouts en résine) 240 μL (80 μL Embouts en résine)	4
6. Neutralisation	Tampon de neutralisation	Ajoutez 1/4 du volume d’élution directement à chaque échantillon 70 μL d’échantillon élué → Ajouter 17,5 μL 250 μL d’échantillon élué → Ajouter 62,5 μL		-	-

Tableau 1 : Disposition des plaques et paramètres de purification pour la purification de résine d’affinité des rAAV.

Résultats

Ces dernières années, la demande de production de vecteurs AAV à l’échelle du laboratoire a considérablement augmenté, ce qui a conduit à la création de nombreux organismes de recherche sous contrat offrant ce service en tant que service⁴². Compte tenu des coûts élevés et des délais souvent associés à l’externalisation, la production interne de rAAV reste une option attrayante. En particulier, les protocoles à haut débit qui minimisent la consommation de matériaux et les heures de travail tout en intégrant des étapes de purification sont très bénéfiques dans le pipeline de développement de médicaments.

Ce protocole décrit deux configurations à haut débit pour la production de rAAV : une approche micro-6 puits utilisant des cellules adhérentes et un protocole mini-HT24 pour les cellules en suspension (voir aperçu dans la figure 1). La configuration micro-6 puits utilise des cellules HEK293T adhérentes pour produire du rAAV dans un format à 6 puits. Ce matériel a été utilisé pour évaluer les effets de deux réactifs de transfection de l’Île-du-Prince-Édouard et du chlorure de sodium (NaCl) disponibles dans le commerce sur la production de rAAV2 (figure 2A). Ici, différents paramètres ont été suivis en même temps : (i) la viabilité de la cellule productrice et l’efficacité de la transfection à l’aide d’un transgène GFP (Figure 2B et Figure supplémentaire 1), et (iii) le pourcentage de cellules GFP-positives (GFP+) après transduction avec des lysats bruts (Figure 2C). L’expérience de transduction a servi de lecture indirecte peu coûteuse et rapide des titres et des fonctionnalités des vecteurs. Il est intéressant de noter que des rapports plus faibles entre le réactif de transfection et l’ADN étaient suffisants pour favoriser une production efficace de vecteurs (Figure 2B) tout en maintenant une bonne viabilité cellulaire. De plus, l’ajout de 150 mM de NaCl est apparu bénéfique, en particulier lors de l’utilisation du réactif PEIpro. La réalisation de cette expérience à l’échelle microscopique offrait plusieurs avantages : (i) un flux de travail rapide, l’ensemencement cellulaire, la transfection et la récolte de vecteurs étant terminés en une semaine ; (ii) compatibilité avec les tests analytiques standard en aval ; et (iii) une large applicabilité à tous les sérotypes AAV.

Pour les applications nécessitant de plus grandes quantités de vecteurs rAAV, telles que les expériences in vivo ou les études cinétiques in vitro (où une gamme plus élevée ou plus large de MOI est appliquée), une mise à l’échelle est nécessaire. Pour établir un protocole mini-HT24 qui fournit suffisamment de matériel pour la purification à haut débit, des cellules en suspension ont été utilisées. Par rapport aux cellules adhérentes, les cultures en suspension offrent une meilleure évolutivité et sont plus économes en espace, car elles ne sont pas limitées par la surface. Étant donné que les cellules en suspension se développent librement dans le milieu, elles peuvent occuper tout le volume de culture, ce qui facilite la mise à l’échelle en trois dimensions. Cela permet d’obtenir des densités cellulaires plus élevées par rapport aux cultures en couches. De plus, les systèmes de suspension sont plus faciles à entretenir et à traiter car aucune étape de détachement n’est nécessaire pendant le passage ou la récolte. L’uniformité de la production de rAAV dans le format à 24 puits a été évaluée en analysant trois paramètres clés sur la plaque (Figure 3) : (A) Titre de particules (vp/mL) ; (B) rapport de VP dans la capside ; (C) Titre génomique (vg/mL) et (D) Rapport vide/plein.

Bien qu’une certaine variabilité ait été observée entre ces paramètres, elle est restée largement dans une fourchette de deux ordres, ce qui correspond à la marge d’erreur de mesure. L’expression de la protéine VP a également été évaluée à l’aide d’une analyse automatisée par western blot (figure 3E). Enfin, une comparaison des rendements totaux obtenus à partir de la production de micro-6 puits, de mini-HT24 et de production à moyenne échelle (flacon agité) est présentée pour guider le choix de l’échelle appropriée en fonction des exigences expérimentales et des besoins analytiques en aval (figure 3F).

Un aspect essentiel de tout protocole de purification AAV est l’évaluation de la pureté et de la puissance du vecteur. Ici, les vecteurs purifiés à la résine ont été comparés côte à côte à ceux purifiés à l’aide d’une méthode d’ultracentrifugation (CU) en deux étapes à base de chlorure de césium (CsCl) (Figure 4). Une puissance comparable entre les deux préparations a été observée par microscopie à fluorescence, comme le démontre la transduction réussie des motoneurones et des astrocytes (Figure 4A). L’analyse en microscopie électronique n’a révélé aucune différence significative dans la forme des particules ou l’état d’agrégation. Cependant, il y avait une légère tendance indiquant que la purification du CsCl produisait plus systématiquement des préparations plus propres (figure 4B).

Figure 1 : Vue d’ensemble des approches de production et de préparation des rAAV. Cette figure illustre les méthodes de production du rAAV, allant des flacons agités à l’échelle midi aux cultures en suspension mini-HT24 et aux cultures adhérentes micro-6 puits. Ces approches permettent la génération de rAAV à différentes échelles, en utilisant différentes stratégies de lyse cellulaire et de purification de vecteurs. La caractérisation finale des rAAV comprend généralement la qPCR/dPCR pour la quantification du génome viral (vg/mL), l’ELISA pour la détermination du titre de capside (vp/mL) et les tests de transduction cellulaire pour évaluer l’activité biologique. Créé dans BioRender. Ohland, P. (2025) https://BioRender.com/x3sfbdd. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Optimisation du protocole de transfection pour la production de rAAV à micro-6 puits. (A) Vue d’ensemble schématique de l’expérience avec les paramètres testés et les lectures analytiques. (B) HEK293T cellules ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits à une densité de 0,5 × 10⁶ cellules/puits 24 h avant la transfection. Différentes quantités d’ADN, types d’IPE (Pro ou Max), ratios et concentrations de NaCl ont été testés. (C) Pourcentage de cellules HEK293A GFP positives (GFP+) 72 h après la transduction avec des volumes égaux de lysats du panel A (10 μL chacun). Pour simplifier, seule la condition de l’ADN qui a entraîné les rendements vectoriels les plus élevés (2650 ng) est indiquée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Caractérisation analytique du rAAV produit dans une configuration mini-HT24 et comparaison des titres à différentes échelles. (A) Analyse ELISA des titres de capside du rAAV purifié dans chaque puits. Les valeurs sont représentées par des variations supérieures au titre moyen de particules de la plaque après purification. Les titres attendus dépendent de la capside AAV utilisée et du transgène emballé. Les titres de particules pour différents vecteurs AAV variaient entre 10¹¹ et 10¹² VP/mL élevés. (B) Analyse du rapport VP par WES du rAAV purifié provenant des puits indiqués. Les AAV2 recombinants VP1, VP2 et VP3 ont été utilisés comme témoins positifs à un rapport molaire de 1:1:10. (C) l’analyse dPCR du rAAV purifié de chaque puits. Les valeurs sont indiquées sous forme de variations au-dessus du titre génomique moyen de la plaque après purification. Les titres attendus dépendent de la capside AAV utilisée et du transgène emballé. Les titres génomiques des différents vecteurs AAV variaient entre 10¹⁰ (rAAV2) et 10¹¹ vg/mL (rAAV9, non illustré ici). (D) Rapport vide/plein (E/F) des puits indiqués, basé sur les résultats génomiques et les titres de particules des panneaux A et C. Les valeurs sont normalisées en fonction de la moyenne sur plaque. La moyenne E/F au format mini-HT24 pour rAAV2 est de 10,6 % ± 3,0 % après purification de la résine d’affinité AAVX. (E) Analyse par transfert western capillaire des protéines VP dans des échantillons rAAV2 purifiés de chaque puits. (F) Comparaison des rendements totaux du génome viral en tenant compte des volumes finaux d’échantillons et de la concentration de chaque méthode. Les données sont présentées sous forme de différence de pliage moyenne sur le format le plus petit (micro-6 puits), avec des barres d’erreur indiquant l’écart-type (ET) par rapport aux réplicats biologiques. Pour une production à haut débit de 24 puits profonds avec purification de résine d’affinité AAVX, ET = ±0,176 (n = 24) ; pour la sonication micro-6 puits ; ET = ±0,349 (n = 6) ; et pour une production standard à moyenne échelle avec purification par gradient de CsCl, ET = ±134,70 (n = 2). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Comparaison de la puissance et de la pureté entre des échantillons rAAV purifiés à la résine à haut débit (HT) et des échantillons standard purifiés au CsCl. (A) Les motoneurones et les astrocytes d’origine humaine ont été transduits avec la même construction rAAV exprimant le rapporteur de fluorescence mRuby3 sous le promoteur de synapsine humaine en tant que rapporteur à un MOI de 50 000. Les images de microscopie à fluorescence ont été capturées à l’aide d’un microscope à imagerie en direct sept jours après la transduction (DPT). Les rAAV ont été purifiés à l’aide de la méthode standard du gradient CsCl (en haut) ou de l’approche basée sur la pointe de résine d’affinité HT AAVX (en bas). Des échantillons purifiés au CsCl ont été exposés à un cycle supplémentaire de congélation-décongélation avant que la transduction ne soit effectuée et comparés à des rAAV purifiés à la résine. (B) Analyse par microscopie électronique à transmission (MET) de variants basés sur le sérotype rAAV2 purifiés par gradient CsCl (en haut) et méthodes de pointe de résine HT (en bas). Deux lots d’échantillons purifiés à la résine HT de rAAV2 peuvent être comparés sans dialyse (en bas à gauche) et avec dialyse (en bas à droite). Les rapports vide-plein (E/F) ont été déterminés à l’aide de la MET comme étant remplis à > 90 % pour les échantillons purifiés par ultracentrifugation à gradient de CsCl et <à 40 % pour les échantillons purifiés par résine d’affinité AAX. Barre d’échelle = 100 nm. Le panneau B montre des images représentatives de lots purifiés à l’aide des méthodes indiquées. Veuillez noter que ces images n’appartiennent pas aux mêmes préparations que celles utilisées pour les expériences de transduction montrées dans le panneau A. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Transfection de cellules HEK293T pour la production de rAAV2-GFP à l’aide de la configuration micro-6 puits. Diverses quantités d’ADN, concentrations de NaCl (en mM), produits de l’IPE et rapports PEI-ADN ont été utilisés pour la transfection (comme décrit à la figure 2). Les images ont été prises 72 h après la transfection en utilisant le même temps d’exposition (320 ms). Des images représentatives de la microscopie à fond clair et à fluorescence sont présentées dans cette figure. Grossissement : 10X. Barre d’échelle non illustrée ; L’image est fournie à titre d’illustration et d’évaluation qualitative uniquement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce document de protocole décrit des méthodes efficaces pour produire du rAAV à haut débit et à petite échelle en utilisant à la fois des cellules adhérentes et en suspension. Ces méthodologies répondent à la demande croissante de processus de production de rAAV évolutifs et flexibles qui soutiennent la recherche préclinique tout en minimisant le temps, les coûts et la consommation de ressources.

Les systèmes de cellules adhérentes et en suspension offrent des avantages et des défis distincts pour la production de rAAV à petite échelle. Les systèmes cellulaires adhérents, tels que les cellules HEK293T²⁸ cultivées dans des formats de plaques multipuits, sont particulièrement bien adaptés à la conception de vecteurs à un stade précoce et aux études comparatives. Leur compatibilité avec les protocoles de culture et de transfection établis permet une mise en œuvre simple dans la plupart des laboratoires. Par exemple, Grosse et al. a utilisé la production à petite échelle dans des plaques à 6 puits pour étudier la fonctionnalité de l’AAP, une protéine cruciale pour l’assemblage de la capside virale²². Drittanti et al. ont produit des vecteurs rAAV dans des plaques de 96 puits pour évaluer la cinétique de la réplication du rAAV et tester les effets de différents auxiliaires de l’adénovirus sur la production de rAAV²³. Notamment, dans cette dernière étude, un test de réplication utilisant des cellules HeLa spécialisées exprimant AAV Rep et Cap pour amplifier davantage le signal a été décrit. Plus récemment, Quan et al. ont appliqué un protocole de production à haut débit de 384 puits dans le contexte d’un criblage de siRNA, rapportant des titres relatifs^{de 24}. Cependant, compte tenu de la quantité limitée de matériel, il n’est toujours pas certain combien de tests et de lectures peuvent être effectués, ou si des MOI suffisants peuvent être obtenus dans les expériences de transduction cellulaire au-delà de la mesure des protéines fluorescentes, ce qui pourrait avoir un impact sur la reproductibilité.

Dans ce travail, la production à base de micro-6 puits dans des cellules de HEK293T adhérentes a été utilisée pour optimiser les conditions de culture du rAAV2 (Figure 1 et Figure 2). Conformément aux études et rapports techniques précédents ^43,44, des rapports PEI/ADN plus faibles et l’ajout de NaCl pendant la transfection ont eu un impact positif sur la production de rAAV. Cela s’est reflété indirectement dans l’efficacité de transduction des vecteurs produits dans HEK293A cellules. Les différences frappantes observées avec les rapports PEI :ADN plus faibles ont été principalement attribuées au stress cellulaire, comme l’indique la faible viabilité cellulaire, en particulier avec PEIpro. Bien que les effets aient été moins apparents dans des conditions PEImax, les images de microscopie ont révélé des zones acellulaires dans la couche cellulaire, indiquant un stress ou un détachement cellulaire (figure supplémentaire 1).

Il est important de noter que ces résultats n’étaient pas directement applicables à la production de vecteurs dans des cultures en suspension, soulignant que les conditions expérimentales améliorant la production de rAAV dans les cellules de HEK293T adhérentes peuvent ne pas toujours se traduire par des cellules en suspension, même lorsque le type de cellule sous-jacent reste le même. Cet écart pourrait être attribué à des différences aux niveaux transcriptomique et protéomique entre ces deux systèmes⁴⁵. Par conséquent, un alignement plus étroit avec les processus de production clinique peut nécessiter l’utilisation de cultures en suspension dans les premières phases de développement. S’appuyant sur ces observations et sur l’avantage d’obtenir des densités cellulaires plus élevées en suspension, un système de 24 puits profonds a été adopté pour produire du rAAV dans des cultures en suspension à mini-échelle (mini-HT24). Ce système a fait l’objet d’une validation approfondie, démontrant des titres vg/mL et vp/mL constants sur toute la plaque, ainsi qu’une expression et des rapports uniformes de la protéine VP (figure 3A-E). En effet, les densités cellulaires plus élevées obtenues dans la configuration mini-HT24 (3 × 10⁶ cellules/mL) par rapport au format micro-6 puits (5 × 10⁵ cellules par puits) ont entraîné des titres de rAAV plus élevés, comme le montre la figure 3F. Cela met en évidence un avantage clé des systèmes en suspension, qui ne sont pas limités par la surface du récipient de culture. Cependant, la mise en œuvre de tels systèmes nécessite de l’équipement spécialisé qui n’est peut-être pas disponible dans tous les laboratoires. Enfin, il est recommandé de valider davantage les molécules de plomb identifiées ou les conditions de culture supérieures du système mini-HT24 à l’aide de systèmes de minibioréacteurs tels que AMBR15 ou AMBR250, car il a été démontré que ces systèmes imitent plus fidèlement les conditions de production dans les grands bioréacteurs^46,47.

Le choix du niveau de purification joue un rôle crucial dans la détermination de l’adéquation des préparations rAAV pour des applications spécifiques en aval. Les lysats bruts, dérivés à la fois de cultures adhérentes (micro-6 puits) et de cultures en suspension (mini-HT24), offrent une option rapide et économe en ressources pour les tests de dépistage préliminaires. Ces lysats contiennent un mélange de particules virales, de débris cellulaires et de composants de milieux, ce qui est acceptable pour des applications telles que la génomique vectorielle/titre de particules, le criblage de l’efficacité de transduction et l’analyse par transfert Western. Particulièrement applicable dans les études portant sur des questions biologiques fondamentales (comme illustré ci-dessus dans l’étude de la fonctionnalité de l’AAP), l’optimisation de l’état de la culture cellulaire et le criblage et la sélection précliniques des candidats. Cependant, la présence d’impuretés peut nécessiter des dilutions plus élevées, ce qui entraîne des sensibilités de dosage plus faibles. De plus, les impuretés peuvent affecter négativement la viabilité des types de cellules sensibles, tels que les cellules primaires.

Contrairement aux lysats bruts, les préparations purifiées à base de résine d’affinité AAVX, utilisées exclusivement dans le protocole à base de suspension, atteignent un niveau de pureté plus élevé en isolant sélectivement les capsides intactes. Cela permet de surmonter les limites des lysats cellulaires bruts, ce qui rend ces préparations plus adaptées à des applications telles que les études in vivo , ainsi que les analyses in vitro détaillées de la cinétique d’expression des transgènes et les lectures fonctionnelles précises, qui nécessitent souvent de plus grandes quantités de matériau (voir la comparaison des rendements dans la figure 3F). Pour les applications in vitro , les rendements des vecteurs rAAV produits dans le réglage mini-HT24 étaient généralement suffisants pour la majorité des lectures, en fonction du nombre de cellules et des MOI requis. En revanche, les applications in vivo nécessitent généralement une production à des échelles de flacons midi-shake ou plus grandes, en fonction de la dose, de la voie d’administration et du modèle animal. Malgré l’augmentation des coûts et du temps nécessaires à la purification, la cohérence et la fiabilité du matériau résultant justifient souvent l’investissement pour des cas d’utilisation critiques. Notamment, les résultats présentés dans la figure 4 démontrent que les vecteurs rAAV purifiés à l’aide de méthodes de résine d’affinité ont des performances comparables à ceux purifiés par ultracentrifugation traditionnelle au chlorure de césium (CsCl). Cela est conforme aux observations précédentes selon lesquelles les capsides vides n’ont aucun effet sur la transduction ou peuvent même l’améliorer, selon les espèces d’AAV présentes⁴⁸. Il est important de noter, cependant, qu’un seul moment d’inertie et un seul point temporel ont été utilisés dans cette expérience, et que les conditions optimales doivent être déterminées individuellement pour chaque type de cellule. Alors que la purification par CsCl produit généralement un fond plus propre, les AAV purifiés par pointe de résine HT montrent une plus grande variabilité de pureté (voir les images TEM dans la figure 4). Collectivement, ces résultats soutiennent l’adoption de flux de travail à haut débit et à petite échelle.

L’utilisation d’embouts remplis de résine d’affinité à petite échelle dans la purification à haut débit offre une solution pratique pour le criblage rapide du rAAV, mais plusieurs aspects techniques nécessitent une attention particulière pour garantir des résultats fiables. En raison du volume limité du lit de résine, ces pointes sont particulièrement sujettes au colmatage, en particulier lors du traitement des lysats bruts. Par conséquent, la clarification des lysats par centrifugation à grande vitesse est essentielle pour éliminer les débris cellulaires avant le chargement, car une clarification insuffisante peut réduire les débits et compromettre le rendement. Pour la configuration mini-HT24, il est recommandé d’optimiser les protocoles de transfection et de maintenir un volume de travail maximal de 2,5 à 3 ml par puits. Lorsque l’on travaille avec différents sérotypes ou bibliothèques de capsides, il est conseillé de tester différents types de résines d’affinité, car l’efficacité de liaison et la récupération peuvent varier en fonction de la structure de la capside⁴⁹. Le système de pipetage électronique multicanaux portable permet une intégration facile de ce flux de travail dans les petits laboratoires, offrant une flexibilité sans avoir besoin d’automatisation. Cependant, la manutention manuelle peut introduire de la variabilité et des différences d’un lot à l’autre. Pour plus d’uniformité, les plates-formes automatisées de manipulation des liquides peuvent être bénéfiques. Une attention particulière doit être portée à éviter la contamination croisée lors de l’ajout d’échantillons et de tampons, et l’utilisation de formats de plaques appropriés avec un volume de puits adéquat est essentielle pour éviter les débordements. En tenant compte de ces considérations, notamment la clarification des échantillons, l’optimisation du protocole, la sélection de la résine et le pipetage minutieux, les chercheurs peuvent minimiser les problèmes techniques et améliorer la robustesse et la reproductibilité des flux de travail de purification d’affinité à haut débit et à petite échelle.

En conclusion, la combinaison de méthodes de production de rAAV à haut débit et à petite échelle avec des stratégies de purification spécifiques à l’application fournit une plate-forme polyvalente pour faire progresser la recherche sur la thérapie génique. Ces protocoles répondent à la demande croissante de flux de travail rentables et efficaces tout en conservant la flexibilité nécessaire pour répondre à diverses exigences expérimentales. En équilibrant les compromis entre la pureté, l’évolutivité et la consommation de ressources, les chercheurs peuvent accélérer le développement préclinique et faciliter la transition vers les applications cliniques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,9 % de solution saline non tamponnée	B. Braun, Melsungen, Allemagne	7647-14-5	Tampon Wash II
1 M d’acide hydrochlorcirc	Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, États-Unis	1099700050	Ajustement du pH des tampons
10x tampon DNase I	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	AM8170G	ddPCR/dPCR
1 M de Tris-HCl, pH 9,0	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	J60707. AP	Tampon de neutralisation
Microplaques à 24 puits profonds	Enzyscreen, Heemstede, Pays-Bas	CR1424cl	Matériel de culture en suspension
Erlenmeyer en polycarbonate de 250 ml avec capuchon d’aération	Corning, New York, NY , États-Unis	431144	Matériel de culture en suspension
Séparation 66 - 440 kDa Cartouches capillaires 8x25	BioTechne, Minneapolis, Minnesota, États-Unis	Référence SM-W008	Kit de transfert Western automatisé
96 puits 2,2 mL de polypropylène DeepWell  ;	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	AB0661	Plaque de traitement et de stockage d’échantillons
Plaque inférieure noire / transparente à 96 puits, surface TC	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	165305	Essais de transduction
AAV2 VP1, protéine recombinante	PROGEN, Heidelberg Allemagne	640823	Réactif Wes
AAV2 VP2, protéine recombinante	PROGEN, Heidelberg Allemagne	640824	Réactif Wes
AAV2 VP3, protéine recombinante	PROGEN, Heidelberg Allemagne	640825	Réactif Wes
AAV2 Xpress ELISA	PROGEN, Heidelberg Allemagne	PRAAV2XP	Utilisé pour les échantillons purifiés de résine HT.
Module de détection anti-souris pour Wes	BioTechne, Minneapolis, Minnesota, États-Unis	DM-002	Kit de transfert Western automatisé
Amorce directe spécifique au dosage/modèle	Coutume	Coutume	ddPCR/dPCR
Sonde spécifique au test/modèle	Coutume	Coutume	ddPCR/dPCR
Amorce inverse spécifique au test/modèle	Coutume	Coutume	ddPCR/dPCR
BalanCD HEK293 - Liquide	FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC INC, Santa Ana, CA, États-Unis	NC1192689	Milieu pour la culture cellulaire en suspension
Albumine sérique bovine  ;	Électrophorèse SEVA, Heidelberg, Allemagne	cAlbumine sérique bovine	Supplément pour milieu cellulaire adhérent
Film de rayonne respirant, stérile	VWR International LLC, Radnor, Pennsylvanie, États-Unis	391-1262	Matériel de culture en suspension
Thermocycleur C1000	Bio-Rad Laboratories, Hercules, États-Unis	1851096	ddPCR
Kit ELISA de fuite de ligand CaptureSelec AAVX	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	8113522000	TEST ELISA
Analyseur Cedex HiRes  ;	Roche Holding AG, Bâle, Suisse	5650216001	Compteur de cellules
Microplaque de culture cellulaire, 96 puits	Greiner Bio-One, Kremsmü ; nster, Autriche	655162	Équipement de culture cellulaire adéquat
Acide citrique	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis	5949-29-1	Réactif de purification ; PRUDENCE
Caméra TEM basée sur CMOS TVIPS XF416  ;	Tietz Video and Image Processing Systems GmbH, Gilching, Allemagne	XF416  ;	Système de traitement vidéo et d’image
Logiciel Compass (version 6.3.0)	BioTechne, Minneapolis, Minnesota, États-Unis		Logiciel WES
Plaques à puits multiples transparentes à 6 puits Costar traitées TC	Corning, New York, NY , États-Unis	;   ; 3516	Équipement de culture cellulaire adéquat
Huile pour générateur de gouttelettes ddPCR  ;	Bio-Rad Laboratories, Hercules, États-Unis	#1864110	réactif ddPCR
Huile de lecteur de gouttelettes dddPCR  ;	Bio-Rad Laboratories, Hercules, États-Unis	#1863004	réactif ddPCR
ddPCR Supermix pour sondes (sans dUTP)  ;	Bio-Rad Laboratories, Hercules, États-Unis	#1863023	réactif ddPCR
DMEM, hyperglycémie	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	11960044	Milieu pour la culture cellulaire adhérente
DMEM, faible teneur en glucose	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	11885084	Milieu pour la culture cellulaire adhérente
Plaques à 96 puits à faible liaison de l’ADN	Eppendorf, Hambourg, Allemagne	30129504	ddPCR/dPCR
Tubes à faible liaison de l’ADN	Eppendorf, Hambourg, Allemagne	30108051	ddPCR/dPCR
Le	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	14190094	Tampon de lavage
Grilles EM (T600H-Cu 698 l/inch Maille hexagonale Barre mince ; EMS)	Sciences de la microscopie électronique, Hatfield, Pennsylvanie, États-Unis	FFTH600-Cu-UL	Analyse par microscopie électronique
Système d’imagerie EVO M5000	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	AMF5000	Microscope à imagerie en direct pour les tests de transduction
EZ Standard Pack 3	BioTechne, Minneapolis, Minnesota, États-Unis	PS-ST03EZ-8	Kit de transfert Western automatisé
Falcon 15mL Tubes à centrifuger coniques	Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne	11507411	Traitement des échantillons
Falcon 50mL Tubes de centrifugation coniques	Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne	10203001	Traitement des échantillons
Geltrex LDEV-Free Matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	; A1413201	Revêtement de plaque de culture
Supplément GlutaMAX (L-Alanyl-L-Glutamine)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	35050061	Supplément pour milieu cellulaire adhérent
HEK293A	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	Réf. R70507	Essais de transduction (à des fins de recherche seulement)
HEK293T	ATCC, Manassas, Virginie, États-Unis	CRL-3216	Culture cellulaire adéquate, utilisée pour la production de rAAV (à des fins de recherche uniquement)
Solution HEPES, 1M	Merck, Darmstadt, Allemagne	#H0887	Supplément pour milieu cellulaire adhérent
Nucléase active HL-Salt, SAN (25 U/µ ; L)	ArcticZymes Technologies, Tromsø ;, Norvège	70910-202	ddPCR/dPCR
Laveuse de microplaques HydroSpeed	Tecan, Mä ; nnedorf, Suisse	30190101	TEST ELISA
Kit d’astrocytes iCell, 01434	FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., Madison, WI, États-Unis	Réf. R1092	Essais de transduction
Kit de motoneurones iCell, 01279	FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., Madison, WI, États-Unis	Réf. R1051	Essais de transduction
Infini 200 PRO	Tecan, Mä ; nnedorf, Suisse	30213617	TEST ELISA
Le JEM-1400Plus est un microscope électronique à transmission	JEOL Ltd., Akishima, Tokyo, Japon	JEM-1400Plus	microscope électronique à transmission
Couvercle sandwich à faible évaporation avec goupilles	Enzyscreen, Heemstede, Pays-Bas	CR1224c	Matériel de culture en suspension
Lecteur de microplaques  ; SpectraMax i3	Dispositifs moléculaires, San Jose, Californie, États-Unis	i3x	TEST ELISA
Anticorps monoclonal anti-AAV2 VP1/VP2/VP3 de souris	PROGEN, Heidelberg Allemagne	690058	Réactif Wes
Eau sans nucléases  ;	Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne	3036430103	ddPCR/dPCR
Opti-MEM, Sérum Réduit Medium  ;	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	#31985070	Milieu pour la formation du complexe PEI-ADN
PBS  ;	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	#10010023	Tampon de lavage
PEI-MAX, polyéthylèneimine, 1 mg/ml de pâte	Polysciences Europe,  ; Hirschberg an der Bergstraß ; e, Allemagne	24765 ou 24765	Réactif de transfection
PEIpro	Polyplus, Illkirch-Graffenstaden, France	101000033/10mL	Réactif de transfection
Plaque de microdialyse Pierce, 96 puits, 0,3 mL, 20K MWCO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	N° A50472	Équipement de purification
Poloxamère 188	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis	P5556-100mL	Réactif de culture cellulaire ; PRUDENCE
Solution de poly-L-Ornithine (0,01 %)	Sigma-Aldrich	A-004-M	Essais de transduction
Solution de protéinase K (20 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	25530049	ddPCR/dPCR
ProtéineSimple " Wes"	BioTechne, Minneapolis, Minnesota, États-Unis	004-600	Dispositif pour Western Blot automité
Système de plate-forme QIAcuity Eight	Qiagen, Hilden, Allemagne	911052	DPCR
QIAcuity Nanoplate 8.5k 96 puits	Qiagen, Hilden, Allemagne	250021	ddPCR/dPCR
Kit PCR de sonde QIAcuity	Qiagen, Hilden, Allemagne	250101, 250102 ou 250103	ddPCR/dPCR
Suite logicielle QIAcuity 1.2	Qiagen, Hilden, Allemagne		Logiciel dPCR
Gestionnaire QX  ;	Bio-Rad Laboratories, Hercules, États-Unis		Logiciel ddPCR
Lecteur de gouttelettes QX200	Bio-Rad Laboratories, Hercules, États-Unis	1864003	ddPCR
Microtube à bouchon à vis, 1,5 ml, testé pour les performances PCR	Sarstedt, Nü ; mbrecht, Allemagne	72.703.416	Matériel de culture en suspension
Bouchon à vis, DNA LoBind, 5,0 mL	Eppendorf, Hambourg, Allemagne	30122348	Matériel de culture en suspension
Incubateur Shaker	Infors AG, Bottmingen, Suisse	Multitron	Matériel de culture en suspension
Pyruvate de sodium (100 mM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	11360070	Milieu pour la culture cellulaire adhérente
Système de klaxon de microplaque de sonicateur	QSonica, Newtown, CT, États-Unis	Q700MPXC	Sonicateur utilisé pour la production de lysat brut
ESPRIT			Lien vers la base de données SPIRIT : https://spirit.cladiac.com/aav.html  ;
Steriflip-GP Unité de filtration supérieure de tube de centrifugeuse stérile	Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, États-Unis	SCGP00525	Équipement de préparation de tampon
T-175, FLACON DE CULTURE CELLULAIRE, 550 ML, 175 CM² ;	Greiner Bio-One, Kremsmü ; nster, Autriche	660175	Équipement de culture cellulaire adéquat
Trypsine/EDTA 0,025 %	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	R001100	Réactif de culture cellulaire
Cellules de production de virus 2.0 (VPC2.0)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	A49784 ou A51218	Production de rAAV
		J63596. K2	Diluer 1:10 pour la solution de travail PBST