Article de méthode

Production par microbioréacteurs de cellules stromales mésenchymateuses dépendantes de l’ancrage, prêtes au syndrome de détresse respiratoire aiguë

DOI :

10.3791/68650

⸱

12 décembre 2025

 ,  ,  , 
1Harvard-MIT Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 2Departments of Materials Science & Engineering and Biomedical Engineering, Cornell University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocole est décrit pour la production de cellules dépendantes de l’ancrage micro-micro-microopérateur comme thérapies cellulaires potentielles. En ciblant un cas d’utilisation du syndrome de détresse respiratoire aiguë, un rendement cellulaire comparable et une expression génique favorable par rapport aux conditions de processus basées sur des flasques sont illustrés. Ce protocole est extensible à d’autres cellules dépendantes de l’ancrage et aux indications de cibles.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La thérapie cellulaire est une approche thérapeutique émergente pour une variété de pathologies. Cependant, produire des quantités suffisantes de cellules de qualité reste un défi scientifique et technique actif. Le produit cellulaire final ne peut pas être stérilisé ; Par conséquent, la stérilité et les considérations de qualité par conception sont primordiales. Pour les cellules dépendantes de l’ancrage, l’expansion par flasque est encore utilisée à l’échelle du développement et industrielle, nécessitant de grandes empreintes physiques, limitant le contrôle de l’environnement biochimique (pH,CO2 etO2, gradients de diffusion des nutriments et métabolites), et fournissant des indices physiques pouvant affecter la qualité finale des cellules. Ces défis ont motivé l’adoption d’approches de fabrication basées sur des bioréacteurs, mais ces approches se déroulent généralement à des échelles volumétriques qui posent des défis et peuvent être coûteuses pour la recherche exploratoire sur le laboratoire ou le développement de procédés. La production de thérapies cellulaires micro-porteurs a été rapportée comme fournissant un contrôle biochimique lors de la culture pour un cas test de type source cellulaire - les cellules stromales mésenchymates. Pour une évaluation initiale de la qualité cellulaire in vitro, le syndrome de détresse respiratoire aiguë a été envisagé comme un cas d’utilisation potentiel. L’approche illustrée ici permet un développement rapide des procédés à l’échelle du laboratoire grâce au petit volume (2 mL) et au contrôle biochimique strict du microréacteur. Pour y parvenir, pour un type cellulaire dépendant de l’ancrage tel que les cellules stromales mésenchymates, il a fallu une modification substantielle du processus du microbioréacteur et a été utilisée une plateforme de microporteurs gélatineux produite en interne par un procédé microfluidique. Ici, des détails supplémentaires sont illustrés sur les paramètres de la méthode et du processus utilisés pour cultiver de telles cellules dépendantes de l’ancrage dans le microbioréacteur, dans le but de permettre à d’autres chercheurs d’adapter ces pratiques à leurs propres cas d’usage et types de sources cellulaires.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’utilisation des cellules vivantes comme produit thérapeutique s’est récemment imposée comme une nouvelle option thérapeutique prometteuse pour plusieurs défis de santé. Par exemple, les lymphocytes T du récepteur chimérique antigénique (CAR) ont apporté une rémission durable chez les personnes atteintes de ce qu’on appelle des cancers liquides — leucémie, lymphome et myélome multiple — qui étaient réfractaires à tous les traitements précédemmentdisponibles 1. Plus récemment, un produit mésenchymatose à cellules souches/stromales (MSC) (Ryoncil) a été approuvé pour traiter les enfants souffrant de la maladie aiguë greffe contre hôte réfractaire aux stéroïdes (SR-aGvHD), une affection > mortalitéde 50 % 2. Mais l’extension à d’autres besoins cliniques non satisfaits nécessite un développement intensif à la fois de la thérapie et des moyens de développer et de fabriquer ce produit.

Un de ces besoins cliniques non satisfaits se trouve chez les personnes souffrant du syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Le SDRA est abordé ici afin de fournir un cas d’usage spécifique illustrant la méthode, les résultats et la discussion des extensions possibles à d’autres cibles pathologiques. Un indicateur critique (progression en heures à jours), répandu (> 200 000 cas annuels aux États-Unis) et mortel (mortalité de 27 % à 46 %, selon la gravité de la présentation), le SDRA a attiré une attention renouvelée et largement diffusée pendant la pandémie de COVID-19 en tant que mécanisme typique de décès chez les patients infectés par le SARS-CoV-2 3,4. Le SDRA se caractérise par une perméabilité pulmonaire accrue, entraînant un œdème interstitiel, une débordement alvéolaire et une infiltration des composants cellulaires, y compris les neutrophiles et les globules rouges, dans le compartimentalvéolaire 5. Dans la phase exsudative initiale du SDRA, l’inflammation innée médiée par les cellules immunitaires provoque ces effets pathogènes en endommageant l’intégrité de la barrière endothéliale et épithéliale et en favorisant le recrutement et l’activation des cellules immunitaires par sécrétion de cytokines pro-inflammatoires ; La résolution réussie de la réponse inflammatoire, la réparation de l’intégrité de la barrière et l’évitement d’une fibrose excessive sont essentiels pour la survie3. Bien que les thérapies antivirales telles que le Remdesivir aient montré des résultats prometteurs pour lutter contre le SDRA médié par le SARS-CoV-2, pour d’autres étiologies, il n’existe actuellement aucune intervention pharmacologique approuvée permettant de réduire lamortalité 5.

Les CMS peuvent offrir une approche prometteuse pour traiter le SDRA, compte tenu de leur tropisme spécifique aux poumons lors de l’injection systémique et de leur capacité à sécréter des signaux paracrins immunomodulateurs dans leur microenvironnementenvironnant 6,7. Des études mécanistes ont impliqué l’expression de facteurs paracrines tels que l’interleukine-10 (IL-10)8, l’indoléamine 2,3-dioxygénase 1 (IDO1)9, la prostaglandine E2 (PGE2)10, et d’autres dans la stimulation de la puissance thérapeutique supposée de la MSC pour de multiples indications, notamment la lésion pulmonaire aiguë (ALI)/SDRA11 ; par conséquent, les niveaux d’expression de ces produits géniques représentent des attributs potentiellement critiques de qualité (pCQAs) qui peuvent prédire l’efficacité clinique, fournissant des critères de libération efficaces pour le produit cellulaire final lors de la fabrication. Cependant, produire suffisamment de cellules pour atteindre une dose thérapeutique efficace est difficile ; Le ryoncil, par exemple, est indiqué pour une dose à 2 x 106 cellules/kg de masse patiente, administré deux fois par semaine pendant 4 semaines12. Pour un patient de 80 kg, cela équivaut à >1,2 milliard de MSC pour un seul traitement, nécessitant une grande surface physique pour accueillir une surface suffisante pour cette condition de croissance 2D. Étant donné que ce produit à cellules vivantes ne peut pas être stérilisé avant l’administration du patient sans nuire au potentiel thérapeutique des cellules, l’utilisation des directives actuelles de bonnes pratiques de fabrication pour la production de manière stérile est primordiale, ce qui ajoute à la complexité logistique de la fabrication cellulaire et donc au coût des biens13.

De plus, des études antérieures ont montré que la production typique de MSC dans les flasques de polystyrène en culture tissulaire (TCPS) contribue à l’apparition d’une hétérogénéité phénotypique intra-populationnelle. Pour certains usages finaux, cela rend les efforts de contrôle qualité entre les lots difficiles en recherche et en traductionclinique 14, 15, 16, 17. On suppose que le contrôle biochimique limité disponible dans les flasques TCPS, incluant les gradients de diffusion des gaz, des nutriments et des déchets métaboliques, une mauvaise régulation du pH, etc., contribue à ces défis.

Ces enjeux motivent l’adoption de cultures à base de bioréacteurs pour tirer parti de la régulation biochimique supérieure et de la densité cellulaire disponibles dans un format de croissance tridimensionnelle contrôlée avec mélangedynamique 18. Cependant, le traitement ou la fabrication basé sur un bioréacteur comporte son lot de défis : en tant que type cellulaire dépendant de l’ancrage, les MSC nécessitent une forme de substrat sur lequel croître dans un bioréacteur, ce qui nécessite l’ajout de microporteurs. De plus, de nombreux bioréacteurs disponibles dans le commerce fonctionnent à des échelles volumineuses qui sont prohibitivement gourmandes en ressources (> 3 L de milieux de croissance) pour le type de recherche exploratoire en laboratoire nécessaire pour identifier et affiner des paramètres de processus inconnus qui influencent l’expression d’indicateurs mesurables de la qualité cellulaire. Ces caractéristiques sont décrites comme des attributs potentiels de qualité critique oupCQAs 19.

Krupczak et al. ont précédemment rapporté une approche microporteur-microbioréacteur qui produisait des MSC avec une expression améliorée de pCQA pour le SDRA, limitée aux évaluations in vitro 20. Cette approche combinait l’utilisation d’une plateforme de microporteurs à la gélatine dissolvable produite en interne avec une plateforme de microbioréacteurs commercialement disponible, le Mobius Breez21. Ce microbioréacteur utilise des chambres de réacteur jetables à usage unique de 2 mL et intègre de nombreuses caractéristiques souhaitables pour un meilleur contrôle biochimique, notamment la régulation de la température, du pH, du CO2 et de l’O2 dans un système dynamiquement mixte et en boucle fermée alimenté par perfusion, mais il n’a pas été conçu en pensant aux cellules dépendantes de l’ancrage comme les MSC. En effet, les canaux microfluidiques standards utilisés pour injecter le contenu des réacteurs sont trop petits pour permettre le passage des microporteurs, nécessitant une adaptation substantielle pour permettre la production réussie des MSC sur cette plateforme.

Ici, un protocole détaillé est décrit et illustré dans le but d’adapter ce microbioréacteur à la culture dépendante de l’ancrage des CSM. Les paramètres de procédé rapportés ici ont été identifiés dans le but d’orienter le développement et la fabrication des MSC pour une évaluation préclinique et in vitro de l’efficacité thérapeutique du SDRA. Cependant, en principe, ce protocole peut être adapté à d’autres applications pour les utilisateurs finaux, d’autres affections inflammatoires ou immunomodulatrices, ainsi que pour d’autres types cellulaires dépendants de l’ancrage qui pourraient bénéficier d’un meilleur contrôle biochimique à l’échelle du laboratoire de travail. La figure 1 schématise le protocole décrit dans la vidéo jointe, et les figures 2, 3 et 4 illustrent les résultats clés.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Installation et préparation des micro-opérateurs

  1. Préparation du nombre requis de consommables pour les microbioriacteurs
    1. Assurez-vous que l’armoire de biosécurité (BSC) est allumée et stérile. Retirez la pochette en aluminium qui recouvre le nouveau consommable en perforant le dessus du sac et en gardant le sac en aluminium jusqu’à la fin de cette expérience (pour enregistrer les détails du lot# en cas de défaut). Ouvrez l’emballage blister extérieur et jetez la pochette hydratante qu’il contient. Jetez l’emballage blisé extérieur.
    2. Vaporisez l’emballage intérieur du blister avec de l’éthanol à 70 % et apportez-le dans le BSC. Ouvrez l’emballage intérieur et jetez-le.
    3. À l’aide d’une seringue stérile, retirez le piston et connectez la buse à un filtre stérile de 0,22 μm. Versez 50 mL d’eau ultrapure non stérilisée dans le fût de la seringue. En tenant la seringue au-dessus d’un tube stérile de 50 mL en attente, réinsérez le piston dans la seringue et injectez l’eau filtrée stérile dans le tube de collecte en attente.
    4. Retirez le bouchon en plastique transparent qui se connecte à la bouteille LL dans le support à bouteilles. Avec une nouvelle seringue stérile de 50 mL, retirez le piston et connectez la buse à la bouteille LL. Versez l’eau filtrée stérile dans le fût de la seringue et injectez-la dans la bouteille LL.
      REMARQUE : Les ports de connexion sans aiguille peuvent se bloquer lors de la procédure de stérilisation du fabricant, il se peut donc qu’il soit nécessaire de connecter et déconnecter la seringue plusieurs fois pour briser le joint de la bouteille et injecter avec succès le contenu. Sinon, vous pouvez utiliser une soudeuse pour connecter une bouteille source au tube soudable de manière stérile pour la bouteille appropriée.
    5. En suivant cette même procédure, remplissez la bouteille L avec 25 mL de DMEM faible taux de glucose non supplémenté en FBS, la bouteille R avec 25 mL de PBS stérile, et la bouteille RR avec 8 mL de solution de rinçage anti-adhérence. Utilisez une nouvelle seringue stérile pour chaque liquide.
    6. Répétez cette procédure pour autant de consommables que nécessaire dans l’expérience.
  2. Effectuez un auto-test POD dans chaque POD utilisé pour cette expérience.
    REMARQUE : L’auto-test devrait se terminer sans problème ; Si un composant de l’auto-test échoue, il faut corriger l’échec avant de continuer.
  3. Retirez les cassettes d’auto-test dans leurs sacs de rangement protégés par la lumière.
  4. Montez le consommable sur le bioréacteur comme décrit ci-dessous.
    1. Retirez le ruban vert des valves du consommable et montez-le en position dans le POD. Réinstallez les serre-joints et assurez-vous qu’aucun sifflement de gaz ou d’air ne se fait entendre en s’échappant.
    2. Connectez la ligne de capteur de pression blanche du rack à bouteilles, la ligne de pression d’air rouge et la ligne de vide bleue entre les consommables et la station de base/POD. Assurez-vous que le port d’injection latéral est bien serré avec une pince en goutte d’eau blanche.
    3. Suivez les étapes du logiciel pour lancer une nouvelle expérience. Cela culmine avec la fonction d’autoprime et de calibrage, qui prend ~4-5 heures et peut fonctionner toute la nuit.
  5. Étiquetez chaque support de bouteilles avec son emplacement POD afin qu’il soit facile de distinguer à quel point renvoyer le consommable après son retrait du bioréacteur. Utilisez du ruban coloré pour indiquer la position : Pod0 = rouge, Pod1 = orange, Pod2 = jaune, Pod3 = vert. Écrivez le nom de l’expérience et la date sur la cassette.
  6. Laissez les consommables calibrer toute la nuit. Assurez-vous que les médias peuvent entrer dans le réacteur et en sortir dans la conduite de déchets.
  7. Si vous envisagez d’utiliser des cellules stockées dans de l’azote liquide, décongelez-les et plaquez-les afin qu’elles aient > 24 heures pour récupérer de la cryostockage avant l’injection.

2. Recalibration et préparation des microporteurs

  1. Assurez-vous que les étapes d’autoamorçage et de calibrage ont été réalisées avec succès.
    1. Si l’étalonnage n’a pas été réalisé avec succès, identifiez et corrigez les problèmes de cause profonde, puis tentez un recalibrage. Les problèmes courants incluent le fait de ne pas retirer la pince blanche du support de bouteilles, de ne pas retirer le ruban adhésif vert du consommable avant de le placer dans le POD, et un volume de support insuffisant dans la bouteille de support.
  2. Assurez-vous que les capteurs d’oxygène dissous sont stables.
    1. Près de 10 % des consommables présenteront une dérive du capteur dans le capteur DO après étalonnage. Effectuer l’action corrective préférée, qui consiste à refaire l’étalonnage complet. Si nécessaire, effectuez l’une des étapes suivantes.
      1. Assurez-vous qu’il n’y a pas d’air dans la cassette, puis décochez la case Afficher les graphiques pour afficher les commandes, puis cliquez sur Autocalibrer DO et pH.
        1. Si de l’air était présent dans le réacteur lors d’un recalibrage, retournez à la première page du tableau de bord MBS en cliquant sur la flèche bleue gauche en haut à gauche de la fenêtre pour le POD spécifique en question. Cliquez sur le bouton pour engager les opérations manuelles. Cochez la case Prêt du tube à déchets et entrez W dans la case de saisie du texte pour sélectionner la bouteille de déchets. Cliquez sur le bouton Éjecter-lavage , puis cliquez sur Oui dans la fenêtre contextuelle. Cela vide les chambres du réacteur et les remplit à nouveau avec le média provenant de la bouteille source du support.
  3. Préparez le nombre correct de microporteurs dans des tubes coniques de 15 mL, un pour chaque condition.
    REMARQUE : Le nombre de microporteurs, la surface agrégée et la densité d’ensemencement des cellules dépendront de votre application. Pour ce protocole, il est recommandé d’injecter un nombre absolu de microporteurs qui donne 75cm2 de surface de croissance disponible pour comparaison avec un flascon T75.
  4. Laissez les microporteurs se déposer dans le tube ; Aspirez autant de surnageant que possible sans retirer les microporteurs afin de faire de la place aux cellules et aux milieux frais.

3. Injection de cellules et microporteurs

  1. Assurez-vous que les fonctions d’autoprime et de calibration ont été terminées avec succès.
  2. Faites défiler la fenêtre du logiciel comme si le réacteur était inoculé selon le flux de travail standard des cellules de suspension.
  3. Entrez une note dans la fenêtre pop-up indiquant qu’aucune injection de cellules n’a eu lieu à ce stade.
  4. Activez les opérations manuelles pour mettre en pause le mélange du réacteur et ajouter un serre-C blanc sur les lignes de la grille de bouteilles.
  5. Retirez chaque consommable et transférez-le dans le BSC. Retirez les matériaux usés des déchets et des flacons de perfusion et jetez-les.
    1. Veillez à retirer tous les déchets de la grande bouteille de perfusion ainsi que du petit tube de 1,5 mL contenu dans la bouteille de perfusion si vous prévoyez de prélever un milieu conditionné à un moment donné de l’étude.
  6. Retirez le milieu de croissance non complété en sérum de la bouteille L et jetez-le. Rincez la bouteille L avec ~20 mL de PBS stérile et jetez-le. Ajoutez 25 mL de substrat de croissance complété en sérum dans la bouteille L.
  7. Retournez les consommables dans leurs PODs respectifs. Mettez les bouteilles sources de médias sur la glace pour le reste de l’expérience. Renouvelez la glace chaque jour.
    REMARQUE : La glace humide peut être complétée par des sachets congélateurs pour prolonger la durée du contrôle de la température.
  8. Rince les réacteurs avec du PBS et rince les conduites.
    1. Cliquez sur le bouton Flush bottles , activez le bouton Radio pour la Bottle L, sélectionnez Output to Waste, puis cliquez sur Start Flush MSCserum.
      REMARQUE : Cela permettra de faire passer les nouveaux médias hMSC à travers la ligne afin de garantir qu’aucun autre média non complété par FBS n’entre dans le réacteur.
    2. Cliquez à nouveau sur le bouton Flush bottles , sélectionnez le bouton Radio pour Bottle RR, et commencez à tirer. Cela fera passer la solution de rinçage anti-adhérence à travers la conduite et garantira qu’elle est prête à entrer dans le réacteur.
    3. Dans la fenêtre Contenu de la bouteille, indiquez dans le logiciel que MSCserum se trouve dans la bouteille R, qui contient en fait PBS.
    4. Va en service manuel et effectue trois cycles d’éjection-lavage sur la bouteille de déchets.
  9. Ajoutez une solution de rinçage anti-adhérence au réacteur.
    1. Retournez à la fenêtre Contenu de la bouteille et précisez que MSCserum se trouve dans Bottle RR, qui contient en réalité une solution de rinçage anti-adhérence.
    2. Va en service manuel et effectue un cycle d’éjection-lavage sur la bouteille de déchets.
      REMARQUE : L’ancien lavage PBS visait à empêcher tout composant du DMEM d’interférer avec le lavage anti-adhérence ; maintenant, le réacteur doit être rempli d’une solution de rinçage anti-adhérence avec un PBS en traces.
  10. Après 30 minutes avec la solution anti-adhérence, rincez le consommable avec du PBS.
    1. Dans la fenêtre Contenu de la bouteille, indiquez dans le logiciel que MSCserum se trouve dans la bouteille R, qui contient en fait PBS.
    2. Va en service manuel et effectue trois cycles d’éjection-lavage sur la bouteille de déchets.
    3. Retournez à la fenêtre du contenu de la bouteille et indiquez dans le logiciel que MSCserum se trouve dans la bouteille L, qui contient des supports hMSC.
  11. Vide le réacteur en attendant l’injection de cellules et de microporteurs. Dans le panneau des opérations manuelles, cliquez sur Réinoculer et quittez le système à l’étape où le tableau de bord indique d’inoculer le réacteur.
    REMARQUE : Ici, le terme inoculer signifie simplement l’injection des cellules destinées à l’expansion dans le microréacteur.
  12. Ajoutez les résistances supplémentaires pour moduler la vitesse de mélange en fonction de la résistance R0 par défaut.
  13. Extraire les cellules de leur flasque et les compter sur un hémocytomètre. Effectuer toutes les opérations ouvertes dans un BSC pour garantir la stérilité.
    1. Aspirez le milieu, puis lavez avec 5 à 10 mL de PBS préchauffé. Aspirez le PBS et ajoutez 5 mL de trypsine + EDTA dans la fiole.
    2. Incubez à 37 °C pendant 5 minutes ou jusqu’à ce que toutes les cellules se soient visiblement détachées de la surface de la fiole.
    3. Ajoutez 10 mL de milieu hMSC pré-chauffé pour neutraliser l’activité de la trypchine. Retirez le contenu liquide et déposez-le dans un tube centrifugeuse de 15 mL.
    4. Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 5 minutes. Écartez le surnageant et resuspendez la pelote cellulaire dans un volume approprié de support hMSC pour le comptage. Pour une fiole T75 entièrement confluente, un volume approprié est généralement de 2 à 4 mL, ce qui donnera une concentration cellulaire de ~1 à 2E6 cellules par mL.
    5. Mélangez un échantillon des cellules en suspension avec une part égale de colorant de viabilité Trypan Blue et chargez le mélange dans un hémocytomètre pour le comptage. Comptez les cellules selon les instructions du fabricant.
  14. Calculez le volume de solution cellulaire nécessaire pour atteindre 150 000 cellules et pipettez ce montant dans le tube conique de 15 mL en attente contenant des microporteurs pour chaque condition. Augmentez le volume du tube entre 2,2 et 2,5 mL avec un média hMSC frais et chaud.
    REMARQUE : Le volume dans chaque conique de 15 mL doit être légèrement supérieur à 2 mL de sorte que l’injection entraîne une condition de réacteur légèrement surchargée pour éviter les bulles, qui seront égalisées à une étape ultérieure.
  15. Ajoutez le volume approprié de cellules au contrôle de la fiole T75.
  16. En travaillant avec un à deux consommables à la fois, retirez les consommables du POD et intégrez-les dans le BSC.
  17. Retirez les cellules et les microporteurs dans une seringue de 5 mL à l’aide d’aiguilles émoussées vertes de 4 pouces. Injectez les cellules et les microporteurs dans le réacteur.
  18. Retournez le consommable à la station de base et répétez jusqu’à ce que tous les consommables aient été injectés.
  19. Cliquez sur les fenêtres logicielles pour indiquer que l’inoculation a eu lieu. Lorsque le logiciel revient à la page d’accueil normale, retirez la pince blanche des lignes de sortie des consommables.
  20. Entrez en opérations manuelles et effectuez une fonction d’éjection d’excès avec le port de sortie réglé sur P pour la perfusion. Activez le mode de mixage statique, en utilisant 1680 s allumé et 120 s éteint. Gardez la fréquence de mixage à 5 Hz pour le mélange statique.
  21. Désactivez la mesure de référence de densité optique.
    1. Ouvre le client MBS et clique sur Connecter. Entrez la commande suivante contenue dans les guillemets : « dmem_write 0,1,2,3 F_measure_ODref_skip 1 »
    2. Cliquez sur Envoyer, attendez la confirmation que la commande a été envoyée avec succès, et fermez le client MBS.
  22. Après 24 heures, désactivez le mode de mixage statique et réactivez le mixage normal. Réduisez la fréquence de mixage à 1,5 Hz.

4. Fonctionnement du micromicrobioréacteur

  1. Surveillez le microbioréacteur quotidiennement pour vous assurer qu’aucun problème ne perturbe l’expérience. Assurez-vous que les bouteilles sources de média contiennent >5 mL de média pour perfondre le réacteur sans problème.
  2. Changez les seaux à glace selon les besoins pour maintenir le contrôle de température de la bouteille source de support. Gardez le drapeau protecteur de la lumière sur l’avant du microbioréacteur pour éviter la dégradation lumineuse des composants du milieu volatil.
  3. Veillez à ce qu’aucune bulle ne soit introduite dans le réacteur. N’oubliez pas de changer périodiquement le support dans le contrôle du flasque TCPS.

5. Prélèvement par microbioréacteurs

  1. Assurez-vous que le BSC est stérile et prêt à être utilisé.
    1. Chauffez les réactifs suivants nécessaires dans une bille ou un bain-marie à 37 °C : ~25 mL de milieu hMSC tiède, 10 mL de PBS tiède et 1,5 mL de pronase à 10 mg/mL nécessaires pour la récolte.
  2. Préparez le support à bouteilles pour la récolte.
    1. Activez le mode opérateur manuel pour chaque POD dans le logiciel.
    2. Serrez les lignes d’entrée des consommables à l’aide d’une pince en C blanche le long de la partie dégagée de la ligne.
    3. Retirez les consommables vers le BSC. Retirez le contenu de la bouteille de déchets et jetez-le.
    4. Rinçez la bouteille de déchets avec ~20 mL de PBS et jetez-la. Évaluez le volume restant dans la bouteille de média et complétez avec un support hMSC frais (froid) si nécessaire.
      REMARQUE : Ici, > 4 mL de média sont nécessaires pour compléter les trois cycles d’éjection-lavage nécessaires à la récolte.
    5. Tapisser la bouteille de déchets avec ~5 mL de média hMSC froid pour amortir le liquide récolté.
  3. Prélève les cellules du microbioréacteur.
    1. À l’aide d’une seringue de 1 mL, injectez 200 μL de 10 mg/mL de Pronase dans la seringue et ~300-400 μL d’air.
    2. Dévissez le bouchon de la conduite d’injection latérale et pulvérisez le connecteur de vanne sans aiguille avec 70 % d’éthanol. Retirez le ruban qui fixe la ligne d’injection du port latéral noué et dénouez le nœud. Déserre la pince en forme de goutte blanche.
    3. Connectez la seringue de 1 mL et injectez doucement la Pronase dans le réacteur. Poursuivez le liquide le long de la conduite d’injection avec de l’air pour vous assurer que tout le contenu liquide est livré au réacteur.
    4. Réengagez la serre goutte d’eau et rebouchez la conduite d’injection latérale. Remis le consommable dans son POD, reconnecte toutes les lignes, retire la pince blanche en C, et reprends le mélange.
    5. Assurez-vous que la bouteille de déchets et la bouteille source de support soient conservées sur la glace. Démarrez un minuteur de 5 minutes et laissez la Pronase digérer les microporteurs à l’intérieur du réacteur.
    6. Après 5 minutes, vérifiez si les microporteurs se sont dégradés en vérifiant qu’ils ne sont plus visibles dans le réacteur. Si les microporteurs sont encore visibles, prévoyez une minute supplémentaire pour la digestion. Si aucun microporteur n’est visible, procédez.
    7. Prélève les cellules. Activez le mode opérations manuelles, réglez le # des cycles à 3, et sortissez le port à W pour les déchets, puis cliquez sur Éjecter Lavage.
    8. Après les cycles de lavage d’éjection, retirez le consommable dans le BSC et retirez le contenu de la bouteille de déchets à l’aide d’une seringue de 10 ou 20 mL.
    9. Distribuez le contenu de la bouteille de déchets dans un tube centrifugeuse conique de 15 mL. Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 5 minutes, aspirez le surnageant et évaluez la taille de la pellete cellulaire.
    10. Resuspendez le pellet cellulaire dans 1 à 5 mL de milieu de croissance (PBS) et comptez les cellules sur un hémocytomètre. Répétez cette étape pour tous les consommables.
  4. Prélève la ou les conditions de la fiole en suivant tes protocoles habituels de culture cellulaire. Un protocole typique pour les MSC est décrit dans la version 3.13.

6. Analyser les cellules des conditions du microbioréacteur et des conditions de flasque pour une application en aval

REMARQUE : Les méthodes analytiques utilisées pour produire les résultats présentés sont résumées ci-dessous et décrites plus en détail dans Krupczak, Farruggio et Van Vliet (2024)20.

  1. Contrôle environnemental : Utilisez une interface graphique fournie par le microbioréacteur pour accéder et afficher les données de chacun des capteurs intégrés d’un consommable pendant la durée d’une période de culture. Ces données sont fournies dans le logiciel Breez Explorer, qui est installé dans l’ordinateur portable fourni avec le microbioréacteur.
  2. Rendement des cellules : Prélever les MSC comme décrit ci-dessus et pelleter les cellules à 300 x g pendant 5 minutes. Retirez soigneusement le surnageant et resuspendez soigneusement la granule cellulaire dans un volume approprié de milieu PBS ou hMSC (1-2 mL). Prélève un échantillon du mélange de cellules en suspension et mélange avec un volume équivalent de colorant Trypan Blue. Micropipeter le mélange d’échantillons colorés dans une puce d’hémocytomètre et mesurer le nombre de cellules et la viabilité sur un hémocytomètre automatisé ou manuel.
  3. Vérifiez l’expression génique par transcription inverse en deux étapes par réaction en chaîne quantitative de la polymérase comme décrit ci-dessous.
    1. Purification de l’ARN : Utilisez un kit RNeasy Mini pour isoler et purifier l’ARN de chaque échantillon en suivant les instructions du fabricant. En résumé, lysez les cellules, transférez le contenu cellulaire dans un tube de spin de purification, puis lavez les échantillons avec chaque tampon pour éliminer les composants cellulaires inutiles, les acides nucléiques et les protéines susceptibles d’interférer avec la PCR ultérieure.
    2. Conversion d’ADN : Utilisez un kit de transcription inverse à haute capacité et un thermocycleur pour convertir l’ARN purifié en ADN complémentaire (ADNc) selon les instructions du fabricant. En résumé, décongelez les composants du kit et créez un mix maître en combinant les composants dans les volumes appropriés pour votre nombre d’échantillons. Chargez parts égales d’ARN purifié et de mélange maître préparé (10 μL chacun) dans chaque puits d’une plaque PCR, en veillant à suivre l’emplacement de chaque échantillon. Suivez le protocole du fabricant dans le thermocycleur pour compléter la réaction de transcription inverse.
    3. qPCR : En utilisant des amorces couvrant les exons, spécifiques à la séquence, validées pour éviter le dimère d’amorce, chargez une plaque qPCR de 384 puits avec amorce directe, amorce inverse, ADNc de gabarit, eau sans nucléase et mélange maître en volumes appropriés (typiquement, 1 μL, 1 μL, 1 μL, 7 μL, 10 μL, respectivement) en utilisant plusieurs puits de réplication technique pour chaque gène et échantillon. Répartissez le contenu sur plusieurs plaques si nécessaire pour capturer toutes les cibles génétiques. Assurez-vous que tous les échantillons d’une cible génique particulière sont chargés sur la même plaque afin d’éviter la variabilité des résultats d’une plaque à l’autre, et que chaque plaque dispose d’un gène de maintien approprié et de contrôles sans gabarit. Mesurez l’intensité de fluorescence sur une machine qPCR appropriée et utilisez la méthode ΔΔCt pour la quantification relative afin de calculer l’expression génique.

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Résultats

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Le microbioréacteur a permis de surveiller et de réguler les facteurs environnementaux pendant environ 10 jours en culture. Les facteurs environnementaux, notamment le pH (Figure 2A), la température (Figure 2B), l’oxygène dissous (Figure 2C) et le dioxyde de carbone (Figure 2D), ont été précisément mesurés et maintenus dans les condition...

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Discussion

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Dans ce protocole, une méthode pour étendre, amorcer et récolter les cellules à l’aide d’une approche microporteur-micromicrobioracteur est décrite. Ce procédé permet aux cellules dépendantes de l’ancrage, telles que les MSC, d’augmenter le nombre de cellules sous le contrôle biochimique supérieur d’une plateforme bio-réactrice (par rapport aux fioles TCPS conventionnelles) à l’échelle de la pause, adaptée au développement rapide des procédés. De plus, il est démontré que la production d...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs divulguent un accord de collaboration avec le fabricant de micro-opérateurs, MilliporeSigma.

Remerciements

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Nous remercions l’établissement Genomics Core (Weill Cornell Medicine) pour sa consultation sur l’analyse et le dépannage de la qPCR. Nous remercions chaleureusement l’aide d’Evan Gates et Eric Shiue (MilliporeSigma) dans le soutien technique du microbioréacteur.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution de rinçage anti-adhérenceTechnologies des cellules souches7010
Armoire de biosécurité
Microbioréacteur BreezMilliporeSigma
Centrifugeuse
Tube conique, 15 mL
Tube conique, 50 mL
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, faible taux de glucoseGibco11885084
Éthanol
Sérum fœtal bovinGibcoA5670701
Hémocytomètre
Bande de laboratoire
Microporteurs
Tube de microcentrifuge, 1,5 mL
Microscope
Aiguille, émoussée, calibre 18 cmAmazonB0D663ZR6D
Solution physiologique tamponnée au phosphateCorning21-040-CM
Pronase, de Streptomyces griseusMilliporeSigma10165921001
Pipette sérologique, 10 mLVWR75816-100
Eau déionisée stérile
Filtre à seringue, 0,22 hum, stérileProduits scientifiques Celltreat229762
Seringue, 1 mLBD309628
Seringue, 20 mLBD302830
Seringue, 5 mLBD309646
Seringue, 50 mLBD309653
Fiole de culture tissulaire en polystyrène, T75Thermo Fisher Scientific130190
Bleu de TrypanSigmaAldrichT8154-100ML

Références

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Mots-clés

Microbioreactor ProductionMesenchymal Stromal CellsAnchorage Dependent CellsCell Therapy ManufacturingGelatin MicrocarriersAcute Respiratory DistressEnvironmental MonitoringCell HarvestingCell Quality ControlBiochemical Environment Control

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