Régulation de la transition épithélio-mésenchymateuse dans le cancer de l’ovaire par LncRNA MALAT1 via SNAI2 et MiR-200c-3p

Résumé

Ce protocole décrit des méthodes pour évaluer le rôle de MALAT1 dans la promotion de la transition épithélio-mésenchymateuse dans le cancer épithélial de l’ovaire grâce à sa régulation de l’axe miR-200c-3p/SNAI2.

Résumé

L’ARN long non codant MALAT1 régule la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) et les métastases dans le cancer épithélial de l’ovaire (EOC) par le biais d’un mécanisme d’ARN endogène concurrent (ceRNA) impliquant la modulation des miARN. Cette étude visait à élucider la voie moléculaire par laquelle MALAT1 influence l’EMT et le comportement métastatique via l’interaction avec miR-200c-3p et SNAI2. L’expression de MALAT1 a été manipulée génétiquement dans la lignée cellulaire EOC SK-OV-3 par surexpression ou knockdown. Les effets fonctionnels sur les niveaux de protéines liées à l’EMT, la migration cellulaire et l’invasion ont été évalués à l’aide de tests Western blot, de cicatrisation des plaies et de Transwell, respectivement. L’analyse bio-informatique a identifié miR-200c-3p comme une cible commune de MALAT1 et SNAI2. L’axe MALAT1/miR-200c-3p/SNAI2 a été validé par des tests de rapporteur à double luciférase et une coloration par immunofluorescence pour confirmer les interactions moléculaires directes. La surexpression de MALAT1 a augmenté la migration cellulaire SK-OV-3 de 20 % et l’invasion de 5 %, accompagnée d’une augmentation significative de l’expression de SNAI2 (P < 0,01). À l’inverse, l’inactivation de MALAT1 a supprimé ces phénotypes. Des tests à double luciférase ont confirmé que miR-200c-3p se lie directement à MALAT1 et SNAI2 (P < 0,001). La surexpression de miR-200c-3p a réduit l’EMT induite par MALAT1 en régulant négativement SNAI2 (P < 0,05), tandis que la restauration de SNAI2 a inversé les effets inhibiteurs du silençage de MALAT1 sur les métastases. Ce protocole démontre que MALAT1 favorise l’EMT et les métastases dans l’EOC en fonctionnant comme un ceRNA qui séquestre miR-200c-3p, conduisant à la dérépression de SNAI2. Les résultats fournissent un nouvel aperçu mécaniste et identifient l’axe MALAT1/miR-200c-3p/SNAI2 comme une cible thérapeutique potentielle pour inhiber les métastases du cancer de l’ovaire.

Introduction

Le cancer de l’ovaire (OvCa) est une tumeur maligne très insidieuse et diagnostiquée tardivement. Il progresse généralement de manière asymptomatique jusqu’à atteindre des stades ultérieurs, caractérisés par une croissance agressive principalement dans la cavité péritonéale. Ce processus pathologique se manifeste généralement par une ascite, une réactivité thérapeutique réduite et un mauvais pronostic¹. Les statistiques épidémiologiques de 2018 ont révélé qu’environ 295 000 nouveaux cas avaient été diagnostiqués dans le monde, avec 185 000 cas de mortalité, ce qui reflète une trajectoire ascendante persistante de la charge de morbidité². Bien que les protocoles de traitement modernes intègrent une intervention chirurgicale et des schémas pharmacologiques, les limites persistantes de la détection précoce combinées aux métastases et à la résistance thérapeutique maintiennent les taux de survie à long terme en dessous de 45 %³. Une récidive dans les 12 à 18 mois est fréquemment observée chez de nombreux patients atteints d’une maladie avancée⁴. Ces réalités cliniques soulignent l’urgence d’identifier des marqueurs diagnostiques et des stratégies de suivi thérapeutique cliniquement pertinents. Par conséquent, il est précieux pour identifier les marqueurs diagnostiques cliniquement pertinents.

À l’heure actuelle, les chercheurs ont découvert qu’une proportion substantielle du génome humain génère de longs ARN non codants (ARNlnc)⁵. Les ARNlnc ne codent pas pour les protéines, existent uniquement sous forme d’ARN et jouent des rôles régulateurs dans diverses fonctions biologiques des cellules. Les ARNlnc présentent une non-conservation et présentent des profils d’expression hautement spécifiques aux tissus⁶. Notamment, une surexpression spécifique des ARNlnc a été observée dans plusieurs tissus cancéreux⁷. Le mécanisme concurrent de l’ARN endogène (ceRNA) a révélé un nouveau mode d’interaction de l’ARN. Il est bien établi que les microARN (miARN) peuvent faire taire des gènes par le biais d’interactions spécifiques à une séquence avec les régions 3' non traduites (UTR) de l’ARNm. Pendant ce temps, les ARN non codants (ARNnc) peuvent se lier de manière compétitive aux miARN, entravant ainsi leur capacité à se fixer aux gènes cibles et influençant l’expression des gènes⁸. Le mécanisme des ARNce est actuellement l’hypothèse la plus largement acceptée pour le rôle régulateur des ARNlnc. La diaphonie tripartite entre les transcrits codants, les miARN et les ARN régulateurs construit des réseaux moléculaires complexes qui influencent l’initiation et la progression de la tumeur⁹.

Identifié pour la première fois dans les métastases du cancer du poumon non à petites cellules, MALAT1 est apparu comme un ARNlnc largement surexprimé dans de nombreuses tumeurs malignes¹⁰. Dans nos études précédentes, nous avons identifié une expression accrue de MALAT1 dans les tissus OvCa qui est directement associée à la stadification de l’OvCa¹¹. Nous présentons ici un protocole permettant de moduler génétiquement l’expression de MALAT1 dans la lignée cellulaire épithéliale OvCa (EOC) SK-OV-3 et d’évaluer son impact sur l’expression des protéines liées à la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), la capacité migratoire et le potentiel invasif via des tests moléculaires tels que la qPCR, le western blotting, les tests de rapporteur à double luciférase et les tests fonctionnels tels que les tests de cicatrisation des plaies et les tests Transwell. L’objectif est d’élucider le mécanisme moléculaire par lequel MALAT1 régule l’EMT et la dissémination métastatique dans l’EOC par le biais d’interactions avec miR-200c-3p et SNAI2.

Les méthodes existantes pour étudier les interactions ARNlnc-miARN utilisent souvent des outils de prédiction in silico seuls, qui peuvent manquer de validation expérimentale. Pour les études de régulation EMT, les méthodes histologiques traditionnelles peuvent ne pas fournir d’informations moléculaires détaillées. En utilisant des tests à double rapporteur de luciférase pour la validation expérimentale, notre étude surmonte ces limites, offrant une confirmation plus fiable des interactions prédites. De plus, la combinaison de plusieurs tests fonctionnels, tels que les tests Scratch et Transwell, ainsi que de techniques moléculaires, permet une compréhension complète de l’EMT aux niveaux cellulaire et moléculaire, dépassant la profondeur fournie par les approches de test unique.

Protocole

Culture cellulaire et transfection

La lignée cellulaire humaine SK-OV-3 OvCa a été cultivée dans des conditions standard. Les cellules ont été maintenues dans un milieu de culture composé de 89 % de McCoy’s 5A, de 10 % de sérum fœtal bovin et de 1 % de pénicilline-streptomycine, dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO₂. Le milieu a été remplacé tous les 2-3 jours, et les cellules ont été passées lorsque la confluence a atteint 80-90 % en utilisant 0,25 % de trypsine-EDTA. Les constructions lentivirales pour la surexpression de MALAT1 et l’inactivation de MALAT1 (shRNA), ainsi que le mire, l’inhibiteur et les témoins négatifs de miR-200c-3p, ainsi que le siRNA ciblant SNAI2 et son siRNA de contrôle correspondant, ont été obtenus à partir de sources commerciales. Pour la transfection, les cellules SK-OV-3 ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits à une densité de 5 × 10⁴ cellules/puits dans 500 μL de milieu complet et laissées adhérer pendant la nuit. Les transfections ont été effectuées à l’aide d’un réactif de transfection à base de lipides (RRID : AB_2548650) conformément aux instructions du fabricant. Brièvement, des acides nucléiques (miARN imitateurs/inhibiteurs ou siARN) et un réactif de transfection à base de lipides ont été dilués séparément dans un milieu sérique réduit, incubés pendant 5 min, puis mélangés et incubés pendant 15 minutes supplémentaires à température ambiante pour permettre la complexation. Les complexes ont été ajoutés goutte à goutte aux cellules. Après 6 h, le milieu a été remplacé par un milieu complet frais. Les cellules ont été récoltées 24 à 48 h après la transfection pour des analyses en aval.

PCR quantitative fluorescente en temps réel (qPCR)

L’ARN total a été extrait de cellules SK-OV-3 cultivées à l’aide du réactif d’extraction d’ARN conformément aux instructions du fabricant. En bref, les cellules ont été lysées dans 1 mL de réactif par puits d’une plaque à 6 puits, et l’ARN a été isolé à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN commercial selon le protocole fourni. La concentration et la pureté de l’ARN ont été déterminées à l’aide d’un spectrophotomètre, et des échantillons avec un rapport A₂₆₀/A₂₈₀ compris entre 1,8 et 2,0 ont été utilisés pour des applications en aval. La transcription inverse a été réalisée à l’aide du RT Master Mix (RRID : SCR_018597) avec 500 ng d’ARN total dans un volume de réaction de 20 μL. Les conditions de cyclage thermique étaient les suivantes : 37 °C pendant 15 min, suivi de 85 °C pendant 5 s pour inactiver la transcriptase inverse. L’ADNc résultant a été stocké à −20 °C jusqu’à son utilisation. La PCR quantitative en temps réel a été réalisée à l’aide d’un kit commercial de détection de miARN qRT-PCR sur un instrument de PCR en temps réel. Chaque réaction a été réalisée dans un volume de 20 μL contenant 10 μL de 2 mélanges maîtres qPCR, 1 μL d’amorces spécifiques (avant et arrière, 10 μM), 2 μL de matrice d’ADNc et 7 μL d’eau exempte de RNase. Les conditions de cycle thermique étaient les suivantes : 95 °C pendant 10 min, suivi de 40 cycles de 95 °C pendant 10 s et de 60 °C pendant 30 s. Une analyse de la courbe de fusion a été effectuée pour vérifier la spécificité du produit. Les niveaux d’expression ont été calculés à l’aide de la méthode ΔΔCt, avec GAPDH (pour l’ARNm) ou U6 (pour le miARN) comme contrôles internes. Toutes les réactions ont été réalisées en trois exemplaires, et les données sont présentées en moyenne ± écart-type.
REMARQUE : Le réactif d’extraction de l’ARN est un produit chimique dangereux. Il doit être manipulé dans une hotte car il est corrosif et peut provoquer une irritation de la peau et des yeux. Les déchets contenant le réactif doivent être éliminés conformément aux réglementations locales en matière d’élimination des déchets dangereux.

Essai de grattage

Les cellules SK-OV-3 ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits à une densité de 5 × 10⁴ cellules/puits et cultivées jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence d’environ 90 à 100 %, formant une monocouche uniforme. Une pointe de pipette stérile de 10 μL a ensuite été utilisée pour créer une rayure linéaire à travers la monocouche cellulaire au centre de chaque puits. Pour assurer l’uniformité, le même angle et la même pression ont été appliqués lors de la formation des rayures dans tous les puits. Après le grattage, du PBS a été ajouté pour éliminer les cellules détachées avec deux lavages doux. Les cellules ont ensuite été cultivées dans un milieu McCoy’s 5A sans sérum afin de minimiser les effets de prolifération. Des images de la zone d’égratignure ont été capturées immédiatement (0 h) et de nouveau à 24 h et 48 h à l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 10x. La largeur de l’égratignure à chaque point temporel a été mesurée à l’aide du logiciel ImageJ, et le pourcentage de fermeture de la plaie par rapport à la largeur initiale a été utilisé pour calculer le taux de migration.

Dosage transpuits

Les cellules SK-OV-3 ont été ensemencées dans les chambres supérieures des inserts Transwell (la chambre supérieure contient 200 μL de milieu complet à 1 %, la chambre inférieure contient 1 mL de milieu complet à 5 %) à une densité de 5 × 10³ cellules par insert, incubées à 37 °C, dans un environnement humidifié à 5 % de CO₂ pendant 24 h avant une analyse plus approfondie. Après une incubation de 24 h, les inserts ont été retirés et lavés 3 fois avec du PBS, puis fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 15 min. Après le lavage au PBS, les cellules ont été colorées avec une solution de violet cristallin à 1 %. Après la coloration, les cellules ont été rincées avec du PBS et observées au microscope inversé.
REMARQUE : Le violet cristallin est une tache biologique et peut être nocif s’il est ingéré ou en contact avec la peau. Il doit être manipulé avec soin et les déchets doivent être éliminés correctement conformément aux réglementations locales.

Dosage de la double luciférase rapporteure

Les cellules transfectées sont incubées dans des conditions de culture standard (37 °C, 5 % de CO₂ humidifié dans un environnement humidifié) pendant 48 h avant la lyse. Après 48 h d’incubation, les cellules ont été lysées et centrifugées à 5 000 × g pendant 5 min à 4 °C. Une aliquote de 50 μL du surnageant a été transférée dans une plaque de 96 puits, suivie de l’ajout séquentiel de 100 μL de réactif luciférase Firefly et de 100 μL de réactif Renilla luciferase dans chaque puits. Les activités de Firefly et de Renilla luciferase ont été mesurées à l’aide du système de dosage Dual-Luciferase Reporter sur un luminomètre. L’activité de la renilla luciférase a été normalisée à l’activité de la luciférase Firefly pour tenir compte des variations de l’efficacité de la transfection.

Test d’immunofluorescence

Les cellules SK-OV-3 ont été fixées dans du PFA à 4 % pendant 15 min à température ambiante, puis lavées 3 fois avec du PBS. Pour bloquer la liaison non spécifique, les cellules ont été incubées avec 5 % de sérum de chèvre dans du PBS pendant 1 h à température ambiante. Après le blocage, les cellules ont été incubées pendant la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre la E-cadhérine (RRID : AB_2833860), la N-cadhérine (RRID : AB_2837725) et la vimentine (RRID : AB_2835318), chacun dilué à 1:200. Le lendemain, les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS et incubées avec des anticorps secondaires appropriés conjugués aux fluorophores [IgG-FITC DE SOURIS (RRID : AB_2843438) et IgG-FITC ANTI-LAPIN (RRID : AB_2843439)] dilués 1:500 pendant 1 h à 37 °C dans l’obscurité.
REMARQUE : Le paraformaldéhyde est toxique et potentiellement cancérigène. Il doit être manipulé avec précaution, en portant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié tel que des gants et des lunettes de protection. Les déchets contenant du PFA doivent être éliminés en tant que déchets dangereux.

Analyse statistique

Pour les comparaisons entre deux groupes, un test t a été utilisé, et pour les comparaisons de plusieurs groupes, une ANOVA a été appliquée. La signification statistique a été ±établie à *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001. Toutes les expériences ont été réalisées avec trois réplicats biologiques (n = 3).

Résultats

Capacités migratoires et invasives des cellules SK-OV-3 modulées par MALAT1

Le flux de travail expérimental est décrit à la figure 1. Pour étudier le rôle de MALAT1 dans la migration et l’invasion des cellules OvCa, nous avons modulé son expression dans les cellules SK-OV-3. Lors de l’inactivation de MALAT1, la qPCR a confirmé une suppress...

Discussion

L’OvCa, le cinquième cancer gynécologique, reste une préoccupation majeure pour la santé des femmes². Cependant, la plupart des cas sont identifiés à des stades avancés, ce qui limite considérablement les options de traitement efficaces, entraînant une amélioration minime des taux de survie globale¹². Les métastases cancéreuses sont un facteur majeur de mortalité chez les patients dans l’EOC¹³. De nouvelles preuves i...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,22 &mu ; m membranes PVDF	Beyotime	FFP32
Kit de détection miARN qRT-PCR tout-en-un	FulenGen	QP115
Albumine sérique bovine	Beyotime	ST025
Substrat de chimiluminescence	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	TCH-C335
Substrat de chimiluminescence	Millipore	WBKLS0100
Kit de dosage de gènes rapporteurs de luciférase double	beyotime	RG027
Sérum fœtal bovin	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	FBP-C550
IgG FITC anti-souris de chèvre	Affinité	Réf. S0007
Chèvre Anti-Lapin IgG FITC	Affinité	Réf. S0008
Lipofectamine 2500	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	SJ-LIP-2500
Lentivirus interférent avec MALAT1	SHANGHAI GENECHEM Co., Ltd.	LV-MALAT1-sh
MALAT1 surexpression lentivirus	SHANGHAI GENECHEM Co., Ltd.	LV-MALAT1-OE
Le 5A de McCoy	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	GUMD-B305
miR-200c-3p mimic	SHANGHAI GENECHEM Co., Ltd.	micro-has-200C-3P
Analyseur d’immunodosage enzymatique multifonctionnel	Perkin Elmer	Envision 2100
Solution de pénicilline-streptomycine	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	GUSA-R002
Cocktail d’inhibiteurs de la phosphatase	GSbioth	GS1439A
Anticorps primaire E-cadhérine	Affinité	BF0219
Anticorps primaire N-cadhérine	Affinité	AF5239
Anticorps primaire Vimentin	Affinité	AF7013
PrimeScript RT Master Mix	Takara	RR036A
Système de détection PCR en temps réel	Bio-Rad	Le CFX96
Centrifugeuse réfrigérée	Eppendorf	5810R
Tampon de lyse RIPA	GSbioth	GS504A
SDS-gels de polyacrylamide	Beyotime	P0012A
Anticorps secondaire IgG FITC anti-souris de chèvre	Affinité	Réf. S0007
Anticorps secondaire Chèvre Anti-Lapin IgG FITC	Affinité	Réf. S0008
ARNi SNAI2	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	si-has-escargot2
Base de données StarBase	Université Sun Yat-sen	http://starbase.sysu.edu.cn
Le kit de dosage BCA	Dingguo Biotech	BCA02
L’incubateur de culture cellulaire	Hérée	Cellule Hera 150
Le système d’analyse d’images	Bio-Rad	GEL DOC 1000
Le microscope inversé	Mshot	MI152-N
Le kit d’extraction d’ARN	ÉCOTOP	EK-1328-50T
Réactif TRIzol	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	T751379
Alimentation universelle par électrophorèse	WixScientific	WIX-EP600