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Article de méthode

Développement, caractérisation et évaluation de systèmes de liquide ionique basés sur CAGE pour l’administration transdermique

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DOI :

10.3791/68658

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26 septembre 2025

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1LEO Foundation Center for Cutaneous Drug Delivery, Department of Pharmacy, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

Dans cet article

Résumé

Ce protocole traite de la normalisation de la préparation des systèmes de liquide ionique basés sur CAGE afin d’assurer la reproductibilité et de rationaliser le flux de travail global dans différents laboratoires scientifiques.

Résumé

Les liquides ioniques ont récemment acquis une reconnaissance remarquable pour leurs applications dans l’administration de médicaments, en particulier leur potentiel à permettre la pénétration cutanée des médicaments et à améliorer la perméation des médicaments. En plus d’améliorer la perméabilité de la barrière, les liquides ioniques ont d’excellentes propriétés de solvatation, ce qui permet de résoudre le problème de la dissolution de médicaments peu solubles. En raison de la grande asymétrie entre les cations organiques et les anions, ces sels fonctionnels restent liquides à température ambiante. Du point de vue de l’application, les liquides ioniques offrent une approche prometteuse et hautement accordable pour servir de multiples domaines thérapeutiques. Un liquide ionique biocompatible composé de choline et d’acide géranique (CAGE), dans un rapport d’ions stœchiométrique de 1:2, présente un immense potentiel pour l’administration transdermique d’une large gamme d’ingrédients pharmaceutiques actifs, y compris de petites molécules, des peptides, des protéines et des acides nucléiques. Cela a un impact minime sur la fonction de barrière cutanée. Nous partageons ici nos méthodes de préparation, de caractérisation et d’évaluation de CAGE. Des résultats représentatifs sont présentés pour la caractérisation de CAGE à l’aide de la spectroscopie RMN, de la calorimétrie différentielle à balayage, du titrage de Karl-Fischer pour l’analyse de la teneur en eau et des études d’interaction de barrière ex vivo sur la peau porcine.

Introduction

La peau est l’organe le plus grand et le plus vital du corps, servant de barrière protectrice contre les substances nocives tout en empêchant la perte d’eau1. Dans le même temps, l’application de médicaments sur et à travers la peau offre un large éventail d’avantages. Par rapport aux injectables et à l’administration orale, l’administration cutanée augmente l’observance du patient et évite le métabolisme de premier passage dans le foie2. En particulier pour les affections cutanées, les formulations administrées par voie cutanée excellent dans la fourniture d’un effet localisé, diminuant l’exposition systémique3. Cependant, la nature presque imperméable de la peau remet considérablement en question la réussite de l’accouchement cutané4. La peau humaine se compose de trois couches différentes : l’épiderme, le derme et l’hypoderme4. L’épiderme est la couche externe de la peau et peut être divisé en différentes sous-couches, la couche cornée étant la couche la plus externe, composée principalement de kératinocytes. La couche cornée agit comme une barrière de perméation proéminente pour la plupart des molécules, inhibant leur transport dans les couches profondes de la peau5. Cette fonction barrière résulte de la présence de cornéocytes intégrés dans un arrangement lipidique serré, comprenant principalement des phospholipides, des stérols et des céramides, souvent appelés structure physique6. Pour surmonter cette barrière cutanée, des amplificateurs de perméation chimique (CPE) ont été déployés pour délivrer des macromolécules, car elles perturbent la structure de la couche cornée en interagissant avec les lipides et les protéines qui y sont présents7.

Les liquides ioniques (IL) sont devenus les CPE de nouvelle génération8. Il s’agit de cations organiques et d’anions volumineux, disposés de manière asymétrique et coordonnés par des interactions ioniques faibles et non directionnelles9. En raison de ces faibles forces intermoléculaires, les ILs existent sous forme liquide en dessous de 100 °C et sont incapables de s’entasser dans une structure cristalline bien définie10. Les IL sont très réglables, car leur efficacité dépend fortement du choix des cations ou des anions et du rapport stœchiométrique entre ces ions. Par conséquent, ils ont une capacité élevée de solubilisation et de stabilisation pour les médicaments à hydrophobicités variées11. Les IL servent les propriétés uniques des lipides et des polymères en fournissant une libération et une encapsulation prolongées de macromolécules, respectivement12.

Les IL biocompatibles à base de choline et d’acide géranique (CAGE), présents dans un rapport molaire stœchiométrique de 1:2, ont des applications significatives dans l’administration transdermique de composés hydrophiles et hydrophobes. Il a été rapporté que CAGE améliore considérablement l’administration transdermique de protéines (insuline13) et d’acides nucléiques (siRNA14). CAGE est préparé par métathèse du sel entre le bicarbonate de choline et l’acide géranique, avec du CO2 comme sous-produit15. La métathèse du sel offre la formation de nouveaux composés par échange d’ions dans des conditions douces de manière directe, rapide et hautement sélective. En général, il y a un manque de flux de travail faciles à suivre pour le développement et l’évaluation de CAGE IL. C’est pourquoi nous présentons ici l’un de ces flux de travail, détaillant chaque étape de la préparation de CAGE pour permettre aux chercheurs de différents horizons d’entrer dans cet espace de recherche.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées conformément à la directive 2010/63 de l’Union européenne et ont été approuvées par l’Administration vétérinaire et alimentaire danoise (Licence n° DK-13-oth-931833).

1. Préparation de la cage par réaction de métathèse du sel

  1. Recristallisation de l’acide géranique (pureté de 85 %, poids molaire 168,23 g/mol)
    1. Prenez une fiole à fond rond de 500 ml et mesurez son poids.
    2. Peser 40,0 g d’acide géranique dans la fiole. Cela correspond à 0,2 mol d’acide géranique.
    3. Recristalliser l’acide géranique dans un acide géranique à 70:30 % (p/p) :acétone : Ajouter (40 g*0,85*0,30)/(0,70*0,784 g/mL) = 18,42 mL d’acétone dans la fiole à fond rond.
    4. Prenez un bécher de 5 L et préparez environ 0,5 L de glace sèche et d’éthanol.
    5. Placez le ballon à fond rond dans le mélange froid de glace carbonique et d’éthanol sans le faire tourner pour permettre un refroidissement externe. Décanter l’acétone et les impuretés de l’acide géranique solide/recristallisé lorsque la cristallisation a atteint l’équilibre (correspondant à environ le volume de l’acétone ajoutée, généralement dans les 0,5 à 2 heures). Répétez cette étape 5 à 6 fois pour assurer une pureté suffisante.
    6. Retirer l’acétone restante par évaporation rotatoire sous vide à 40 tr/min pendant au moins 20 min ou jusqu’à ce que la fiole à fond rond ne soit plus froide au toucher (l’acétone a une pression de vapeur de 240 mbar à 20 °C).
    7. Pesez et notez la masse de la fiole et de l’acide géranique recristallisé. Calculez le rendement en fonction du poids initial du ballon vide. La fourchette de rendement attendue est de 60 à 80 %.
  2. Réaction de métathèse du sel
    1. Pour un rapport molaire de 2:1 entre l’acide géranique et la choline, calculez le nombre de moles de choline, en tenant compte du rendement de la recristallisation de l’acide géranique. Par exemple, avec un rendement de 70 %, il faut ajouter 0,07 mol de choline (0,2*70/100=0,14, 0,14/2 = 0,07).
    2. Le bicarbonate de choline a une pureté de 80 % et un poids moléculaire de 165,19 g/mol. En conséquence, ajoutez 14,45 g (0,07 * 165,19 = 11,56 g ; 100/80 * 11,56 g = 14,45 g) de bicarbonate de choline goutte à goutte pour éviter le débordement.
    3. Remuez l’échantillon pendant la nuit à une vitesse de 300 tr/min (ou appropriée) à température ambiante (18 ± 3 h) ou jusqu’à ce que l’évaporation du CO2 cesse.
    4. Sécher l’échantillon par évaporation rotatoire à 60 °C, 30 mbar pendant 40 min. Tout d’abord, augmentez la température, puis réduisez lentement la pression pour éviter la formation de mousse.
    5. Aliquote CAGE dans des flacons en verre dans des volumes appropriés à l’application prévue (p. ex., 2 mL de CAGE dans des flacons en verre de 4 mL).
    6. Sécher les flacons sous vide à 60 °C pendant 48 h.

2. Caractérisation de CAGE

  1. Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN)
    1. Dissoudre CAGE à une concentration de 25 mg/mL dans du diméthylsulfoxyde deutéré (d-DMSO), en assurant un volume final d’au moins 500 μL.
      REMARQUE : Les solvants deutérés sont essentiels en RMN pour éviter les interférences des atomes d’hydrogène dans le solvant.
    2. Transférez 500 μL de la solution préparée dans un tube RMN propre et sec (généralement de 5 mm de diamètre, selon l’instrument). Scellez le tube avec un capuchon pour éviter l’évaporation et la contamination.
      REMARQUE : Évitez d’introduire des bulles d’air, car elles peuvent affecter l’homogénéité du champ magnétique.
    3. Utilisez un spectromètre RMN (par exemple 400 MHz) avec les paramètres suivants :
      -Nombre de scans : 8-16 pour 1H RMN ; 1 000 à 5 000 pour une RMN à 13°C (en fonction de la concentration et du rapport signal/bruit (S/N) souhaité.
      -Délai de relaxation (D1) : 1-2 s pour 1H et 13C RMN.
    4. Traitez les données à l’aide d’un logiciel approprié.
      1. Ajustez pour obtenir des formes de pic optimales grâce à la correction de phase et de base.
        REMARQUE : Cette opération est généralement effectuée dans le logiciel RMN dans l’onglet Traitement ou Correction (selon le logiciel utilisé), où des outils automatiques de réglage de phase et de correction de ligne de base sont disponibles.
      2. Utiliser le pic de solvant résiduel (d-DMSO) comme référence : ~ environ 2,50 ppm pour 1H, ~ environ 39,52 ppm pour 13C RMN. Voir Fulmer et al.15pour des références sur les impuretés.
    5. Intégrez les pics et attribuez-les aux protons de la structure (voir Figure 1).
  2. Teneur en eau déterminée par titrage Karl Fischer
    1. Dissoudre 300 mg de CAGE dans 300 μL de méthanol. Verser dans une seringue de 1 mL et peser avant et après l’injection.
    2. Déterminer la teneur en eau à l’aide d’un titreur coulométrique Karl Fischer selon les instructions du fabricant.
      1. Injectez l’échantillon dans la cellule de titrage à travers le septum à l’aide d’une seringue, entrez le poids de la seringue vide et appuyez sur Entrée. Le résultat s’affiche sous forme de % p/p.
      2. Ajustez la teneur en eau du méthanol pour obtenir la teneur réelle en eau dans CAGE (généralement 1 à 2 % p/p). (Échantillon W = Échantillon W+diluant*(échantillon m+diluant m) - (Diluant W*diluant m)/méchantillon).
  3. Stabilité thermique de CAGE par calorimétrie différentielle à balayage (DSC)
    1. Placez 3 à 5 mg de chaque échantillon dans des casseroles en aluminium Tzero et fermez-les avec un couvercle hermétique.
    2. Analysez les échantillons à l’aide d’un DSC dans la plage de température de 80 °C à - 80 °C avec une période isotherme de 10 min avant de refroidir à - 80 °C.
    3. Utilisez un taux de chauffage/refroidissement constant de 5 °C/min et une purge à l’azote de 50 mL/min.
    4. Traitez les données à l’aide d’un logiciel approprié.

3. Évaluation ex vivo de l’interaction de la barrière cutanée

  1. Traitement dermatologique de la peau porcine
    1. Coupez le polystyrène expansé (EPS) pour l’adapter à la lame du dermatome et enveloppez-le avec du ruban adhésif. Utilisez la peau prélevée dans la région de la longe des porcs à l’aide d’un scalpel. Ici, la peau a été obtenue à partir de porcs danois Landrace ou Yorkshire femelles de 3,5 mois (30-40 kg).
    2. Retirez le tissu musculaire et adipeux. Pour faciliter la dermatologie du tissu, il est important d’assurer un côté basolatéral plat et régulier.
    3. Retirez autant de poils que possible de la peau à l’aide d’une tondeuse à cheveux.
    4. Rincez la peau avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) pour éliminer le sang et les cheveux morts.
    5. Coupez la peau en petits morceaux (5 cm x 15 cm) à l’aide d’un couteau pour ajuster les blocs de PSE.
    6. Fixez la peau au bloc EPS à l’aide d’aiguilles.
    7. Réglez le dermatome sur une épaisseur de 0,5 mm et sectionnez la peau.
    8. Stockez la peau dermatomed entre deux couches de ruban de greffe et conservez-la à -70 °C.
  2. Perte d’eau transépidermique (TEWL)
    1. Préparez le PBS (pH 7,4) en dissolvant 1 comprimé dans 200 mL d’eau ultrapure. Dégazer pendant 20 min dans un bain à ultrasons.
    2. Allumez le bain-marie relié aux cellules de diffusion Franz. Ajoutez environ 12 ml de PBS dégazé et une bille magnétique dans chaque cellule. Activez l’agitation magnétique (par exemple à 600 tr/min) en assurant une distribution uniforme dans le milieu récepteur sans créer de turbulences. Notez que toutes les configurations de cellules Franz ne permettent pas un contrôle précis de la vitesse d’agitation. Réglez la source de chaleur pour atteindre une température de 37 °C dans le milieu récepteur.
    3. Coupez la peau dermatomed en morceaux d’un diamètre d’environ 3 cm (ou d’une taille appropriée) à l’aide d’un scalpel et fixez soigneusement la peau dermatomed sur des cellules de diffusion Franz à l’aide de pinces et d’anneaux d’étanchéité, la couche cornée vers le haut.
    4. Ensuite, remplissez complètement les chambres réceptrices avec du PBS à l’aide d’une pipette Pasteur en verre, en vous assurant qu’elles sont remplies jusqu’à la marque qui indique le volume connu du milieu récepteur. Éliminez les bulles d’air en inversant soigneusement les cellules. Hydratez-vous pendant 30 min.
    5. Allumez l’appareil TEWL et équilibrez-le pendant 20 minutes jusqu’à ce qu’il soit stable selon les directives du fabricant.
    6. Placez la sonde TEWL sur chaque cellule Franz et appuyez sur Start dans le logiciel. Maintenez-le jusqu’à ce qu’une lecture s’affiche.
    7. Ajouter 300 μL d’échantillon sur la peau (en trois exemplaires, n = 3) et occlure en plaçant du ruban adhésif sur la cellule de Franz. Incuber pendant 24 h à 37 °C (température du milieu récepteur).
    8. Retirez l’échantillon en essuyant le mouchoir avec des lingettes non pelucheuses. Laisser agir 30 min.
    9. Mesurez la TEWL pour chaque cellule afin d’examiner l’effet des échantillons sur la barrière cutanée. Calculer les valeurs TEWL par rapport aux valeurs pré-exposition et ajuster en fonction du contrôle PBS (TEWL relatif = (TEWL post-TEWL-pre/TEWLpre)/(TEWL(PBS)post-TEWL(PBS)pre/TEWL(PBS)pre))*100.

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Résultats

Spectres RMN
L’objectif de cette technique est de confirmer la formation réussie de CAGE en analysant les environnements chimiques des atomes d’hydrogène et de carbone à l’aide de la spectroscopie RMN 1H et 13C. Les spectres résultants fournissent des décalages chimiques caractéristiques, des motifs de division et des valeurs d’intégration qui reflètent la structure moléculaire et la composition de l’IL synthétisé. Le spectre RMN des protons de la figure 1

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Discussion

La méthode de préparation de CAGE décrite dans ce travail a été adoptée à partir de la littérature15. Cependant, il est important de reconnaître que le processus de synthèse est sensible à divers facteurs externes, qui peuvent influencer les propriétés du produit final. Par conséquent, une fois préparé, le système CAGE doit être caractérisé à l’aide de techniques telles que la spectroscopie RMN pour confirmer la formation de CAGE.

Comme...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la subvention n° de la Fondation LEO. LF15007 et LF-FE-23-700013.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes RMN de 5 mmSigma Aldrich41121705
AcétoneVWR23L064039
Bacs en aluminium TzeroTA Instruments90,16,83,901
Dispositif de flux aquaSystèmes Biox
Bruker Avance III RMNBrukerInstrument pour la spectroscopie RMN
Choline BicarbonateSigma AldrichC7519
DermatomeZimmer Biomet
Calorimètre à balayage différentielTA Instruments
ÉthanolVWR23J314009
Polystyrène expanséStyromousse
Cellules de diffusion FranzPermeGear
Acide géraniqueSigma Aldrich427764
Ruban de greffageParafilm
Karl Fischer TitratorMettler Toledo30252662
MéthanolVWR85681.32
PBSFischer Scientific10388739
Logiciel d’analyse universelle TA 2000TA InstrumentsLogiciels pour l’analyse des données DSC
Logiciels TopSpinBrukerLogiciels pour l’analyse de données RMN

Références

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