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Application de l’optogénétique combinée à l’enregistrement par photométrie par fibre dans la régulation des circuits neuronaux-fonctions viscérales par électroacupuncture

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DOI :

10.3791/68667

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19 septembre 2025

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1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Northeast Asia Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le but de cette expérience est d’établir une nouvelle approche pour l’intégration simultanée de l’optogénétique, de l’enregistrement du signal calcique intracérébral et de la surveillance de la motilité gastrique, offrant un nouveau paradigme pour la surveillance en temps réel de la relation entre la stimulation somatique et les interactions entre les circuits neuronaux et les fonctions viscérales, qui est appliqué à la recherche en acupuncture.

Résumé

Ce protocole décrit une technique de manipulation optogénétique de types spécifiques de neurones et d’enregistrement en temps réel des effets de l’électroacupuncture à Zusanli (ST36) sur les signaux calciques nucléaires et la motilité gastrique chez la souris sous anesthésie in vivo. L’exploration des mécanismes centraux sous-jacents à l’efficacité de l’acupuncture a été limitée par des contraintes technologiques. Cependant, les progrès de la technologie de l’optogénétique et de l’imagerie optique ont propulsé le développement des neurosciences. L’enregistrement par photométrie par fibre, qui exploite initialement des indicateurs calciques génétiquement codés pour visualiser les changements dans la dynamique du calcium indiquant l’activité neuronale, se distingue comme une technologie clé pour caractériser les corrélations cerveau-comportement in vivo. L’application de l’optogénétique permet l’encodage génétique des neurones, permettant leur activation ou leur inhibition en réponse à la stimulation lumineuse. Cette capacité facilite l’établissement de liens de causalité entre la fonction des circuits neuronaux et les résultats comportementaux. La photométrie simultanée des fibres, l’enregistrement du calcium et la stimulation optogénétique fournissent une méthode d’enregistrement et de manipulation en temps réel de l’activité neuronale, constituant une approche efficace pour étudier les mécanismes centraux de l’acupuncture. Néanmoins, il reste une pénurie d’études documentant l’utilisation simultanée de l’enregistrement calcique par photométrie par fibre, de l’optogénétique et de la surveillance de la fonction viscérale dans la recherche en acupuncture. Les résultats de cette expérience montrent que EA-ST36 pourrait réguler la motilité gastrique liée au circuit PBN Glu-NTSGlu-DMV ChAT. La stimulation optogénétique de ce circuit produit le même effet. Après la superposition des deux, les modifications du signal calcique et de la motilité gastrique atteignent leur maximum. Cette étude a établi une nouvelle approche pour l’intégration simultanée de l’optogénétique, de l’enregistrement du signal calcique intracérébral et de la surveillance de la motilité gastrique, offrant un nouveau paradigme pour la surveillance en temps réel de la relation entre la stimulation somatique et les interactions entre les circuits neuronaux et les fonctions viscérales.

Introduction

Ces dernières années, la prolifération des capteurs fluorescents biomoléculaires a propulsé l’utilisation de la photométrie à fibres en biologie moléculaire, facilitantl’enregistrement in vivo1. Cette avancée permet de surveiller en temps réel les altérations de l’activité neuronale dans le cerveau. L’intégration de l’optogénétique permet la manipulation neuronale, offrant l’avantage de réaliser immédiatement l’enregistrement de l’optogénétique et de la fibre optique par simple insertion de la fibre optique. Combinée à l’enregistrement de la fonction viscérale, cette méthode offre une bonne résolution temporelle et un ciblage au niveau des noyaux pour observer comment l’acupuncture module les fonctions viscérales via les modifications de l’activité neuronale.

De nombreuses études ont illustré l’impact réglementaire distinct de l’acupuncture sur la fonction gastro-intestinale 2,3,4, bien que les mécanismes centraux précis restent insaisissables. De nombreux livres de médecine chinoise ancienne, tels que HuangDiNeiJing, ont également enregistré que le ST36 (sur le côté latéral postérieur à l’articulation du genou, environ 2 mm inférieur au péroné5) est souvent utilisé pour traiter les maladies gastro-intestinales. Des études récentes ont montré que les noyaux impliqués dans les processus physiologiques gastriques (par exemple, le comportement alimentaire6, l’arrêt de manger7, la suppression de l’appétit8) et les processus pathologiques (par exemple, la douleur gastrique9, la dysfonction gastrique10) englobent le noyau parasubthalamique (PSTn), le noyau du raphé dorsal (DRN), le noyau parabrachial latéral (LPB), le noyau du tractus solitaire (NTS) et le noyau moteur dorsal du vague (DMV). Des études ont montré que l’électroacupuncture à ST36 peut augmenter le nombre de cellules c-Fos+ dans le DMV, augmentant ainsi l’expression de c-Fos+ dans le sous-noyau caudal de NTS11. De plus, il a été documenté que le noyau paracentriculaire (PBN) est impliqué dans la composition du complexe nucléaire paracentrique, peut se projeter jusqu’au bulbe rachidien NTS, qui joue un rôle important dans l’intégration des informations sensorielles viscérales, telles que les signaux gastro-intestinaux12,13. Les informations ci-dessus suggèrent que l’acupuncture pourrait potentiellement moduler la motilité gastrique pourrait être liée au circuit neuronal PBN Glu-NTSGlu-DMV ChAT. Les neurones glutamatergiques sont principalement impliqués dans le LPB et le NTS14, tandis que les neurones cholinergiques sont principalement impliqués dans le DMV au cours des processus physiologiques et pathologiques gastriques15. L’étude des effets régulateurs de l’acupuncture sur les circuits neuronaux et les fonctions viscérales peut fournir une compréhension plus claire des mécanismes de l’acupuncture et fournir un support théorique pour les interventions cliniques d’acupuncture dans les maladies viscérales.

Cependant, en raison de limitations techniques, peu de recherches ont approfondi les mécanismes des circuits neuronaux de l’électroacupuncture dans la modulation des fonctions viscérales. Par conséquent, la présente étude présente des lignes directrices simplifiées pour introduire le processus détaillé d’injection du virus. Notamment, la méthodologie exposée dans cet article peut être utilisée pour élucider les mécanismes de circuits impliqués dans la régulation de diverses fonctions viscérales par l’acupuncture.

Par conséquent, cette étude vise à étudier les effets régulateurs de l’acupuncture sur la motilité gastrique, qui pourraient être liés au circuit neuronal PBN Glu-NTSGlu-DMV ChAT en combinant l’optogénétique avec la photométrie des fibres pour l’enregistrement de l’imagerie calcique. L’objectif est d’établir un protocole pour l’imagerie calcique et la synchronisation optogénétique, en introduisant un nouveau cadre de recherche pour l’étude de la fonction viscérale et des circuits neuronaux.

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Protocole

Toutes les procédures ont suivi les directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire établies par les National Institutes of Health et ont reçu l’approbation du Comité d’éthique des soins et de l’utilisation des animaux de l’Institut d’acupuncture et de moxibustion de l’Académie chinoise des sciences médicales. Des souris C57 mâles adultes pesant 25 g ont été utilisées pour l’injection virale et l’implantation de fibres optiques. Le protocole d’expérimentation animale a strictement respecté les exigences de la norme nationale « Guidelines for Ethical Review of Welfare of Laboratory Animals » (GB/T 35892-2018) et a été approuvé par le comité d’éthique de l’institution.

REMARQUE : Gardez l’environnement propre pendant le processus d’injection de virus et d’implantation de la fibre optique. Portez des masques pendant toute la durée de l’opération. Suite à la période de haute expression virale (21-28 jours), une électroacupuncture à ST36 et des manipulations optogénétiques ont été réalisées pour enregistrer la motilité gastrique. Les animaux ont été hébergés dans l’animalerie de l’Institut d’acupuncture et de moxibustion de l’Académie chinoise des sciences médicales, dans des conditions contrôlées (température : 22-24 °C, humidité : 50 %-60 %, cycle lumière-obscurité de 12 h), avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Des informations spécifiques concernant les réactifs et l’équipement utilisés se trouvent dans la table des matériaux.

1. Préparation préopératoire

  1. Désinfectez l’instrument chirurgical qui a subi une stérilisation à haute température et nettoyez la zone chirurgicale avec de l’éthanol à 70 %.
  2. Anesthésie : Administrer une injection intrapéritonéale de 1,25 % de tribromoéthanol (0,2 ml/10 g de poids) à la souris. Évaluez l’absence de réflexe de pincement de l’orteil pour mesurer la profondeur de l’anesthésie.
  3. Rasez les poils de la tête et placez les souris dans un cadre stéréotaxique équipé de barres pour les oreilles et les dents. Appliquez une pommade à l’érythromycine sur les yeux des souris pour prévenir les dommages causés par la lumière chirurgicale.
  4. Faites tremper la virole de fibre optique (taille de la virole : 1,25 mm, virole blanche, type de fibre : 200/0,37, longueur de la fibre : 5,5 mm, modèle d’aiguille de la virole : V8475) dans de l’éthanol à 75 % pendant 30 min, puis rincez l’éthanol à 70 % avec une solution saline.
  5. Chargez le micro-injecteur (1 μL) avec de la paraffine (800-900 nL). Faites fondre le tube de verre et étirez-le en deux sections. Affûtez une section à la pointe à l’aide d’une rectifieuse à aiguilles pour servir d’aiguille d’injection. Afin d’assurer l’étanchéité au gaz du micro-injecteur, remplissez le tube de paraffine et connectez-le au micro-injecteur sur la pointe à l’aide d’un pistolet à colle.

2. Chirurgie d’injection virale

  1. Incisez le cuir chevelu le long de la ligne médiane, des yeux à l’arrière du cou, pour révéler le crâne. Par la suite, excisez les muscles du cou pour exposer l’os occipital. Essuyez la surface de l’os avec H2O2 pendant 30 s, puis nettoyez avec un coton-tige sec pour enlever le fascia sous-cutané et les tissus conjonctifs (Figure 1A).
    REMARQUE : Cette étape consiste à faciliter le recouvrement du ciment dentaire sur l’os occipital, rendant la fibre optique fixée plus stable.
  2. Nivelez le crâne.
    1. Mise à niveau de l’axe X : marquez deux points qui se trouvent à 3,5 mm du point Bregema dans la suture coronale et reliez les deux points pour former une ligne. Le point médian de cette droite est le zéro. La valeur absolue de la différence de l’axe Z à la surface de l’os à 3,5 mm de l’origine doit être ≤ 0,03 mm.
    2. Mise à niveau de l’axe Y : marquez deux points qui sont à 3,5 mm du point Lambda dans la suture lambdoïde, définissez le point médian des deux points et connectez ce point médian au point Lambda pour former une ligne. Le point médian de cette droite est un autre zéro. La valeur absolue de la différence de l’axe Z entre ce zéro et le zéro auquel la surface de l’os a été ajustée pendant l’axe X doit être ≤ 0,03 mm.
  3. Marquez les coordonnées stéréotaxiques de l’injection du virus à l’aide d’un marqueur. Pour PBN : -1,1 mm Antéro-Postérieur (AP, axe Y), -5,45 mm Médial-Latéral (ML, axe X), -3,3 mm Dorsale-Ventrale (DV, axe Z) (avec bregma comme point zéro) ; Pour NTS : -0,35 mm AP, 0,2 mm ML, -3,3 mm DV (avec le point le plus élevé de l’os occipital comme point zéro) ; Pour le DMV : -0,35 mm AP, 0,0 mm (le point le plus élevé de l’os occipital), -3,5 mm DV (avec le point le plus élevé de l’os occipital comme point zéro) (Figure 1B). À l’aide d’une microperceuse à grande vitesse (diamètre de foret de 0,8 mm), pénétrer dans le crâne aux endroits désignés pour exposer la surface du cerveau. Par la suite, utilisez des pinces fines pour percer doucement la dure-mère et retirez-la, appliquez une solution saline sur l’ouverture percée pour maintenir l’humidité à la surface du cerveau.
  4. Appliquez l’adhésif Single Bond Universal sur la surface du crâne (à l’exclusion de la zone percée) et exposez-le à la lumière pendant 30 s pour le durcissement. Il est important de maintenir une surface sèche du crâne avant d’appliquer l’adhésif universel à liaison unique pour assurer une forte adhérence. De plus, l’adhésif doit être évité sur les muscles lors de l’application.
  5. Fixez le micro-injecteur au bras mécanique d’un appareil stéréotaxique. Remplir avec 250 nL de virus (rAAV-CaMKIIα-CRE-WPRE-hGH polyA). Au contact de la pointe de l’aiguille avec la surface du cerveau, réglez la profondeur (Z) à 0. Abaissez l’aiguille jusqu’au site cible dans le noyau parabrachial (PBN) et injectez le virus dans la région PBN à un débit de 35 nL/min. Après l’injection, maintenez l’aiguille en place pendant 10 min, puis rétractez-la à une vitesse de 6 mm/min. Par la suite, plongez l’aiguille dans un tube Eppendorf contenant une solution saline pour le nettoyage (Figure 1C,D).
    REMARQUE : Les doses d’injection de tous les virus suivants sont de 250 nL ; DMV est de 100 nL16,17.
  6. Utiliser le même protocole pour injecter les rAAV-CaMKIIα-DIO-ChrimsonR-WPREs dans le noyau tractus solitarius (NTS) et rAAV-ChAT-GCamp6s-WPRE-hGH-polyA dans le noyau moteur dorsal du vague (DMV) (Figure 1D). Tous les titres de virus sont ≥ 1 × 1012 VG/mL.

3. Chirurgie d’implant de fibre optique

  1. Fixez la virole de fibre optique par le support d’optrode et fixez-la au bras mécanique de l’appareil stéréotaxique. Réglez les coordonnées d’implantation correspondant à une position d’environ 100 μm au-dessus du site d’injection virale du DMV (Figure 1E, F).
  2. Mélangez 1 à 3 g de ciment dentaire avec 1 ml de résine durcie à température ambiante jusqu’à ce que le mélange soit homogène. Administrez rapidement le mélange autour de la virole de la fibre optique et sur la surface du crâne, en laissant 5 mm de la partie supérieure de la virole de la fibre optique exposés. Une fois que le ciment s’est solidifié, relâchez la vis du support, soulevez et retirez le support (Figure 1G).
  3. Utilisez des sutures chirurgicales résorbables (6-0) pour suturer le cuir chevelu occipital postérieur des souris. Retirez les souris du cadre stéréotaxique et placez-les dans un environnement chaud pour récupérer de l’anesthésie. Une fois que les animaux ont montré un mouvement sans restriction, ils ont été relogés dans une cage propre et spacieuse pour l’hébergement, avec 4 à 5 souris logées ensemble et autorisées à accéder librement à la nourriture et à l’eau.
    REMARQUE : Au cours de l’expérience, il a été observé qu’une cage plus grande est bénéfique pour le mouvement normal des souris et est cruciale pour maintenir leur poids. L’espace accru réduit également la probabilité de contact accidentel avec la fibre implantée, minimisant ainsi les dommages potentiels. Des souris pesant 25 g ou plus ont montré des changements significatifs de la pression intragastrique lors de l’acupuncture.

4. Chirurgie d’insertion de ballonnet

  1. Au pic de l’expression virale (21-28 jours), faites jeûner les souris pendant 4-5 heures. Par la suite, anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de 1,25 % de tribromoéthanol (0,1 mL/10 g de poids). 15 min plus tard, administrer une injection intrapéritonéale d’une solution de carbamate d’éthyle à 10 % (0,15 ml/10 g de poids). Évaluez la profondeur de l’anesthésie en confirmant l’absence de réflexe de pincement des orteils.
  2. Rasez les poils des régions abdominales et ST36. Allumez le coussin chauffant et réglez-le pour maintenir une température de 37 °C, l’animal étant maintenu sur le coussin chauffant tout au long de la chirurgie pour assurer une température corporelle constante.
  3. Connectez le ballon en latex à la seringue et injectez-y de l’air pour vérifier que le ballon en latex (BS4 73-2787) n’a pas de fuite d’air.
  4. Exposez l’estomac et une partie du duodénum sous le processus xiphoïde. Faites une petite incision dans le duodénum d’environ 0,3 cm de longueur, de 0,5 à 1 cm distale par rapport au pylore.
  5. Insérez le ballonnet dans l’estomac dans la direction intestinale à travers l’incision duodénale, avec le nœud positionné au niveau du sinus pylorique.
  6. Retirez l’aiguille de la seringue, remplissez 5 ml d’eau pure, évacuez l’air et connectez l’autre extrémité du ballonnet avec la seringue. Tirez le luer lock de la seringue vers le haut pour évacuer le gaz du ballon, puis abaissez le luer lock pour injecter l’eau pure dans le ballonnet. Connectez l’ensemble à un robinet d’arrêt à trois voies et à un transducteur de pression.

5. Enregistrement synchrone de la pression intragastrique et imagerie calcique

  1. Activez le modèle Neurolog Digitimer, le CED Micro1401-4, Inper Studio, le système d’enregistrement à fibre optique multicanal, le logiciel Inper Signal et le logiciel Spike 2. Réglez le logiciel Inper, l’enregistrement du signal calcique pour qu’il soit déclenché par le logiciel Spike2 et le stimulateur optogénétique, en veillant à ce que la stimulation laser et l’acquisition du signal calcique par le logiciel Inper s’alignent sur l’enregistrement de la pression intragastrique par le logiciel Spike2.
  2. Ouvrez tous les robinets d’arrêt à trois voies qui se connectent au ballon, tournez le bouton ZERO sur le modèle de digitimer Neurolog et observez sur le logiciel Spike 2 si la ligne de base est ajustée au point 0. Après avoir égalisé la pression à l’intérieur du ballon avec la pression atmosphérique, injectez de l’eau pure dans le ballon jusqu’à ce que la pression intragastrique s’affiche 15-35 cm H2O. Une fois que la pression intragastrique et les signaux calciques atteignent un état stable, enregistrez une référence de 60 s de pression intragastrique et de signaux calciques dans le DMV (Figure 2A).

6. Électroacupuncture à ST36 et stimulation laser

  1. Insérez une aiguille d’acupuncture (0,25 mm × 25 mm) dans le point d’acupuncture ST36 gauche et connectez-la à un appareil d’électroacupuncture (10 Hz, 1 mA). Administrez l’électroacupuncture pendant 60 secondes tout en enregistrant les changements de pression intragastrique et les signaux calciques.
  2. Après stabilisation de la pression intragastrique de base et des signaux calciques, délivrer une stimulation optogénétique (635 nm, 5 ms, 5 Hz, 30 mW) à travers la fibre pendant 60 s, en surveillant les changements de pression intragastrique et les signaux calciques.
  3. Une fois que la base de référence de la pression intragastrique et des signaux calciques se stabilise à nouveau, combinez l’électroacupuncture à ST36 (10 Hz, 1 mA) avec une stimulation optogénétique (635 nm, 5 ms, 5 Hz) pendant 60 s, et enregistrez les changements de pression intragastrique et les signaux calciques.

7. Examen histologique de l’injection virale et de la mise en place des fibres

  1. Après l’achèvement des protocoles susmentionnés, perfuser les souris avec une solution saline et fixer avec 4 % de paraformaldéhyde par le cœur immédiatement. Récoltez le cerveau des souris. Effectuez une déshydratation en gradient à l’aide de solutions de saccharose à 20 % et 30 %, puis sectionnez après enrobage avec un agent d’enrobage à congélation rapide. Comparez les coupes de cerveau avec les cartes cérébrales de souris pour observer si les positions d’injection de virus et d’implantation de fibre optique étaient précises. Le positionnement précis des injections virales et des implants de fibres a confirmé la validité de la pression intragastrique et des données de signal calcique (Figure 1H,I).

8. Analyse des données

  1. Analysez les données de signal calcique à l’aide du logiciel Inper Data Analysis et les données de motilité gastrique à l’aide du logiciel Spike2. Comparez les différences entre les signaux calciques ou les amplitudes de motilité gastrique au moment de la stimulation (60 s) et celles avant la stimulation (60 s) pour observer les effets régulateurs de différents stimuli sur la motilité gastrique et les signaux calciques. Toutes les données présentées dans la figure 2 sont les graphiques de données d’origine.

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Résultats

Les virus ont été injectés dans le noyau parabrachial (PBN), le noyau tractus solitarius (NTS) et le noyau moteur dorsal du vague (DMV) de souris, avec une fibre implantée dans le DMV (Figure 1A-G). Au cours de la période de pic d’expression virale, des variations de la pression intragastrique et des signaux calciques au sein du DMV ont été enregistrées après électroacupuncture à ST36 et stimulation optogénétique. Le but de cette étude est d’observer les effets régulateurs d...

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Discussion

La recherche scientifique centrale de l’acupuncture concerne la régulation des organes cibles par la stimulation des nerfs autonomes par les points d’acupuncture. Les résultats suggérés par Q. Ma suggèrent que l’influence de l’acupuncture sur la modulation de la fonction des organes à distance provient des réflexes autonomes somatiques qui activent les voies sympathiques et/ou parasympathiques, en particulier celles liées aux maladies gastro-intestinales et à l’inflammation systémique

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82174518, 82474661), les Fonds de recherche fondamentale pour les instituts centraux de recherche sur le bien-être public (ZZ-2023008) et le Projet d’innovation scientifique et technologique de l’Académie chinoise des sciences médicales chinoises (CI2021A03402).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
rAAV-CaMKII&alpha ;-CRE-WPRE-hGH polyA (AAV2/9)CerveauVTARéf.#PT-0020
rAAV-CaMKII&alpha ;-DIO-ChrimsonR-WPREs (AAV2/9)CerveauVTARéf.#PT-12637
rAAV-ChAT-GCamp6s-WPRE-hGH-polyA (AAV2/9)CerveauVTARéf.#PT-10973
Autre
1 &mu ; Micro-injecteur LHamilton80135
Adhésif universel simple unibond EPSP 3MOfficiel du monde dentaire41269
Aiguille d’acupunctureZhongYanTaiHe0,25/13 secondes
CED Micro1401-4CED(Angleterre)1401-4
Ciment dentaire/Résine durcie à température ambianteYAMAHACHI DENTAIREN/A
Pinces finesRWDRéférence F11028-13
Tube en verreInstruments de précision mondiaux504949
HANS-200AInstitut HANSHANS-200
Inper Signal (logiciel)InperN/A
Inper Studio(Vénus)InperRéf. B1502
Ballon en latexAppareil HarwardBS4 73-2787
Système d’enregistrement à fibre optique multicanal (Vista Pro)InperR5268
Modèle de digitimer neurolog  ;DigitimerNL900D
Virole en fibre optique  ;InperRéf. V8475
Spike 2 (logiciel)CED(Angleterre)N/A
Instruments stéréotaxiques (avec calculateur de coordonnées)David Kopf InstrumentsKOPF 942
TribromoéthanolSigmaRéf. T48402
tribromoéthanolSigma  ;Réf. T48402

Références

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Mots-clés

Stimulation optog n tiqueEnregistrement du signal calciqueR gulation des circuits neurauxMotilit gastriqueFonction visc raleIndicateurs g n tiquement encod sEnregistrement en temps r elCorr lation cerveau comportement

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