Ici, nous présentons un protocole pour évaluer les effets cardioprotecteurs de la signalisation NRG1/ErbB4 dans un modèle de rat de lésion d’ischémie-reperfusion en évaluant le stress oxydatif et les voies de signalisation apoptotiques.
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Article de recherche
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Ici, nous présentons un protocole pour évaluer les effets cardioprotecteurs de la signalisation NRG1/ErbB4 dans un modèle de rat de lésion d’ischémie-reperfusion en évaluant le stress oxydatif et les voies de signalisation apoptotiques.
L’ischémie-reperfusion myocardique (MIRI) constitue un obstacle important à la prise en charge des maladies cardiovasculaires. La physiopathologie de l’IRIM est complexe, impliquant un stress oxydatif, une surcharge en calcium, une inflammation et une apoptose. La voie de signalisation NRG1/ErbB4 a été impliquée dans la modulation des réponses au stress oxydatif dans le cœur, réduisant potentiellement les dommages cellulaires causés par les radicaux libres. Cette étude visait à élucider les mécanismes moléculaires par lesquels la voie NRG1/ErbB4 confère une protection dans un modèle de rat de lésion d’ischémie-reperfusion myocardique (MIRI). Un modèle MIRI de rat a été établi, impliquant 30 rats Sprague-Dawley mâles adultes répartis au hasard en cinq groupes : contrôle, opération simulée, MIRI, NRG1 recombinant et AG1478. Les concentrations de NRG1 dans les tissus cardiaques ont été mesurées par ELISA, tandis que les concentrations de protéines p-ErbB4 et totales ErbB4 ont été évaluées par Western blot. L’apoptose des cardiomyocytes et les taux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) ont été évalués par cytométrie en flux. Dans le groupe MIRI, les niveaux de NRG1 étaient significativement réduits par rapport aux groupes témoin et opération simulée (p < 0,05). Le traitement par NRG1 recombinant a entraîné une augmentation marquée des taux de NRG1 dans le tissu cardiaque, ainsi qu’une augmentation du rapport d’expression p-ErbB4/ErbB4 (p < 0,05). Le groupe AG1478 présentait des niveaux de NRG1 plus faibles et un rapport p-ErbB4/ErbB4 réduit par rapport au groupe NRG1 recombinant (p < 0,05). En termes d’apoptose et de taux de ROS, le groupe MIRI a montré des taux significativement plus élevés que les groupes témoin et opération simulée (p < 0,05). Le traitement recombinant NRG1 a significativement réduit l’apoptose des cellules myocardiques et les taux de ROS (p < 0,05), tandis que AG1478 a également atténué ces effets, mais dans une moindre mesure. La voie de signalisation NRG1/ErbB4 joue un rôle protecteur essentiel dans l’IRM chez le rat. La supplémentation en NRG1 exogène augmente efficacement les niveaux de NRG1 dans le cœur, active la voie de signalisation ErbB4, réduit l’apoptose des cellules myocardiques et diminue les niveaux de ROS, atténuant ainsi les dommages induits par MIRI.
L’ischémie-reperfusion myocardique (MIRI) représente un défi critique dans la prise en charge des maladies cardiovasculaires1. Bien que le rétablissement du flux sanguin vers le myocarde ischémique soit essentiel pour traiter l’infarctus du myocarde, la reperfusion elle-même peut exacerber les lésions du tissu cardiaque, limitant ainsi l’effet thérapeutique. Les mécanismes sous-jacents à l’IRIM sont complexes et comprennent divers processus physiopathologiques, parmi lesquels le stress oxydatif, la surcharge en calcium, les réponses inflammatoires et l’apoptose 2,3,4.
Le facteur de croissance nerveuse 1 (NRG1) et son récepteur Erb-B2 Receptor Tyrosine Kinase 4 (ERBB4) jouent un rôle central dans la physiologie et la pathologie cardiaques. NRG1, un ligand extracellulaire, interagit avec le récepteur ErbB4 pour activer une cascade de voies de signalisation cruciales pour le développement cardiaque, le maintien de l’intégrité structurelle et la réponse aux lésions cardiaques5. De nouvelles preuves mettent en évidence le rôle joué par la voie de signalisation NRG1/ErbB4 dans les maladies cardiaques. Dans des conditions d’ischémie-reperfusion myocardique, l’expression et la fonction de NRG1 peuvent être altérées6. Des études antérieures ont suggéré que NRG1 favorise la survie des cellules myocardiques et inhibe l’apoptose excessive en activant ErbB4. De plus, la voie de signalisation NRG1/ErbB4 peut réguler la réponse au stress oxydatif dans le cœur et atténuer les dommages cellulaires causés par les radicaux libres. Par conséquent, il est essentiel d’élucider la fonction de la voie de signalisation NRG1/ErbB4 dans l’IRIM pour comprendre la base biologique de cette lésion et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques 7,8.
Cette étude suppose que la voie de signalisation NRG1/ErbB4 joue un rôle protecteur dans l’IRMI. Par conséquent, dans cette étude, un modèle de rat d’ischémie-reperfusion myocardique a été construit pour étudier systématiquement le mécanisme de la voie de signalisation NRG1/ErbB4 dans MIRI. En régulant la concentration de NRG1 et en observant les changements dans l’état d’activation d’ErbB4, le taux d’apoptose des cellules myocardiques et le niveau de stress oxydatif. Cette étude tente de révéler le mécanisme moléculaire par lequel la voie de signalisation NRG1/ErbB4 exerce un effet protecteur dans MIRI. La nouveauté de cette étude réside dans la révélation de l’importance de la voie de signalisation NRG1/ErbB4 dans les lésions d’ischémie-reperfusion myocardique, et également dans l’offre d’une nouvelle perspective pour les stratégies de traitement des maladies cardiaques basées sur cette voie.
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Animaux d’expérimentation
Trente rats Sprague-Dawley mâles adultes, âgés de 8 semaines et pesant de 180 à 200 g, ont été obtenus auprès d’un vendeur commercial. Ces rats ont été logés dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes pendant 1 semaine avant les expériences. Les expériences ont reçu l’approbation du Comité d’éthique du premier hôpital de Nanping (n° NPSY202208010).
Modèles animaux de lésions d’ischémie-reperfusion myocardique
Les rats ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 3 % à une dose de 50 mg/kg. Après avoir confirmé l’absence de réflexes, les animaux ont été placés en position couchée, et le cou et la poitrine ont été rasés et désinfectés avec de l’éthanol à 75 %. Une incision cervicale médiane (~2 cm) a été pratiquée pour exposer la trachée, suivie d’une intubation orale à l’aide d’un cathéter de 16 G pour maintenir la perméabilité des voies respiratoires pendant la chirurgie. Par la suite, le muscle grand pectoral gauche a été soigneusement disséqué pour exposer les troisième et quatrième espaces intercostaux. Une thoracotomie a été pratiquée en faisant une incision entre ces espaces, et le péricarde a été ouvert pour exposer complètement le cœur. Pour induire une ischémie, l’artère coronaire descendante antérieure gauche (DAL) a été ligaturée à l’aide d’un 8-0 Suture en nylon. Un tube en polyéthylène (PE-10) a été inséré entre le DAL et la ligature pour permettre une occlusion réversible. L’ischémie a été maintenue pendant 45 min, confirmée visuellement par un blanchiment myocardique et des modifications de l’ECG. La reperfusion a été initiée en relâchant la ligature, permettant à la circulation sanguine de reprendre pendant 3 h. La ligature a été retirée 45 minutes plus tard.
Groupement expérimental
Les rats ont été répartis au hasard en cinq groupes (n = 6 chacun). (1) Groupe témoin : les rats ont reçu des soins standard sans aucune intervention chirurgicale ou traitement. (2) Groupe d’opération simulée : les rats ont subi une thoracotomie et un filetage de l’artère coronaire descendante antérieure gauche (DAL) sans ligature, servant de témoins chirurgicaux. (3) Groupe MIRI : les rats ont subi une induction de lésions d’ischémie-reperfusion myocardique et ont reçu une solution saline normale par voie intragastrique comme véhicule témoin. (4) Groupe NRG1 recombinant : les rats ont reçu une injection intraveineuse de NRG1 humain recombinant (rh-NRG1) à une dose de 5 mg/kg, 30 min avant la thoracotomie, suivie de la procédure MIRI. (5) Groupe AG1478 : des rats ont reçu du rh-NRG1 par voie intraveineuse (5 mg/kg) associé à de l’AG1478 (20 mg/kg), un inhibiteur de la kinase du récepteur ErbB, 30 minutes avant la thoracotomie, puis ont subi la procédure MIRI.
Dosage immuno-enzymatique (ELISA)
Les animaux ont été euthanasiés par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (150 mg/kg). Les tissus cardiaques ont été prélevés immédiatement après la reperfusion et homogénéisés sur de la glace dans un volume approprié de PBS glacé. Les homogénats ont ensuite été centrifugés à 1200 x g pendant 10 min à 4 °C pour séparer le surnageant. La concentration de NRG1 dans le surnageant a été quantifiée à l’aide d’un kit ELISA NRG1 disponible dans le commerce, en suivant exactement les instructions du fabricant. En bref, des échantillons et des étalons ont été ajoutés dans les puits de plaques ELISA, incubés à température ambiante pendant la durée recommandée, suivis d’un lavage et d’un ajout d’anticorps de détection. L’absorbance a été mesurée à la longueur d’onde spécifiée à l’aide d’un lecteur de microplaques, et les niveaux NRG1 ont été calculés sur la base de la courbe standard. Le volume de l’échantillon était de 100 μL, la dilution de l’anticorps était de 1:100 et la longueur d’onde pour la mesure de l’absorbance était fixée à 450 nm.
Analyse par transfert Western
Des tissus cardiaques ont été excisés chez des rats anesthésiés et rincés dans du PBS glacé pour éliminer le sang résiduel. Pour chaque cœur, environ 0,5 g de tissu ventriculaire gauche a été pesé et placé dans 500 μL de tampon de lyse RIPA fraîchement préparé. Le tissu a ensuite été homogénéisé sur de la glace à l’aide d’un broyeur mécanique jusqu’à ce qu’il soit complètement lysé, suivi d’une incubation sur glace pendant 30 minutes pour assurer une extraction complète des protéines. Les lysats ont été centrifugés à 12 000 × g pendant 15 min à 4 °C pour éliminer les débris. Les concentrations en protéines ont été déterminées à l’aide d’un kit de dosage BCA. Des quantités égales de protéines totales (p. ex., 30 μg par voie) ont été chargées et séparées par SDS-PAGE. Les protéines ont ensuite été transférées sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (PVDF) à l’aide d’un système de transfert humide à 100 V pendant 90 min. Les membranes ont été bloquées avec du lait écrémé en poudre à 5 % dans une solution saline tamponnée au Tris avec 0,1 % de Tween-20 (TBST) pendant 1 h à température ambiante. Par la suite, les membranes ont été incubées pendant la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre l’ErbB4 phosphorylé (p-ErbB4) et l’ErbB4 total, chacun dilué à l’échelle 1:1000. Après le lavage, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) pendant 1 h à température ambiante. Les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide d’un substrat de chimiluminescence améliorée (ECL) et capturées à l’aide d’un système d’imagerie sur gel. Les intensités de bande ont été quantifiées à l’aide du logiciel ImageJ, et le rapport entre p-ErbB4 et ErbB4 total a été calculé pour évaluer les niveaux de phosphorylation.
Cytométrie en flux
L’apoptose des myocytes cardiaques a été évaluée par cytométrie en flux. Les tissus cardiaques ont été finement hachés et digérés par voie enzymatique à l’aide d’un mélange de collagénase de type II (1 mg/mL) et de protéase (p. ex., trypsine, 0,25 %) à 37 °C, en agitant doucement pendant 20 à 30 minutes. La digestion enzymatique a été interrompue par l’ajout d’un volume égal de sérum de veau fœtal. La suspension cellulaire a été filtrée à travers un treillis en nylon de 70 μm et centrifugée à 300 × g pendant 5 min à 4 °C pour recueillir les cellules. La pastille cellulaire a été remise en suspension dans un tampon de liaison, puis incubée avec de l’annexine V-FITC et de l’iodure de propidium (PI) selon le protocole du fabricant. Après une incubation de 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité, les échantillons ont été immédiatement analysés par cytométrie en flux. Les cellules apoptotiques précoces ont été identifiées comme étant positives pour l’annexine V et PI négatives, tandis que les cellules apoptotiques ou nécrotiques tardives étaient positives pour les deux marqueurs. Les taux d’apoptose ont été quantifiés et comparés entre les groupes expérimentaux. La stratégie de porte adopte un réglage de porte transversale/rectangulaire. Lors de la détection sur machine, la porte transversale a été définie sous la forme d’une ligne pointillée et tous les paramètres ont été appliqués pour assurer l’uniformité du filtrage des données. Le débit a été ajusté en fonction de la concentration de la cellule (maintenue à 1000 cellules/s), et le chargement de l’échantillon à basse vitesse permet d’éviter le colmatage de la buse.
Détection des niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS)
Les cardiomyocytes ont été isolés des tissus cardiaques, suivis d’une centrifugation à 300 × g pendant 5 minutes et d’un lavage deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Les cellules ont ensuite été incubées avec un colorant 10 μM de diacétate de 2',7'-dichlorofluorescéine (DCFDA) à 37 °C pendant 30 minutes dans l’obscurité, en suivant les instructions du fabricant. Après la coloration, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS pour éliminer l’excès de colorant non lié. Les niveaux de ROS intracellulaires ont été mesurés immédiatement par cytométrie en flux, détectant l’intensité de fluorescence émise lors de l’oxydation de la DCFDA. L’intensité moyenne de fluorescence (MFI) de chaque échantillon a été quantifiée à l’aide du logiciel FlowJo pour comparer les niveaux de ROS entre les groupes expérimentaux. La stratégie de déclenchement est celle décrite ci-dessus (section cytométrie en flux).
Analyse statistique
L’analyse des données a été effectuée à l’aide du logiciel SPSS, présenté sous forme de moyenne ±écart-type (ET). Une analyse unidirectionnelle de la variance avec le test post-hoc de Tukey a été effectuée pour comparer plusieurs groupes, et le test t de Student a été utilisé pour des comparaisons par paires. Une valeur p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
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NRG1 exerce un effet protecteur contre l’apoptose des cardiomyocytes induite par MIRI
L’analyse par cytométrie en flux a indiqué une augmentation notable des taux d’apoptose dans le groupe MIRI par rapport aux groupes témoin et simulé (P < 0,05). Les groupes recombinant NRG1 et AG1478 ont tous deux présenté des taux d’apoptose significativement réduits par rapport au groupe MIRI (P < 0,05). En revanche, le groupe NRG1 recombinant a présenté un taux d’apoptose réduit par rapport au groupe AG1478 ...
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L’IRM continue de poser un obstacle important dans la prise en charge des maladies cardiovasculaires, étant donné que le rétablissement de la perfusion dans le tissu cardiaque ischémique peut paradoxalement intensifier les lésions myocardiques. L’apparition de l’IRMI est multifactorielle, impliquant un stress oxydatif, une surcharge calcique, des réactions inflammatoires et un dysfonctionnement mitochondrial 9,10.
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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Ce travail a été soutenu par la Fondation des sciences naturelles de la province du Fujian (numéro de subvention.2024J011604,2023J011877) et le projet de recherche sur la jeunesse de la Commission provinciale du foyer du Fujian (numéro de subvention.2019-9-25).
CONTRIBUTION DE L’AUTEUR :
Maozhi Huang a dirigé la conception et le design du projet de recherche, planifié et détaillé le protocole expérimental, participé à des expériences clés et rédigé la première ébauche du manuscrit. Jianping Zheng a contribué à parts égales à l’ensemble de la recherche, y compris la conception, la collecte de données et la rédaction du manuscrit. Xianlu Cheng a contribué à la conception de la recherche, a collecté des échantillons et analysé des données. Chaoqun : Vous avez participé à l’écriture et à la structuration du manuscrit. Ziguo Chen a vérifié les données et a aidé à améliorer la section méthodes et matériaux. Ling Jiang a fourni un contrôle et des conseils académiques tout au long du processus de recherche. Shanghua Xu a guidé l’orientation générale du projet, coordonné les ressources et examiné et révisé le manuscrit final.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| AG1478 | Technologie BioLab | WD102925 | Médicament d’intervention AG1478 |
| Kit de détection de l’apoptose Annexin V-FITC/PI | Meilune | MA0220 | Apoptose de la cytométrie en flux |
| Kit de dosage des protéines BCA | Meilunbio | Référence : MA0082-2 | Quantification des protéines WB |
| Système d’imagerie par chimiluminescence | Bio-Rad (États-Unis) | ChemiDoc Touch | Imagerie par transfert Western |
| Chlorhydrate de cyamazine | Santé animale Huamu | 20220601 | Anesthésique pour la modélisation animale |
| Kit de détection ECL | Meilunbio | Référence : MA0186-1 | Chimiluminescence WB |
| ERbB4 | Proteintech | 19943-1-AP | Anticorps primaire WB |
| Cytomètre en flux | BD | FACSCalibur | Détection de l’apoptose par cytométrie en flux |
| GAPDH | Proteintech | Référence 60004-1-IG | Anticorps de contrôle de la charge WB |
| IgG anti-souris de chèvre conjuguée HRP (H+L) | Proteintech | SA00001-1 | Immunohistochimie |
| IgG anti-lapin de chèvre conjuguée HRP (H+L) | Proteintech | SA00001-2 | Immunohistochimie |
| Lecteur de microplaques | Thermo | K3 | Détection ELISA |
| PAGE Kit de préparation de gel 15 % | Meilunbio | MA0384 | Électrophorèse WB |
| p-ERbB4 | Affinité | AF3445 | Anticorps primaire WB |
| Marqueur protéique pré-coloré | Meilunbio | Référence MA0342 | Électrophorèse WB |
| Rat Neuregulin-1 (NRG-1) ELISA Kit | Meimian | MM-61434R2 | Détection ELISA |
| Kit de dosage des espèces réactives de l’oxygène (ROS) | Meilune | MA0219 | Dosage de la BM |
| rhNRG1 | Technologie BioLab | WD091127 | Médicament d’intervention NRG1 |
| Tampon de lyse RIPA | Meilunbio | ; MA0151 ; ; ; ; ; ; ; | Extraction de protéines pour Western blot |
| Tampon de chargement SDS-PAGE (5x) | Beyotime | P0015L | Électrophorèse WB |
| Dodécylsulfate de sodium | Sigma | 151-21-3 | Électrophorèse WB |
| Su Tai 50 | Virbac (France) | 8X22A | Anesthésique pour la modélisation animale |
| Système d’électrophorèse verticale des protéines | Bio-Rad (États-Unis) | POWER PAC 200 | Électrophorèse par western blot |
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