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Explorer les interactions protéine-glycane : progrès de la résonance magnétique nucléaire

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DOI :

10.3791/68674

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26 août 2025

 ,  , 
1Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis (IBqM), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2National Center for Structural Biology and Bioimaging (CENABIO), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 3Laboratory of Connective Tissue, Clementino Fraga Filho University Hospital

Dans cet article

Résumé

Ce protocole basé sur la RMN étudie les interactions protéine-glycane faibles à l’aide de la cyanovirine-N et du D-mannose. En combinant des méthodes de détection de ligands et de protéines, il cartographie les sites de liaison, détecte les effets allostériques et identifie les complexes de rencontre. L’approche décrit la préparation des échantillons et l’analyse des données, offrant des informations structurelles et dynamiques précieuses pour les mécanismes de diagnostic et de reconnaissance spécifiques aux glycanes.

Résumé

Les interactions protéine-glycane sont au cœur de nombreux processus biologiques et sont de plus en plus reconnues comme des cibles prometteuses pour les stratégies de diagnostic des maladies infectieuses, inflammatoires et néoplasiques. Cependant, la caractérisation de ces interactions, en particulier lorsqu’elles sont faibles et transitoires, reste techniquement difficile. La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) offre des avantages uniques pour l’étude de telles interactions dans des conditions quasi physiologiques, fournissant des informations à résolution atomique sur les aspects structurels et dynamiques. Dans cette étude, nous présentons un protocole RMN intégré conçu pour étudier les interactions protéine-glycane de faible affinité en utilisant la lectine cyanovirine-N spécifique du mannose et le monosaccharide D-mannose comme système modèle. Le protocole combine des approches RMN basées sur des ligands et des protéines pour cartographier de manière exhaustive les sites de liaison et détecter les événements de liaison subtils, y compris les effets allostériques potentiels ou les complexes de rencontre. Les étapes critiques du protocole comprennent une préparation minutieuse des échantillons, un contrôle précis des concentrations et une normalisation spectrale pour assurer la reproductibilité et la fiabilité des données. La RMN en solution permet de détecter des interactions transitoires souvent inaccessibles par d’autres techniques. Bien que les interactions faibles soient essentielles à la vie, il existe un biais dans la littérature en faveur des complexes de plus haute affinité, même si les complexes de faible affinité sont pertinents dans de nombreuses fonctions biologiques importantes, telles que la transduction du signal et la communication cellule-cellule. Cette technique fournit une plate-forme puissante pour étudier la reconnaissance protéine-glycane et peut servir d’outil précieux pour identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques sur la base d’interactions spécifiques aux glycanes.

Introduction

Les interactions protéine-glycane sont fondamentales pour un large éventail de processus biologiques, notamment la reconnaissance cellule-cellule, la modulation de la réponse immunitaire et les interactions pathogène-hôte 1,2. Ces interactions moléculaires sont très spécifiques et dynamiques et jouent un rôle crucial dans les mécanismes physiologiques et pathologiques 3,4,5. Un exemple classique de telles interactions se produit avec les lectines, des protéines qui reconnaissent et se lient spécifiquement aux glycanes. La cyanovirine-N (CVN), par exemple, a été largement étudiée en tant que modèle expérimental en raison de sa capacité à interagir en haute affinité avec des oligosaccharides de mannoseélevés 5,6,7.

En plus des lectines, de nombreuses protéines glycosylées, telles que les intégrines, jouent également un rôle essentiel dans la reconnaissance et la signalisation cellulaire. Les intégrines sont des récepteurs transmembranaires qui subissent fréquemment la glycosylation de leurs sous-unités, influençant leur stabilité et leur affinité pour les ligands, y compris les glycanes 5,8,9,10. Cependant, la caractérisation structurale de ces interactions reste difficile en raison de l’hétérogénéité intrinsèque et de la flexibilité des glycanes, ce qui complique les approches traditionnelles de la biologie structurale. Dans ce contexte, le développement de méthodologies avancées capables de capturer ces interactions en solution est d’une grande valeur pour ce domaine, en particulier pour la glycobiologie11,12.

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est apparue comme un outil puissant pour étudier les interactions protéine-ligand au niveau atomique. Contrairement à d’autres techniques, telles que la cristallographie aux rayons X et la cryo-microscopie électronique, la RMN permet d’étudier les interactions biomoléculaires dans des conditions quasi physiologiques, en fournissant des informations à la fois sur la structure et la dynamique. Cette flexibilité permet aux chercheurs de moduler des paramètres environnementaux tels que le pH (généralement entre 4,0 et 8,0), la force ionique (par exemple, 0-500 mM NaCl) et la température (généralement 273-330 K), adaptant ainsi les conditions aux spécificités des complexes protéine-glycane. De plus, la RMN est particulièrement avantageuse pour l’analyse des interactions transitoires et faibles, qui sont souvent caractéristiques des événements de reconnaissance protéine-glycane13,14.

Plusieurs techniques de RMN ont été employées pour étudier les interactions protéine-glycane, en utilisant des approches basées sur les protéines et les ligands. Du point de vue des protéines, le titrage hétéronucléaire par cohérence quantique unique (HSQC) est largement utilisé pour cartographier les sites de liaison en surveillant les perturbations de déplacement chimique lors de l’ajout de ligands. Les expériences de dispersion de relaxation permettent de détecter les processus conformationnels et d’échange chimique se produisant à l’échelle de la microseconde à la milliseconde, ce qui donne un aperçu des aspects dynamiques de la reconnaissance des glycanes15,16. Ces techniques basées sur les protéines nécessitent généralement des concentrations d’échantillon comprises entre 50 μM et 2 mM, en fonction de la stabilité des protéines et de l’efficacité du marquage17,18.

Les techniques de RMN basées sur les ligands offrent des informations complémentaires en se concentrant sur les changements de glycanes pendant la liaison. La différence de transfert de saturation (STD-NMR) est particulièrement utile pour identifier les épitopes de glycanes impliqués dans la reconnaissance, car elle sature sélectivement les signaux RMN des régions de ligands en contact étroit avec la protéine19,20. Les ligands d’eau observés par spectroscopie de gradient (WaterLOGSY)21,22 et la spectroscopie à effet de sur-valeur nucléaire transférée (Tr-NOESY) fournissent des moyens supplémentaires pour évaluer la liaison des ligands et les changements de conformation au cours des interactions23. De plus, les expériences de relaxation Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) aident à identifier les interactions faibles et transitoires qui sont difficiles à détecter avec les méthodes conventionnelles24. Les expériences basées sur des ligands sont souvent réalisées à des concentrations de protéines de 10 à 50 μM et peuvent nécessiter une optimisation des temps de mélange et des paramètres de saturation25. Notamment, ces méthodes peuvent être limitées par la faible solubilité des glycanes ou le faible rapport signal/bruit lorsque l’on travaille avec de petits ligands.

Ensemble, ces méthodes de RMN fournissent un cadre complet pour élucider les propriétés structurelles et dynamiques des interactions protéine-glycane. Avec les progrès continus dans les stratégies de sensibilité et de marquage isotopique, cette technique devient de plus en plus essentielle en glycobiologie, offrant de nouvelles perspectives sur les mécanismes de reconnaissance moléculaire avec des applications potentielles dans le développement de médicaments et la découverte de biomarqueurs. Néanmoins, le succès de ces approches dépend de facteurs tels que l’homogénéité de l’échantillon, la complexité des glycanes et la présence de régions flexibles ou désordonnées qui peuvent élargir les signaux RMN ou entraver l’interprétation26. La RMN est une méthode puissante pour étudier les événements transitoires, ce qui constitue un défi majeur en biologie structurale.

CVN reconnaît les résidus de mannosyle liés à la α(1,2) présents dans les oligosaccharides à haute teneur en mannose avec des affinités nanomolaires 27,28,29. Cependant, il reconnaît mal le monosaccharide D-mannose. Dans le présent travail, nous avons étudié l’interaction du CVN avec le D-mannose comme moyen d’illustrer comment la RMN est puissante dans la compréhension des interactions transitoires.

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Protocole

REMARQUE : Effectuer toutes les étapes impliquant des cultures bactériennes et des préparations tampons conformément aux protocoles de biosécurité de l’établissement. Utilisez de l’équipement de protection individuelle (EPI) et, lorsque vous manipulez des cultures ouvertes ou des produits chimiques, travaillez dans une enceinte de biosécurité ou une hotte chimique si nécessaire.

1. Expression de la cyanovirine-N

  1. Transformer des cellules E . coli BL21 à l’aide d’un plasmide codant pour le gène CVN inséré dans le vecteur pET26a.
  2. Cultivez les cellules dans 1 L de Super Broth (32 g de tryptone, 20 g d’extrait de levure, 5 g de NaCl par L), complété par de la kanamycine (50 μg/mL), 0,5 % (p/v) de glucose et 1,6 mM de MgSO4. Incuber sous agitation continue à ~250 tr/min à 37 °C.
  3. Pour la production de CVN marqué au 15N, cultiver les cellules dans un milieu minimal M9 modifié en utilisant 15NH4Cl comme seule source d’azote.
    1. Préparez 1 L de milieu minimal M9 en mélangeant 200 mL de solution stérile de sels 5x M9 contenant 64 g/L de Na2HPO4, 15 g/L de KH2PO4, 2,5 g/L de NaCl, 5 g/L de NH4Cl.
    2. Ajouter 2 mL de 1 M MgSO4 (0,22 μm stérilisé par filtre), 0,1 mL de 1 M CaCl2 (0,22 μm stérilisé par filtre) et 4 g de glucose (concentration finale de 0,4 %, dissous dans de l’eau distillée stérile et 0,22 μm stérilisé par filtre).
    3. Porter le volume final à 1 L avec de l’eau distillée stérile.
      REMARQUE : Des suppléments tels que des acides aminés ou des vitamines peuvent être ajoutés au besoin.
  4. Surveiller la culture jusqu’à ce qu’elle atteigne une densité optique (OD600) d’environ 1,2. Ensuite, ajoutez de l’isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 1,0 mM pour induire l’expression de la protéine.
  5. Incuber pendant 20 h après l’induction à 37 °C.
  6. Récoltez les cellules par centrifugation à 7 000 × g pendant 10 min à 4 °C.
  7. Isolez la fraction périplasmique comme suit :
    1. Remettre les pastilles en suspension dans 0,4 volume de tampon Tris-HCl de 30 mM (pH 8,0) contenant 20 % de saccharose et 1 mM d’EDTA et incuber à température ambiante en agitant pendant 10 min.
    2. Centrifugeuse à 10 000 × g pendant 10 min à 4 °C.
    3. Remettez en suspension les granulés obtenus dans 0,4 volume d’eau distillée glacée et incubez sur de la glace en secouant pendant 10 min.
    4. Centrifuger à nouveau à 10 000 × g pendant 10 min à 4 °C.
    5. Recueillir le surnageant, qui correspond à la fraction périplasmique, pour l’extraction des protéines.
      REMARQUE : Tous les tampons doivent contenir un cocktail d’inhibiteurs de protéase pour prévenir la dégradation des protéines.

2. Expériences de RMN

REMARQUE : Toutes les expériences ont été acquises à 14,1 T à l’aide d’une sonde de détection inverse à triple résonance 1H/15N/13C (voir le tableau des matériaux) à 298 K.

  1. Expériences basées sur des ligands
    1. Préparation des échantillons
      1. Préparez deux échantillons : l’un contenant du CVN et l’autre sans CVN (contrôle du ligand uniquement). Chaque échantillon contient 600 μL de CVN 80 μM dans un tampon de phosphate de sodium (pH 7,4) contenant 50 mM de NaCl.
      2. Ajouter le D-mannose à une concentration finale de 4 mM.
      3. Ajouter 5 % (v/v) deD2O à chaque échantillon.
      4. Transférez l’échantillon dans un tube RMN de 5 mm.
      5. Utilisez un excès molaire de 50 fois du ligand par rapport à la protéine.
        REMARQUE : Un excès de ligand dans la plage de 10 à 1000 fois est généralement recommandé, avec des excès plus faibles préférés pour les petites protéines.
    2. Acquisition spectrale pour l’assignation du D-mannose
      1. Acquérez des spectres 2D TOCSY et 2D 1 H-13C HMBC à l’aide de séquences d’impulsions standard :
        2D TOCSY : Spectroscopie de corrélation totale sensible à la phase (TOCSY) avec sculpture d’excitation pour la suppression de l’eau (DIPSI2ESGPPH).
        HMBC 2D : corrélationhétéronucléaire multiple à liaisons multiples 1 H-13C avec sélection de gradient et acquisition non découplée (HMBCGPNDQF).
        REMARQUE : Ces expériences ont été réalisées dans le but d’attribuer le D-mannose, mais ne sont pas présentées, car l’attribution du décalage chimique n’entre pas dans le cadre de cette étude.
    3. Cartographie de la liaison du ligand par perturbation par décalage chimique (CSP) du ligand
      1. Pour la préparation des échantillons et l’acquisition de spectres HSQC ¹H-¹³C, préparer une solution de 4 mM de D-mannose dans un tampon de phosphate de sodium (pH 7,4), avec 50 mM de NaCl et 5 % de D2O. Divisez la solution en deux échantillons : l’un avec 80 μM CVN et l’autre sans CVN (ligand de référence uniquement).
        REMARQUE : Ces spectres seront utilisés pour déterminer le CSP du D-mannose lors de l’interaction avec le CVN.
      2. Pour la configuration des paramètresd’acquisition HSQC 1 H-13C, utilisez la séquence d’impulsions standard HSQCETGPSI (sélection de gradient et sensibilité 1 H-13C HSQC améliorée). Définissez les paramètres suivants pour l’acquisition :
        Domaine temporel (TD) : 1024 × 128 points complexes (dimensions ¹H × ¹³C)
        Largeur spectrale (SW) : 10,0171 ppm (6009,615 Hz) pour ¹H, 80 ppm (12069,106 Hz) pour ¹³C
        Fréquences porteuses : 4,7 ppm pour ¹H, 75 ppm pour ¹³C
        - Nombre de scans : 448.
      3. Calculez le CSP à l’aide de l’équation suivante :
        figure-protocol-1
        où figure-protocol-2 et figure-protocol-3 représentent les différences de décalage chimique entre le D-mannose en présence de CVN (figure 1A, étiqueté en rouge) et le D-mannose libre (figure 1B).
    4. Cartographie de la liaison du ligand par la différence de transfert de saturation (STD)
      1. Créez un nouvel ensemble de données et configurez les paramètres pour les expériences STD-NMR. Deux stratégies expérimentales peuvent être appliquées : (i) le criblage de différentes fréquences de saturation pour optimiser le rapport signal/bruit ; (ii) fixer la fréquence de saturation et faire varier le temps de saturation pour évaluer l’accumulation.
      2. Mettre en place des expériences RMN 1D ¹H à l’aide de la séquence d’impulsions zgpr. Réglez le spectromètre sur ¹H, effectuez un calage et mesurez une impulsion dure de 90° (par exemple, ~10 μs à une atténuation de -10,6 dB, équivalente à ~11,482 W).
      3. Centrer la fréquence porteuse ¹H à environ 4,7 ppm, correspondant au signal d’eau.
      4. Sélectionnez la séquence d’impulsions STDDIFFESGP.3 et configurez les paramètres d’acquisition comme suit :
        Réglez la largeur spectrale en fonction des exigences de l’échantillon.
        Réglez le délai entre les balayages (d1) sur 4 s.
        Définissez le temps de saturation (d20) en fonction de l’expérience souhaitée.
        Chargez le FQ2LIST contenant la fréquence de saturation hors résonance (-40 ppm) et les fréquences à résonance pour saturer uniquement le signal protéique.
        REMARQUE : Les fréquences de résonance doivent correspondre à des protons protéiques et doivent être à au moins 1000 Hz de tout signal de ligand pour éviter la saturation directe.
      5. Testez les fréquences de saturation en résonance suivantes pour déterminer les conditions optimales : -0,59 ppm, 0,73 ppm et 8,1 ppm (voir Figure 2A).
        REMARQUE : 0,73 ppm a été sélectionnée comme fréquence de saturation à la résonance, car elle offrait le meilleur rapport signal/bruit. En utilisant cette fréquence, le facteur d’amplification STD (ASTD) a été quantifié en fonction du temps de saturation. À cette fin, les spectres STD ont été acquis à différents temps de saturation (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 et 4 s) pour construire la courbe d’accumulation STD (Figure 2B). Les valeurs correspondantes de ASTD ont ensuite été tracées en fonction du temps de saturation (Figure 2C), ce qui permet d’évaluer l’efficacité du transfert de saturation, qui est proportionnelle au temps et à la proximité du ligand hydrogène à la protéine. Un facteurSTD est défini comme suit :
        figure-protocol-4
        ISTD est la différence d’intensité du signal entre les spectres de résonance activée et désactivée, I0 est l’intensité du signal dans le spectre de résonance désactivée, [L]T est la concentration totale du ligand et [P] est la concentration protéique. Cette normalisation tient compte des effets de concentration et permet des comparaisons dans différentes conditions expérimentales. La STD repose sur la diffusion de spin et le culbutage moléculaire lent pour transférer efficacement la saturation de la protéine au ligand lié. Des protéines plus grandes (culbutage lent) permettent une saturation et une propagation plus efficaces de l’aimantation au sein de la protéine 19,30,31,32.
      6. Réglez le nombre de balayages (ns) sur 64 et faites la moyenne de l4 fois (boucle 4) de l’expérience.
      7. Calculez le nombre total de balayages comme suit : Nombre total de balayages = ns × l4. Utilisez 32 768 points complexes en dimension directe (TD) avec une largeur spectrale (SW) de 10,0171 ppm (6 009,615 Hz).
      8. Réglez le délai entre les balayages (d1) sur 4 s et le temps d’acquisition (AQ) sur 2,7262976 s. Le retard de relaxation total est égal à d1 + AQ.
      9. Configurez l’impulsion de saturation comme suit : durée 50 ms ; forme gaussienne (p42) ; commandé par le programme en forme 9 (SP9).
      10. Utilisez une variante de séquence d’impulsions STD qui inclut un filtre T1ρ pour supprimer les signaux protéiques résiduels. Réglez le temps de verrouillage du spin (d29) en fonction du poids moléculaire de la protéine. Pour les protéines plus grandes, utilisez des temps de verrouillage de spin plus petits (~20 ms) et pour les protéines plus petites, plus grands (> 40 ms).
        NOTA : Tous les spectres STD ont été acquis à 599,93 MHz (BF1). L’ajustement de d29 est essentiel pour minimiser le bruit de fond protéique tout en préservant l’intégrité du signal du ligand. Optimisez ce paramètre de manière empirique si nécessaire.
    5. Cartographie de la liaison du ligand via 1H-R2
      1. Sélectionnez le programme CPMG_ESGP2D pulse dans la bibliothèque standard Bruker. Cette séquence est basée sur l’expérience Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG), incorporant la sculpture d’excitation pour la suppression de l’eau33.
      2. Définissez l’expérience comme une acquisition 2D.
        REMARQUE : Il s’agit d’une expérience pseudo-2D dans laquelle seule la dimension directe est utilisée pour les informations de décalage chimique.
      3. Configurez les paramètres d’acquisition comme suit :
        Domaine temporel (TD) : 32 768 points complexes dans la dimension directe ¹H.
        (TD1) : 2 points.
        Largeur spectrale (SW) : 7,9932 ppm (4 795,396 Hz).
        Délai entre balayages (d1) : 4 s.
        Fréquence porteuse (o1) : 4,7 ppm (centrée sur le signal d’eau).
        Nombre de scans (ns) : 8.
        Nombre de balayages factices (ds) : 4.
        Retard CPMG (d20) : ≤1 ms (c’est-à-dire inférieur à 1⁄3 J_HH).
        Nombre de moyennes (TDav) : 200.
      4. Exécutez l’expérience pendant 200 cycles de 8 balayages chacun, ce qui donne une accumulation totale de 1 600 balayages. Ajustez la liste de compteurs variables (vclist) en fonction de la durée totale souhaitée du cycle CPMG (TCPMG). Ici, 2 cycles ont été choisis pour un TCPMG = 8 ms et 200 cycles ont été choisis pour un TCPMG = 800 ms.
      5. Effectuez deux expériences1 H-CPMG, l’une pour l’échantillon contenant la protéine (4 mM de D-mannose et 80 μM de CVN) et l’autre pour le D-mannose libre (4 mM de D-mannose).
      6. Tracez lesspectres 1 H pour chaque TCPMGà l’aide de la commande efp (multiplication exponentielle suivie d’une transformée de Fourier et d’une correction de phase) ou sinm (multiplication sinusoïdale décalée de 90°, SSB=2) suivie de fp (transformée de Fourier et correction de phase). Ajustez la fonction de la fenêtre en fonction de la meilleure stratégie de traitement.
        REMARQUE : Dans cette expérience, sinm et fp ont été utilisés. La 1èresérie sera les spectres avec un TCPMG de 8 ms (premier dans le vclist), et la 2èmesérie sera de 800 ms (deuxième dans le vclist). Les spectres 1H traités sont représentés à la figure 3.
      7. Calculez le quotient CPMG (Q) à l’aide de l’équation 3.
        ​figure-protocol-5
  2. Expériences à base de protéines
    1. Préparation des échantillons
      1. Préparer 600 μL d’un échantillon contenant 436 μM uniformément marqués 15N CVN dans un tampon de phosphate de sodium (pH 7,4) complété par 50 mM de NaCl et 5 % d’oxyde de deutérium (D2O). Titrer le D-mannose dans l’échantillon jusqu’à une concentration finale de 60 mM. Pour le titrage, utilisez un tube RMN de 5 mm.
    2. Attribution de résonance (étape de validation facultative)
      1. Confirmer l’affectation du CVN libre dans la solution en utilisant les valeurs de décalage chimique précédemment rapportées34. Acquérir les spectres de résonance triple suivants : HNCO, HNCA, HNCABB et CBCACONH 35,36,37.
        REMARQUE : Ces expériences ne servent qu’à valider l’assignation et ne sont pas présentées, car l’assignation par décalage chimique n’est pas l’objectif principal de ce protocole.
    3. Cartographie de la liaison du D-mannose sur CVN par perturbation chimique de la protéine
      1. Acquérir des spectres HSQC 1 H-15N de CVN marqué 15N à 298 K. Effectuer un titrage en ajoutant du D-mannose pour atteindre les concentrations finales suivantes : 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40 et 60 mM.
      2. Configurez l’expérience 1 H-15N Fast-HSQC à l’aide de la séquence d’impulsions FHSQCF3GPPH sensible à la phase de la bibliothèque de normes Bruker. Utilisez les paramètres suivants :
        Domaine temporel (TD) : 1024 × 140 points complexes dans les dimensions 1H et 15N.
        Largeur spectrale (SW) : 16,0274 ppm (9615,385 Hz) dans la dimension 1H et 34 ppm (2067,119 Hz) dans la dimension 15N.
        Fréquence porteuse : 4,7 ppm (1H) et 119 ppm (15N).
        Nombre de scans : 128.
      3. Calculez la perturbation par déplacement chimique (Δδ) à l’aide de l’équation suivante :
        figure-protocol-6
        où figure-protocol-7 et figure-protocol-8 sont les différences de décalage chimique entre les CVN en présence et en absence de D-mannose (Figure 4A).
        REMARQUE : Le facteur 10 tient compte de la différence de largeurs spectrales entre les dimensions du proton et de l’azote.
      4. Calculez la constante de dissociation (KD) en traçant les valeurs CSP pour chaque résidu en fonction de la concentration de D-mannose. Ajustez les données résultantes à une isotherme de liaison sur un seul site à l’aide de l’équation suivante (5).
        figure-protocol-9Équation 5
        où [PT] est la concentration protéique utilisée dans le titrage (CVN), [PT] est la concentration du ligand (D-mannose), et CSPmax est la CSP à la concentration de saturation du ligand et CSPmin en l’absence du ligand.
    4. Cartographie de la liaison du D-mannose à CVN via la position 15N-R2 de la protéine.
      1. Mesurer les valeurs 15N-R2 des résidus individuels de CVN en l’absence et en présence de 60 mM de D-mannose. Effectuez toutes les expériences à 298 K.
      2. Configurez l’expérience 15N-R2 à l’aide de la séquence d’impulsions CPMG sensible à la phase HSQCT2ETF3GPSI3D de la bibliothèque de normes Bruker. Utilisez les paramètres suivants :
        Domaine temporel (TD) : 1024 × 128 points complexes dans les dimensions 1H et 15N, avec 8 points dans la pseudo dimension.
        Largeur spectrale (SW) : 16,0274 ppm (1H ; 9615,385 Hz) et 34 ppm (15N ; 2067,119 Hz).
        Fréquence porteuse : 4,7 ppm (1H) et 119 ppm (15N).
        Nombre de scans : 32. (v) Liste de compteurs variables : 1, 8, 2, 6, 3, 5, 4 et 7, correspondant à des retards de relaxation (Trelax) de 16,96, 135,68, 33,92, 101,76, 50,88, 84,96, 67,84 et 118,72 ms, respectivement.
      3. Traitez les spectres pseudo3D comme une série de spectres de relaxation de corrélation 1H/15N de type HSQC à l’aide de NMRPipe38, en suivant le tutoriel du logiciel (voir la Table des matériaux pour un lien vers le tutoriel).
      4. Importer les spectres traités dans une plateforme d’analyse RMN appropriée (par exemple, CCPNMR39). Sélectionnez tous les spectres et appliquez l’outil « Suivre les changements d’intensité ». Tracez l’intensité de chaque pic transversal en fonction de Trelax et ajustez la décroissance à une fonction mono-exponentielle pour extraire 15valeurs N-R2 pour chaque résidu.
      5. Calculez l’erreur expérimentale à partir du rapport signal/bruit des spectres de type HSQC à 67,84 ms. Traitez une région du spectre contenant uniquement du bruit et convertissez-la en fichier texte à l’aide de la commande suivante :
        pipe2txt.tcl ./PROCs/ft/R2_67_84.ft2 > noise67_84.txt"
      6. Déterminez l’écart-type de la région de bruit à l’aide d’un logiciel statistique (par exemple, Origin(Pro), version 2021). Définissez cette valeur comme l’intensité du bruit Ibruit.
      7. Calculez l’erreur expérimentale pour chaque résidu à l’aide de l’équation suivante :
        figure-protocol-10
        REMARQUE : Il est important d’utiliser l’erreur expérimentale plutôt que l’erreur d’ajustement. L’erreur expérimentale définit les limites d’interprétation lors de la comparaison des 15N-R2 en l’absence et la présence de D-mannose.

figure-protocol-11
Figure 1 : Perturbation par décalage chimique du D-mannose en présence de CVN. (A) 1Spectre H-13C-HSQC du D-mannose en présence de CVN. (B) 1spectre H-13C-HSQC de D-mannose libre. Les étiquettes dans les spectres indiquent chacune des affectations de décalage chimique et la configuration anomérique respective (α ou β). Les étiquettes en rouge sont celles attribuées à la conformation liée, et celles en noir sont celles attribuées à la conformation libre. (C) Superposition des spectres 1 H-13C-HSQC en présence (vert) et en absence (bleu) de CVN. (D) Structure chimique du mannose α et β-D, mettant en évidence le CSP observé, qui a été calculé selon l’équation (1). Les valeurs CSP sont illustrées sous les cercles verts. Le cercle rouge représente l’hydrogène β-anomérique qui a disparu en présence de CVN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Spectres de différence de transfert de saturation (STD) du D-mannose en présence de CVN. (A) STDs acquis à différentes fréquences de saturation : -0,59, 0,73 et 8,1 ppm. (B) STD acquis à différents temps de saturation : 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 et 4 s. (C) Facteur d’amplification STD (ASTD) calculé selon l’équation 2 en fonction du temps de saturation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : 1H-R2 du D-mannose en présence et en l’absence de CVN. (A) Représentation des spectres attendus de D-mannose 1H-CPMG pour un liant et un non-liant acquis avec des temps de relaxation R2 de 8 et 800 ms en l’absence (en bas) et en présence (en haut) de CVN. Q a été calculé selon l’équation 3. En l’absence d’interaction (Q ≈ 1), les intensités du signal restent similaires aux deux moments de relaxation du ligand avec ou sans la protéine. Lors de la liaison (Q < 1), les intensités du signal diminuent avec l’augmentation de la relaxation pour l’échantillon contenant la protéine. (B) Représentation schématique de l’échange chimique entre les états libre et lié du D-mannose. En fonction des valeurs relatives de la différence de décalage chimique (Δω) et de la constante de taux de change (kex = kon + koff), le système tombe dans des régimes d’échange lents, intermédiaires ou rapides. (C)1Spectres RMN H du D-mannose libre et du D-mannose en présence de CVN, montrant des différences d’intensité de signal à des temps de relaxation de 8 ms et 800 ms. Les facteurs Q calculés pour des hydrogènes spécifiques (H6β, H3β, H5α, H4β) sont présentés, avec des valeurs Q plus faibles indiquant des interactions plus fortes avec CVN et identifiant les régions du sucre impliquées dans la liaison. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Analyse de la perturbation par décalage chimique (CSP) révélant les résidus de CVN impliqués dans la liaison du D-mannose. (A) Diagrammes à barres montrant les CSP de l’amide de squelette (15 N-1H) du CVN lors du titrage avec du D-mannose à des concentrations de 10 mM (en haut) et 60 mM (en bas). Les lignes horizontales indiquent le CSP moyen plus un ou deux écarts-types (av + sd, av + 2 sd), qui ont été utilisés comme seuils pour identifier les résidus significativement perturbés. (B) Cartographie des résidus significativement perturbés sur la structure de CVN complexé avec le disaccharide Manα1-2Manα (PDB ID : 1IIY40). Les résidus dont les CSP dépassent le seuil av + 2 sd sont mis en évidence en rouge, et ceux dont le seuil est compris entre av + sd et av + 2 sd sont indiqués en bleu. Les molécules disaccharides Manα1-2Manα sont affichées en orange pour indiquer leur emplacement de liaison. (C) Courbes de liaison sélectionnées représentant les CSP en fonction de la concentration de D-mannose. Les données ont été ajustées selon l’équation 5 en tant que modèle de liaison à un seul site pour estimer KD, révélant une gamme d’affinités, D44 montrant l’interaction la plus forte (KD = 1,1 ± 0,35 mM) et E41 la plus faible (KD = 35 ± 29 mM). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Analyse de 15N-R2 pour le CVN libre et lié au D-mannose. (A, B) Taux de relaxation transverse (15N-R2) mesurés pour chaque résidu de CVN dans ses états (A) libre et (B) lié au D-mannose. (C) Différence entre les valeurs de R2 (ΔR2 = R2lié− R2libre) tracée par résidu. Les lignes bleue et rouge représentent respectivement un et deux écarts-types par rapport à la moyenne (av ± sd et av ± 2 sd). Les résidus avec des valeurs significatives de ΔR2 sont étiquetés. (D) Cartographie des valeurs ΔR2 pour la structure de CVN complexé avec le disaccharide Manα1-2Manα (PDB ID : 1IIY40). Les résidus avec ΔR2 supérieur ou inférieur à av± 2 sd sont indiqués en rouge ; Ceux entre AV± SD et AV± 2 SD sont indiqués en bleu. Les molécules de D-mannose sont affichées en orange pour indiquer leur emplacement de liaison. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Résultats

Dans le présent travail, nous avons présenté des expériences de RMN pour étudier les interactions protéine-glycane. La reconnaissance moléculaire protéine-glycane sous-tend de nombreux processus biologiques impliquant la matrice extracellulaire (MEC), y compris la régulation de l’adhésion cellulaire, de la migration, de la prolifération et de diverses autres formes de communication cellulaire.

Ici, nous avons choisi de travailler avec le monosaccharide D-mannose, qui est décrit comme un liant ...

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Discussion

La spectroscopie RMN représente une approche polyvalente pour étudier les interactions protéine-glycane, notamment en raison de sa capacité à détecter les interactions faibles et transitoires, telles que celles observées entre CVN et D-mannose. Le protocole décrit ici combine des méthodes de RMN basées sur des ligands et des protéines, permettant une caractérisation plus complète de l’interface d’interaction.

Les étapes critiques du protocole comprennent une p...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Nous remercions le Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear Jiri Jonas (CNRMN) pour l’utilisation des spectromètres RMN. Nous sommes reconnaissants à la Dre Carole Bewley de nous avoir partagé les affectations de décalage chimique du CVN en complexe avec le Manα1-2Manα. Nous remercions également les organismes subventionnaires FAPERJ et CNPq.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Glucose 13CLaboratoire isotopique de Cambrige.CLM-481
Chlorure d’ammonium 15NLaboratoire isotopique de Cambrige.NLM-467
Chlorure de calciumSigma-AldrichRéf. C4901
Coquetel inhibe la protéaseSigma-Aldrich4693159001
D2OLaboratoire isotopique de Cambrige.DLM-4
D-MannoseSigma-AldrichM2069-5G
Chlorure de magnésiumSigma-AldrichRéférence M8266
NMRPipeLien vers le tutoriel du logiciel : https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html
Chlorure de potassium (K2HPO4)Sigma-AldrichRéf. P3786
Chlorure de potassium (KCl)Sigma-AldrichRéf. P3911
Chlorure de potassium (KH2PO4)Sigma-AldrichRéf. P0662
Tube ShigemiBrukerZ1Z10684A
Chlorure de sodium (NaCl)Sigma-AldrichRéf. S9625
Phosphate de sodium (Na2HPO4)Sigma-Aldrich567545
Phosphate de sodium (NaH2PO4)Sigma-AldrichRéf. S97263
Spectromètre Bruker 600 MHzBruker
Spectromètre Bruker 800 MHzBruker
TiamineSigma-AldrichRéf. T1270
Sonde TXI à triple résonanceBruker
TryptoneSigma-Aldrich93657
Extrait de levureSigma-AldrichY1625

Références

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Spectroscopie RMNperturbation du d placement chimiquediff rence de transfert de saturationcartographie de la liaison des ligandsliaison du D mannoseCyanovirin Nanalyse du taux de relaxationdynamique structurelle

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