Method Article

Rôle protecteur osseux du bupleurum dans un modèle de rat d’ostéoporose postménopausique

DOI:

10.3791/68675

⸱

August 22nd, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1YouJiang Medical University for Nationalities, 2Affiliated Hospital of YouJiang Medical University for Nationalities, 3ShenZhen International Travel Health Care Center (ShenZhen Customs Port Clinic)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cette étude, nous avons utilisé un modèle d’ostéoporose postménopausique chez le rat ovariectomisé pour démontrer que le liquide oral Bupleurum (Chai hu) améliore la microstructure osseuse en supprimant les facteurs pro-inflammatoires et en renforçant les facteurs anti-inflammatoires. Cela suggère que son mécanisme anti-inflammatoire atténue partiellement l’ostéoporose induite par une carence en œstrogènes.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole vise à étudier les effets de l’administration de Chai hu sur l’ostéoporose post-ménopausique chez les rats ovariectomisés (OVX). Des rats Sprague-Dawley femelles âgés de huit semaines ont subi une ovariectomie bilatérale en utilisant l’approche dorsale pour établir un modèle d’ostéoporose postménopausique. Différentes doses de liquide oral Chai hu ont été administrées par gavage oral pendant 12 semaines consécutives, suivies d’évaluations de la microstructure osseuse et de mesures des niveaux de cytokines inflammatoires. Le traitement par Chai hu à doses moyennes et élevées a partiellement inhibé la perte osseuse, réduit l’expression des cytokines pro-inflammatoires et régulé à la hausse les niveaux de cytokines anti-inflammatoires chez les rats OVX. Il y a eu une réduction significative de la gravité de la destruction osseuse entre des doses faibles et élevées, et des améliorations liées à la dose dans la reconstruction microstructurale osseuse ont été observées. Chai hu a atténué la perte osseuse induite par une carence en œstrogènes et la détérioration microstructurale, supprimant ainsi la progression de l’OP dans ce modèle OVX. Cela était probablement dû aux effets anti-inflammatoires des voies impliquées.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’ostéoporose (OP) est une maladie osseuse métabolique courante caractérisée par une diminution de la masse osseuse, une réduction de la résistance osseuse et la destruction de la microarchitecture osseuse1. L’OP peut se manifester comme primaire ou secondaire, et l’OP primaire est classée comme OP post-ménopausique (PMOP), OP sénile et OP idiopathique (qui survient souvent chez les adolescents). Parmi eux, le PMOP de type I se produit principalement chez les femmes PM, où il y a une diminution marquée de la densité osseuse après la ménopause en raison de la réduction des niveaux circulants d’œstrogène2. Il s’agit d’une maladie osseuse métabolique systémique, qui se traduit par une augmentation de l’activité des ostéoclastes et une différenciation intense3. De plus, l’intensité de la résorption osseuse est beaucoup plus grande que sa formation, ce qui entraîne une diminution de la masse osseuse ainsi qu’une augmentation de la fragilité osseuse et du risque de fracture4.

Les recherches actuelles ont montré que de nombreuses maladies inflammatoires chroniques, telles que l’arthrose et la parodontite, sont associées à une perte osseuse importante, ce qui suggère que l’inflammation peut être étroitement liée à l’OP5. À mesure que les femmes PM vieillissent, en plus des changements endocriniens, les fonctions physiologiques et immunitaires déclinent, et le corps est laissé dans un état d’inflammation chronique pendant de longues périodes. Bon nombre de ces facteurs favorisant l’inflammation et les cytokines dérivées des lymphocytes T jouent un rôle important dans la perte osseuse. Par conséquent, le PMOP est également reconnu comme une maladie inflammatoire chronique 6,7.

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) a une longue histoire et une riche expérience clinique dans la prévention et le traitement du PMOP, en se concentrant sur la gestion holistique et le diagnostic et le traitement individualisés, et peut réguler les systèmes endocrinien et immunitaire en même temps, ce qui est une bénédiction pour les femmes ménopausées8. Il permet à une grande proportion de femmes d’avoir accès à un traitement médical. Des études pharmacologiques modernes et des essais cliniques ont montré que la MTC présente les avantages du multi-ciblage, de la faible toxicité et des effets secondaires, et qu’elle est bon marché. Le risque de complications peut être considérablement réduit dans le traitement MTC de PMOP9.

Le Chai hu lui-même a des propriétés anti-inflammatoires10 et antidépressives11, et il peut réguler la sécrétion d’hormones dans le corps12 ainsi que favoriser une bonne santé13. Le Chai hu est l’ingrédient principal qui joue un rôle majeur dans la formule composée de la MTC, les pilules Xiaoyao, qui a pour effet d’apaiser les émotions, de favoriser la digestion et l’absorption dans l’estomac et les intestins. Il est également connu pour reconstituer le qi et l’énergie sanguine ainsi que pour réguler les symptômes du cycle menstruel et son inconfort associé14. Le principal constituant du Chai hu est la saponine Chai hu, qui a une forte activité anti-inflammatoire, se manifestant principalement par l’inhibition de l’expression de cytokines pro-inflammatoires, telles que le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), l’interleukine 1β et l’IL-615. De plus, il améliore l’expression de la cytokine anti-inflammatoire, l’IL-10, atténuant ainsi l’inflammation, comme la colite, l’endométrite et l’hépatite16.

Comparé aux traitements OP standard (y compris l’utilisation de bisphosphonates17, de modulateurs sélectifs des récepteurs d’œstrogènes18 et de denosumab19), Chai hu, en tant que MTC couramment utilisé, présente l’avantage potentiel d’un mécanisme d’action multi-composants et multi-cibles. Les thérapies standard ciblent généralement des voies métaboliques osseuses spécifiques20 (inhibition de l’activité des ostéoclastes), qui peuvent être associées à certains effets secondaires tels que l’inconfort gastro-intestinal, le risque accru d’ostéonécrose des mâchoires et les symptômes pseudo-grippaux, ainsi que les coûts élevés des médicaments à long terme21.

Une revue de la littérature pertinente a révélé que l’utilisation de Chai hu pour intervenir chez les rats PM atteints d’OP pourrait avoir des effets thérapeutiquesapaisants 22. Ainsi, sur la base de l’analyse bioinformatique et pharmacologique ainsi que de la simulation d’amarrage moléculaire pour prédire les sites d’amarrage23, nous avons émis l’hypothèse que Chai hu pourrait intervenir dans le processus inflammatoire, moduler l’état immunitaire de l’organisme et restaurer l’homéostasie immunitaire osseuse. Ceux-ci favoriseront la stabilité de l’état de reconstruction osseuse et obtiendront l’effet thérapeutique souhaité d’atténuer les OP.

Cette étude a utilisé l’administration orale de Chai hu liquide (concentration : 1 g/mL) pendant 12 semaines consécutives. Le schéma posologique a été conçu sur la base de doses cliniquement courantes dans les études de MTC et de pharmacocinétique24.

L’objectif global de cette méthode d’administration est d’établir un protocole posologique stable et cliniquement pertinent, évaluant ainsi systématiquement l’effet d’intervention soutenue de Chai hu dans le modèle cible (un modèle de rat d’ostéoporose postménopausique). Cette approche d’administration garantit que le médicament maintient une concentration plasmatique efficace tout au long de la période expérimentale, fournissant une base d’intervention fiable pour les évaluations ultérieures (telles que les indicateurs du métabolisme osseux et les taux de facteurs inflammatoires). De plus, il aide à clarifier le rôle du Chai hu dans les maladies connexes ainsi que sa relation dose-effet, tout en offrant un paradigme de référence pour l’administration standardisée des médecines traditionnelles chinoises dans la recherche expérimentale.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été menées conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (8e édition) et ont été spécifiquement approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université médicale de Youjiang pour les nationalités (approbation n° 2024071001).

1. Analyse de la pharmacologie des réseaux

REMARQUE : La cyberpharmacologie est une approche qui combine la biologie des systèmes, la biologie computationnelle et la pharmacologie et vise à comprendre le mécanisme d’action des médicaments et les interactions médicamenteuses en analysant les réseaux biomoléculaires25.

  1. Criblez des composés actifs ayant une bonne biodisponibilité orale (OB) et une bonne ressemblance médicamenteuse (DL) à l’aide d’outils tels que la base de données et la plateforme d’analyse pharmacologique des systèmes de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP : http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php). Réglez l’OB à ≥30 % et le DL à ≥0,1826. Recherchez Chai hu et cliquez sur Détails de l’herbe et téléchargez toutes les données composées. Nommez le fichier téléchargé Chaihu.
  2. Obtenez le nom cible de l’ingrédient de base en collant l’ID MOL de l’ingrédient de base dans la base de données TCMSP. Collez dans la recherche par lots TCMSP et sélectionnez Prédiction cible, puis cliquez sur Envoyer.
  3. Ouvrez la base de données UniProtsh, copiez la colonne Nom de la cible dans la recherche et recherchez le nom de la protéine en gras, qui est exactement le même que le nom de la protéine cible collé. Après avoir trouvé le nom de protéine correspondant, collectez les noms de gènes correspondants dans la colonne qui le suit.
  4. Filtrez les gènes liés à l’ostéoporose dans la base de données GeneCards (https://www.genecards.org) en fonction du score de pertinence ≥ 1 et obtenez tous les gènes (5741)27.
    REMARQUE : Les raisons de la sélection des gènes avec un score de pertinence ≥ 1 dans la base de données GeneCards sont les suivantes : Un score ≥ 1 indique que le gène a des associations documentées avec la maladie cible, ce qui le distingue clairement des gènes sans associations signalées (score = 0). Ce seuil garantit la rétention des gènes ayant une pertinence crédible pour la maladie tout en évitant l’interférence excessive de gènes non apparentés. Un seuil inférieur (<1) pourrait inclure des gènes sans associations validées, augmentant ainsi les faux positifs.
  5. Obtenez les gènes qui se croisent après avoir combiné des ensembles de gènes liés à la maladie avec des cibles médicamenteuses pour l’intersection. Sur la base des interactions entre les cibles de la maladie et les ingrédients actifs du médicament, construisez un réseau d’intersection entre les ingrédients actifs de la médecine traditionnelle chinoise, la cible et la maladie à l’aide du logiciel Cytoscape.
  6. Obtenez des informations sur l’interaction protéine-protéine (IPP) via la base de données String (https://cn.string-db.org/) et construisez un réseau IPP. Ouvrez Cytoscape (https://www.cytoscape.org), chargez le fichier TSV téléchargé sur le réseau de téléchargement, puis sélectionnez Calculer > TOP10 ou TOP20, puis cliquez sur Envoyer.
  7. Créez deux tables pour l’importation dans Cytoscape. Créez un fichier de tableur électronique nommé Réseau. Dans la colonne A, entrez les mêmes ID MOL (CH1, CH2...) qui ont été remplacés par l’abréviation de la médecine traditionnelle chinoise. Étiquetez la colonne B en tant qu’ID MOL et triez-la dans l’ordre croissant par ID MOL. Étiquetez la colonne C comme symbole. Copiez les ID de composant (ID MOL) et les noms de gènes des fichiers liés à Chaihu dans les colonnes B et C, respectivement. Supprimez ensuite la colonne B et renommez la colonne A en ID MOL.
  8. Étendez le tableau jusqu’à la fin du texte. Dans la colonne Symbole, entrez les ID MOL (CH1, CH2...), remplacés par l’abréviation de la médecine traditionnelle chinoise. Dans la colonne ID MOL, entrez l’abréviation de la médecine traditionnelle chinoise : CH. Avec les étapes ci-dessus, la complétion de l’information et la construction du réseau Médecine Traditionnelle Chinoise - Composante - Cible sont achevées.
  9. Ensuite, faites le deuxième formulaire, le fichier TYPE. Créez une nouvelle feuille de calcul et nommez-la TYPE. Étiquetez la colonne A comme Terme et la colonne B comme TYPE. Copiez le nom du gène dans la colonne du terme et donnez-lui l’attribut gene dans la colonne type (le but est de rechercher le gène ; tous les noms de gènes seront sélectionnés, afin qu’il soit facile à utiliser). Entrez les ingrédients dans la colonne Terme et donnez à l’ingrédient l’attribut drug1.
  10. Importez dans le logiciel Cytoscape. Importer le réseau pour télécharger le fichier réseau et importer la table pour télécharger le fichier type. Dans la zone de recherche, tapez gène, appuyez sur Entrée pour que tous les gènes soient sélectionnés, tirez les gènes sélectionnés vers la gauche, puis cliquez sur Disposition > Attribute() > Sélectionné (choisissez rond ou carré entre parenthèses).
  11. Combinez les résultats de l’analyse pharmacologique en réseau avec des données expérimentales pour identifier les composés clés et les mécanismes moléculaires de l’action des médicaments.

2. Amarrage moléculaire

REMARQUE : L’amarrage moléculaire est une technique informatique permettant de prédire le mode de liaison et l’affinité optimaux entre une petite molécule (ligand) et une protéine cible ou une biomolécule28.

  1. Préparation de récepteurs et de ligands
    1. Source du récepteur (protéine) : Obtenir le fichier PDB des protéines cibles à partir de la banque de données sur les protéines RCSB (https://www.rcsb.org). Recherchez 3Q4B (exemple du récepteur IL-6), cliquez sur Télécharger les fichiers > format PDB.
    2. Supprimez les molécules d’eau cristallographiques en cliquant sur Modifier > Supprimer > l’eau, les ions étrangers et les ligands non essentiels (conservez les cofacteurs critiques comme les ions métalliques) en cliquant sur Modifier > Supprimer > hétéroatomes. Ajoutez les atomes d’hydrogène manquants en cliquant sur Modifier > Hydrogènes > Ajouter. Enregistrer sous protein.pdbqt. en cliquant sur Modifier > charges > Calculer Gasteiger, puis sur Grille > Macromolécule > choisissez > Enregistrer en tant que PDBQT.
    3. Source du ligand (petite molécule) : Téléchargez la structure du ligand sur PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Recherchez Saikosaponin A (CID :6443568), cliquez sur Conformateur 3D > Télécharger SDF.
    4. Utilisez le logiciel Open Babel pour convertir le fichier Saikosaponin A au format SDF en un fichier au format PDB avec des conformations tridimensionnelles à faible énergie, et nommez-le saikosaponinA.
  2. Configuration des paramètres d’ancrage (outils AutoDock)
    1. Chargez les fichiers récepteurs et ligands. Importez le fichier de petites molécules saikosaponine A et enregistrez-le en tant que fichier PDBQT. Par la suite, chargez le récepteur et le ligand : cliquez sur Amarrage > Macromolécule > Ouvrir, sélectionnez IL6_receptor.pdbqt ; puis cliquez sur Amarrage > Ligand > Ouvrir, sélectionnez saikosaponinA.pdbqt.
    2. Configurez la zone de grille : cliquez sur Grille > Zone de grille, ajustez la taille de la zone pour qu’elle englobe pleinement le site actif (utilisez la molette de commande sur le panneau de gauche pour affiner l’ajustement), puis enregistrez les paramètres actuels en cliquant sur Fichier > Fermer Enregistrement actuel et nommez le fichier grid.gpf.
    3. Pour configurer le programme d’exécution AutoGrid : cliquez sur Exécuter AutoGrid, sélectionnez le fichier grid.gpf, puis cliquez sur Lancer. Ensuite, configurez les paramètres d’amarrage : Dans l’ordre, sous le menu Amarrage, cliquez sur Macromolécule et sélectionnez le fichier de protéine IL6_receptor.pdbqt ; cliquez sur Ligand et sélectionnez le fichier de petites molécules saikosaponin A.pdbqt ; définir l’algorithme génétique et le confirmer ; ajustez les paramètres de station d’accueil et confirmez-les. Enfin, dans Sortie, sélectionnez l’algorithme lamarckien(4,2), nommez le fichier dock.dpf et enregistrez-le.
    4. Pour exécuter AutoGrid et enregistrer les résultats : cliquez sur Exécuter AutoDock, sélectionnez le fichier dock.dpf et lancez la simulation. Une fois l’opération terminée, cliquez sur Write Complex, nommez la structure complexe et enregistrez-la au format PDBQT.
  3. Analyse des résultats à l’aide de PyMOL
    1. Convertissez le fichier au format PDBQT obtenu à partir de l’étape d’amarrage moléculaire précédente au format PDB à l’aide du logiciel Open Babel. Importez ensuite le fichier au format PDB dans le logiciel PyMOL pour les opérations de visualisation ultérieures.
    2. Localisez le ligand et séparez-le individuellement : Après avoir sélectionné le ligand, modifiez sa couleur en cliquant sur Sele , puis en choisissant une couleur dans Couleur. Dans la colonne Sele, cliquez sur Extraire l’objet sous Action pour extraire le ligand en tant que nouvel objet indépendant.
    3. Mesure de la distance de liaison hydrogène : dans la colonne sele, cliquez sur Action, recherchez les contacts polaires, puis cliquez sur Vers d’autres atomes dans l’objet ; Les liaisons hydrogène seront affichées sous forme de lignes jaunes. Cliquez sur l’option Mesure dans la colonne Assistant, cliquez sur l’ordre Atomes aux deux extrémités de la liaison hydrogène , puis cliquez sur Terminé pour terminer la mesure.
  4. Exporter l’image : cliquez sur Exporter l’image au format PNG dans Fichier. Si un rendu haute définition est nécessaire, entrez rayon 300 (pixels réglables) et appuyez sur Entrée.

3. Analyse micro-CT

  1. Injecter par voie intrapéritonéale du pentobarbital sodique (40 mg/kg) chez des rats SD femelles (32 semaines, 320-350 g) pour une anesthésie profonde, confirmée par l’absence de réflexe cornéen (pas de clignement des yeux au contact du coton-tige) et de réflexe de douleur (pas de contraction des membres postérieurs à la pince par pince).
    1. Effectuer une chirurgie d’isolement des membres postérieurs. Euthanasier les rats par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à une dose 3 à 5 fois supérieure à la dose d’anesthésique chirurgical (40 mg/kg), les placer en décubitus dorsal et faire une incision transversale de 3 cm, à 1 cm au-dessus de la symphyse pubienne le long du ligament inguinal. Disséquez brutalement l’espace entre les muscles gracilis et sartorius pour exposer l’artère fémorale (structure tubulaire pulsatile). Lister les deux extrémités de l’artère fémorale à l’aide de sutures 4-0, en laissant une section non ligaturée entre les deux, avant de tronquer le vaisseau avec des ciseaux ophtalmiques et de le transecter.
    2. Faites pivoter le membre inférieur vers l’intérieur pour disloquer la tête fémorale de l’acétabulum et coupez la capsule articulaire et le ligament rond, en préservant l’intégrité de la tête fémorale. Immerger le membre postérieur intact dans une solution saline pré-refroidie, puis fixer dans une solution de formaldéhyde à 4 % pendant 24 à 48 h.
  2. Configuration d’imagerie : Apportez le fémur fixe à l’établissement pour une micro-tomodensitométrie. Allumez l’appareil Micro-CT et sélectionnez le programme prédéfini Small Animal Bone Scanning . Utilisez les paramètres de balayage suivants : Tension des rayons X = 90 kV, Courant des rayons X = 80 μA, Champ de vision (FOV) = 36 mm, Taille des pixels = 72,0 μm, Rotation = 360°, Durée du balayage = 14 min.
  3. Placez le fémur de la patte gauche du rat dans le porte-échantillon, fixez l’épiphyse fémorale à photographier, démarrez l’appareil et attendez la fin de l’autotest de la machine. Lancez un balayage de prévisualisation (balayage rapide à basse résolution) pour confirmer que l’échantillon est centré, puis ajustez la région d’intérêt pour couvrir l’ensemble du fémur.
  4. Une fois la numérisation et la photographie terminées, la source lumineuse à rayons X s’éteint automatiquement. À ce moment, la valeur de rayonnement à l’intérieur de la machine dépasse la norme et il est absolument interdit de retirer l’échantillon sans équipement de protection.
  5. Analyse d’images : Analysez les paramètres osseux (densité minérale osseuse [DMO], nombre trabéculaire) à l’aide du logiciel intégré du scanner. Enregistrez et exportez des images reconstruites pour une évaluation plus approfondie.

4. PCR quantitative en temps réel pour l’extraction d’ARN à partir de tissu osseux de rat

  1. Retirez les muscles adhérents et le fascia du fémur droit. Coupez 100 à 200 mg de tissu osseux en petits morceaux. Ajouter 2-3 billes de broyage et 500 μL de tampon d’extraction d’ARN. Homogénéiser à l’aide d’un broyeur de tissus à 70 Hz pendant 5 min à 4 °C.
  2. Séparation de phase : Après centrifugation, la solution se sépare en une phase aqueuse supérieure (contient de l’ARN) et un précipité sombre inférieur (contient des protéines, de l’ADN et des polysaccharides). Transférez avec précaution 500 μL du surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL sans RNase.
  3. Traiter la solution supérieure obtenue à partir de l’isolement pour l’extraction totale de l’ARN conformément aux instructions du fabricant.
  4. Après avoir ajouté de l’isopropanol à la solution de lyse, retournez doucement le tube pour mélanger la solution et laissez-le reposer à température ambiante pendant 10 min. Effectuez une vérification visuelle à ce stade ; si des précipités d’ARN floculant blanc sont observés (adhérant à la paroi du tube), cela indique que l’ARN a été effectivement précipité.
  5. Utilisez une pointe de pipette de 200 μL pour aspirer le liquide résiduel. Conservez la pastille d’ARN blanc au fond/paroi du tube. Remettre l’ARN en suspension dans 50 à 100 μL d’eau exempte de RNase et le stocker à -80 °C.
  6. Mélangez 2 μL de matrice d’ARN, 10 μL de mélange maître, 2 μL de DNase et 5 μL d’eau sans nucléase dans un tube sans nucléase. Mélanger délicatement par pipetage.
  7. Incuber à 37 °C pendant 2 min pour éliminer la contamination par l’ADN génomique. Incuber à 55 °C pendant 15 min. À la fin de la réaction, incuber à 85 °C pendant 5 min pour interrompre la réaction.
  8. Configurez le système de PCR quantitative par fluorescence en temps réel en plaçant l’ADN transcrit en sens inverse sur de la glace. Prémélangez tous les composants : 10 μL de qPCR SYBR Green Master Mix (sans Rox), 0,4 μL d’amorce avant et d’amorce inverse, et 8,2 μL d’eau sans RNase, divisez et ajoutez 1 μL d’ADN, manipulez sur de la glace et protégez-vous de la lumière.
  9. Exécutez le programme qPCR comme suit : pré-dénaturation à 95 °C pendant 5 min, 1 cycle suivi d’une dénaturation à 95 °C pendant 10 s pendant 40 cycles. Effectuez le recuit, l’extension, l’acquisition de fluorescence à 60 °C pendant 30 s pendant 40 cycles dans le canal SYBR Green. Obtenir une courbe de fusion pour une température de 65 à 95 °C avec un incrément de 0,5 °C par pas et 5 s/pas. Les amorces utilisées sont fournies dans le tableau 1.

5. Préparation des animaux

  1. Obtenir 48 rats SD nullipares femelles (grade SPF, âgés de 8 semaines, poids corporel 200-220 g).
  2. Avant les procédures expérimentales, acclimater tous les rats avec une période de quarantaine de 7 jours dans une installation d’isolement de niveau SPF et les loger dans un environnement de laboratoire contrôlé par SPF (température : 22-24 °C, humidité : 45 %-55 %).

6. Préparation du médicament d’essai

  1. Obtenez du liquide oral Chai hu (approbation nationale de produit médical de la Chine n° Z41021539). La formulation contient du Chai hu (source du Nord) comme ingrédient actif, avec des excipients comprenant un agent aromatisant, du saccharose et du propylène glycol. Chaque flacon de 10 ml contient un extrait équivalent à 10 g d’herbe brute.

7. Préparation du modèle de rat ovariectomisé

  1. Préparation préopératoire : Rats rapides pendant 12 h avec accès à l’eau à volonté Effectuer la stérilisation des instruments en autoclavage de tous les outils chirurgicaux.
  2. Anesthésie et préparation : Administrer du pentobarbital sodique par injection intrapéritonéale (40 mg/kg). Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en évaluant l’absence de réflexe cornéen (pas de clignement au contact de la cornée avec un coton-tige) et l’absence de réflexe de pincement des orteils (pas de rétraction des membres postérieurs lors du clampage). Après 15 à 20 minutes, rasez le site chirurgical, désinfectez avec de l’iode et couvrez avec un rideau fenêtré. Appliquez une pommade oculaire à la vitamine A (contenant 15 000 UI/g) pendant l’opération pour éviter que les yeux de l’animal ne se dessèchent (tableau 2).
  3. Modèle de rat ovariectomisé : Effectuez l’opération dans une salle d’opération stérile dédiée. Tout le personnel portait des blouses d’isolement complètes. Essuyez le comptoir et l’équipement environnant avec de l’éthanol à 75 % (tableau 2) avant la chirurgie et allumez les lampes ultraviolettes pendant au moins 30 minutes pour éliminer les microbes dans l’air et sur les surfaces.
    1. Faites une incision de 1 cm sur la peau dorsale, disséquez brusquement le tissu sous-cutané, pincez la couche musculaire et faites une incision de 1 cm. Localisez le coussinet adipeux et extériorisez-le pour identifier l’ovaire (de couleur rouge vif). Lissez la trompe de Fallope avec une suture 4-0, excisez le tissu ovarien et placez-le dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 4 % de paraformaldéhyde (tableau 2).
  4. Fermeture et désinfection de la plaie : Saupoudrez de la poudre de pénicilline dans la plaie avant de la suture. Suturez la couche musculaire avec une suture non résorbable n° 6 et fermez la peau avec une suture n° 2. Désinfectez l’incision fermée avec de l’iode et appliquez de la poudre de pénicilline topique.
  5. Soins postopératoires : Placez les rats dans des cages fraîches avec des bouteilles d’eau chaude et des serviettes pour maintenir la température corporelle. Animaux rapides (eau autorisée) pendant 24 heures après l’opération pour prévenir l’occlusion intestinale. Appliquez de la poudre de pénicilline sur le site d’incision tous les jours pendant 3 jours consécutifs.
    1. Injecter de la lidocaïne (concentration de 1 % à 2 %, maximum 5 mg/kg) autour de l’incision chirurgicale pour réduire la douleur postopératoire immédiate. Fournir une analgésie continue pendant 3 à 5 jours, en diminuant progressivement la dose en fonction de l’intensité de la douleur pour éviter un arrêt brutal.
    2. Maintenir l’animal en position latérale ou tête en bas avant de se réveiller pour éviter la chute de la langue et l’obstruction des voies respiratoires ; Permettre un positionnement autonome et confortable après le réveil. Isolez les animaux postopératoires des autres jusqu’à ce qu’ils se rétablissent complètement pour éviter les combats ou les infections croisées (figure 1).

8. Groupement expérimental et administration de médicaments

  1. Répartition par groupe : Divisez un total de 40 rats SD en cinq groupes (n = 8 par groupe), à savoir le contrôle normal, le contrôle modèle, le Chai hu à faible concentration, le Chai hu à concentration moyenne et le Chai hu à forte concentration.
  2. Pour le groupe à dose moyenne (5 mL/kg), choisir la posologie en fonction des lignes directrices figurant auxpoints 29 et 30. Suivre un gradient de concentration de 1:2:4 pour le groupe à faible concentration : 2,5 mL/kg, le groupe à concentration moyenne : 5 mL/kg et le groupe à forte concentration : 10 mL/kg.
  3. Administration du médicament : Utilisez un gavage oral et administrez le médicament une fois par jour. Pour le groupe témoin normal et le groupe témoin modèle (animaux soumis à une ovariectomie bilatérale), effectuez un gavage oral avec une quantité égale de solution saline. Commencer le traitement à la semaine 1 après la chirurgie et le poursuivre pendant 12 semaines.

9. Analyse post-expérience et collecte de données

  1. Effectuer les analyses suivantes sur cinq groupes d’animaux : micro-CT de la structure osseuse et détermination de l’expression de l’ARNm des cytokines inflammatoires dans les tissus fémoraux du rat.
  2. Recueillir des données qui comprennent des images visualisées de la microstructure trabéculaire fémorale ; paramètres osseux quantitatifs (y compris la densité minérale osseuse, la fraction volumique osseuse, l’écart-type de l’épaisseur trabéculaire, l’espacement trabéculaire, le nombre trabéculaire et la densité de connectivité) ; et les niveaux relatifs d’expression de l’ARNm des cytokines pro-inflammatoires (IL-6, IL-17) et des cytokines anti-inflammatoires (IL-4, IL-10) dans les tissus fémoraux.
  3. Effectuez des analyses de données à l’aide du logiciel GraphPad Prism 10.1.2 par analyse de variance à un facteur (ANOVA). La signification statistique des différences de moyennes entre les groupes a été définie comme p < 0,05. Des comparaisons multiples a posteriori ont été effectuées à l’aide du test de Tukey.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analyse de la fonction GO et de l’enrichissement de la voie KEGG

Nous nous sommes appuyés sur l’analyse d’enrichissement GO et KEGG en bioinformatique pour prédire le mécanisme d’action potentiel de Chai Hu sur PMOP. L’analyse de l’enrichissement en GO des gènes cibles recoupant les ingrédients actifs de Chai hu pour les maladies a donné 2138 entrées significatives, et les dix premiers résultats significatifs sont énumérés pour chaque groupe (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le PMOP est un trouble systémique du métabolisme osseux qui survient souvent chez les femmes MP, et il est causé par un manque d’œstrogène qui entraîne une perturbation de l’équilibre ostéoblaste-ostéoclaste, conduisant à une résorption osseuse accrue des ostéoclastes et à une diminution de la production osseuse des ostéoblastes31. Un nombre croissant d’études ont montré que les niveaux de facteurs inflammatoires dans le corps affectent également la différenciatio...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par le programme de recherche scientifique et de développement technologique de la ville de Baise et le projet d’amélioration des capacités de base de la recherche scientifique des jeunes enseignants d’âge moyen des universités du Guangxi de 2025 (projet n° : 2025KY0549). Les auteurs remercient le Dr Dev Sooranna de l’Imperial College de Londres et YMUN pour l’édition du manuscrit. ZY et LYR ont contribué à parts égales à ce travail.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Chlorure de sodium injectable à 0,9 %  ;HuarenpharmaceuticalRéf. H1712059
1& fois ; PBS  ;Thermopêcheur10010023
75 % d’alcool  ;NanjingréactifC069156931
95 % d’éthanolNanjingréactifC0691520075
Éthanol anhydreMacklinE809056
Bupleurum chinense  ;Pharmacie Henan Baiquan Co.Z41021539
solution de détartrage  ;solairebioE1171
pommade à l’érythromycine  ;Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Group Company Limited Usine pharmaceutique Baiyunshan HejigongH44023088
Alcool isopropylique  ;Jinan Jinrihe Chemical Co.23727-29-9
pénicilline V gélules de potassiumSichuan PharmaceutiqueH20103156
polyformaldéhyde (CH2O)nBeyotimeRéf. P0099
Désinfectant à base de povidone iodée  ;Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co.H44023924
Kit PCR de fluorescence en temps réelBiotechnologie YeasenRéférence 11201ES03
Kit d’extraction d’ARNMonadbiotechMI20201S
Kit de transcription inverse de l’ARNYuGongBiotechEG15123S
Pentobarbital de sodium  ;Shanghai Jixiang Biotechnology Co.JX082085
Trizol  ;ThermopêcheurRéférence 15596026CN

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. An, H., et al. Hyperoside alleviates postmenopausal osteoporosis via regulating mir-19a-5p/il-17a axis. Am J Reprod Immunol. 90 (1), e13709(2023).
  2. Wang, S., et al. Alginate oligosaccharide alleviates senile osteoporosis via the RANKL-RANK pathway in d-galactose-induced c57bl/6j mice. Chem Biol Drug Des. 99 (1), 46-55 (2021).
  3. Jiang, N., Qi, B., Li, G., Yao, L., Fan, X. Morin improves the bone histomorphology and biochemical markers in an animal model of ovariectomy-induced osteoporosis by suppressing autophagy and apoptosis. Food Sci Nutri. 12 (12), 10099-10109 (2024).
  4. Ramchand, S. K., Leder, B. Z. Sequential therapy for the long-term treatment of postmenopausal osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab. 109 (2), 303-311 (2024).
  5. Juluri, R., et al. Association of postmenopausal osteoporosis and periodontal disease: A double-blind case-control study. J Int Oral Health. 7 (9), 119-123 (2015).
  6. Zhang, C., et al. Oxidative stress: A common pathological state in a high-risk population for osteoporosis. Biomed Pharmacother. 163, 114834(2023).
  7. Mansoori, M. N., et al. IL-18bp is decreased in osteoporotic women: Prevents inflammasome-mediated IL-18 activation and reduces Th17 differentiation. Sci Rep. 6, 33680(2016).
  8. Shanshan, J., Baorong, H., Tianyuan, C., Xiaoqiang, H. Research progress of Chinese medicine in treating postmenopausal women with osteoporosis. Front Med Sci Res. 5 (10), 92-98 (2023).
  9. Faiella, E., et al. Percutaneous vertebroplasty: A minimally invasive procedure for the management of vertebral compression fractures. Osteology. 2 (4), 139-151 (2022).
  10. Yue, L. C., et al. Correction: Saikosaponin d exerts an antidepressant effect by regulating Homer1-mGluR5 and mTOR signaling in a rat model of chronic unpredictable mild stress. Chinese Med. 18 (1), 147-147 (2023).
  11. Yue, T., Ge, Z., Ruonan, S., Hanqing, W., Nan, Z. Saikosaponin a activates tet1/dll3/notch1 signalling and promotes hippocampal neurogenesis to improve depression-like behavior in mice. J ethnopharmacol. 319 (P3), 117289-117289 (2023).
  12. Xuedong, A. N., et al. Shugan jieyu capsule improve sleep and emotional disorder in coronavirus disease 2019 convalescence patients: A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. J Tradit Chin Med. 42 (5), 803-809 (2022).
  13. Ying, H. S. H. Experience of professor huang ying in treating postmenopausal syndrome by chaihu guizhi decoction. J Trad Chinese Med. 38 (23), 4557-4560 (2023).
  14. Yang, Y. X., et al. Studies on the anti-inflammatory effect of xiaoyao pills in the treatment of postmenopausal osteoporosis in mice. J Vis Exp. (210), e67051(2024).
  15. Wu, S. J., Tam, K. W., Tsai, W. H., Chang, C. C., Chao, J. C. Curcumin and saikosaponin a inhibit chemical-induced liver inflammation and fibrosis in rats. Am J Chin Med. 38 (1), 99-111 (2010).
  16. Zhou, Q. R., Chen, M. Y., Wang, M. D. Treatment of chronic endometritis by penning granule: A clinical randomized controlled trial. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 36 (9), 1055-1060 (2016).
  17. Weibing, J., Yankun, D., Jinxin, Z., Suqin, D. Clinical efficacy and safety evaluation of calcitriol combined with bisphosphonates in the therapy of postmenopausal osteoporosis: Based on a retrospective cohort study. BioMed Res Int. 2022, 2711938-2711938 (2022).
  18. Hussain, I., Talaulikar, V. S. A systematic review of randomised clinical trials - the safety of vaginal hormones and selective estrogen receptor modulators for the treatment of genitourinary menopausal symptoms in breast cancer survivors. Post Reprod Health. 29 (4), 222-231 (2023).
  19. Anastasilakis, A. D., et al. Follistatins, activins and inhibins during osteoporosis therapy with denosumab or zoledronate and after their discontinuation. Diabetes Obesity Metab. 27 (4), 2288-2293 (2025).
  20. Si, Y., et al. Curcumin-encapsulated exosomes in bisphosphonate-modified hydrogel microspheres promote bone repair through macrophage polarization and DNA damage mitigation. Materials Today Bio. 32, 101874-101874 (2025).
  21. Shouguo, L. Clinical observation of qiangjin zhuangji decoction combined with denosumab in the treatment of postmenopausal osteoporosis. , (2024).
  22. Yeom, M., Kim, E. Y., Kim, J. H., Jung, H. S., Sohn, Y. High doses of bupleurum falcatum partially prevents estrogen deficiency-induced bone loss with anti-osteoclastogenic activity due to enhanced inos/no signaling. Front Pharmacol. 9, 1314(2018).
  23. Lu, L., Yinliang, X., Liu, Y., Zhenzhong, J., Xiaoyan, L. Analysis of the mechanism of action of euphorbia fischeriana steud on cirrhosis based on network pharmacology. Medicine. 102 (37), e35118(2023).
  24. Nan, L. S. HPLC-UV for the determination of plasma concentration of saikosaponin C in rats' serum. Info Trad Chin Med. 32 (02), 66-68 (2015).
  25. Sakle, N. S., More, S. A., Mokale, S. N. A network pharmacology-based approach to explore potential targets of caesalpinia pulcherima: An updated prototype in drug discovery. Sci Rep. 10 (1), 17217(2020).
  26. Ru, J., et al. Tcmsp: A database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminformatics. 6, 13(2014).
  27. Bowen, Y., Qiuwen, Z., Xiaodong, W., Jingxin, M., Shuqing, Z. Using network pharmacology and molecular docking verification to explore the mechanism of ursolic acid in the treatment of osteoporosis. Medicine. 101 (49), e32222(2022).
  28. Belghalia, E., et al. In silico research on new sulfonamide derivatives as brd4 inhibitors targeting acute myeloid leukemia using various computational techniques, including 3D-QSAR, HQSAR, molecular docking, ADME/Tox, and molecular dynamics. J Biomol Struct Dyn. 42 (17), 9201-9219 (2023).
  29. Chinese pharmacopoeia Commission. The Pharmacopeia of the People's Republic of China 2020 Edition: Volume I. , CHINA MEDICAL SCIENCE PRESS. (2020).
  30. Chinese pharmacopoeia Commission. The pharmacopoeia of the People's Republic of China 2020 edition: volume IV. , CHINA MEDICAL SCIENCE PRESS. (2020).
  31. Xu, S., et al. Material Basis and Mechanism of Erzhi Pill for Preventing Osteoporosis Based on Network Pharmacology. Chin Pharma J. 53 (22), 1913-1920 (2018).
  32. Lee, D. K., et al. Phospholipase c β4 promotes rankl-dependent osteoclastogenesis by interacting with mkk3 and p38 mapk. Exp Mol Med. 57 (2), 323-334 (2025).
  33. Huang, Q., et al. The effects of Ti and Ta particle surface chemistry on inflammation, osteogenesis, and osteoclastogenesis in vitro and in vivo. Colloid Interf Sci Commun. 54, 100716(2023).
  34. Zhao, M., et al. Comprehensive comparison on the anti-inflammation and gc-ms-based metabolomics discrimination between bupleuri chinense dc. And b. Scorzonerifolium willd. Front Pharmacol. 13, 1005011(2022).
  35. Bin, L., et al. Analysis of mutual-detoxication compatibility rules of "bupleuri radix decreaseing liver's yin essence" based on data mining. Chin Trad Herbal Drugs. 53 (14), 4428-4436 (2022).
  36. Ying, W., Xuefeng, Z., Minjing, L., Tingting, Z., Ping, L. Xiaochaihu decoction in diabetic kidney disease: A study based on network pharmacology and molecular docking technology. Integrat Med Nephrol Androl. 8 (1), 13-13 (2021).
  37. Sheng, Z., Hongcheng, L., Min, X. Identifying immune cell infiltration and effective diagnostic biomarkers in rheumatoid arthritis by bioinformatics analysis. Front Immunol. 12, 726747(2021).
  38. Menon, S. M. P., Elengoe, A. Evaluation of the role of kras gene in colon cancer pathway using string and cytoscape software. Biomed Res Ther. 7 (6), 3835-3842 (2020).
  39. Yang, J., et al. Bioinformatics identification based on causal association inference using multi-omics reveals the underlying mechanism of gui-zhi-shao-yao-zhi-mu decoction in modulating rheumatoid arthritis. Phytomed Int J Phytother Phytopharmacol. 136, 156332(2024).
  40. Yang, M., et al. Purification of harvested rainwater using gravity-driven ceramic membrane: A visualization study combining micro-CT and Comsol simulations. J Environ Manag. 373, 123333(2024).
  41. Jui-Ting, H., et al. A comparison of micro-CT and dental CT in assessing cortical bone morphology and trabecular bone microarchitecture. PloS one. 9 (9), e107545(2014).
  42. Yang, S. S., et al. Grem1 inhibits osteogenic differentiation of mbmscs in ovx rats through bmp/smad1/5 signaling pathway. Regenerat Ther. 28, 527-535 (2025).
  43. Huang, W., Zheng, X., Yang, X., Fan, S. Stimulation of osteogenic differentiation by saikosaponin-a in bone marrow stromal cells via wnt/β-catenin pathway. Calcified Tiss Int. 100 (4), 392-401 (2017).
  44. Hattori, T., et al. The fixed herbal drug composition "saikokaryukotsuboreito" prevents bone loss with an association of serum IL-6 reductions in the ovariectomized mouse model. Phytomedicine. 17 (3-4), 170-177 (2010).
  45. Wu, X., et al. Inhibition of lipopolysaccharide-induced inflammatory bone loss by saikosaponin d is associated with regulation of the rankl/rank pathway. Drug Des Dev Ther. 15, 4741-4757 (2021).
  46. Yu-Ting, H., et al. Effects of saikosaponin d on differentially expressed genes, Ctla-4, IL-10, and IL-17 in mice with autoimmune hepatitis. J Shanghai Jiaotong Uni. 40 (03), 303-309 (2020).
  47. Allergy, Z. C. F., et al. Sebocytes contribute to skin inflammation by promoting the differentiation of t helper 17 cells. Br J Dermatol. 178 (3), 722-730 (2018).
  48. Piao, C. H., Song, C. H., Lee, E. J., Chai, O. H. Saikosaponin a ameliorates nasal inflammation by suppressing il-6/ror-γt/STAT3/IL-17/nf-κb pathway in ova-induced allergic rhinitis. Chem Biol Interact. 315, 108874(2020).
  49. Zhimeng, L., et al. Il-17/il-17 receptor pathway-mediated inflammatory response in apostichopus japonicus supports the conserved functions of cytokines in invertebrates. J Immunol. 208 (2), 464-479 (2022).
  50. Wang, X., et al. Forsythiaside a repairs uvb-induced skin inflammatory damage by il-17 signaling pathway. Food Biosci. 64, 105845-105845 (2025).
  51. Ridvan, G., Emine, Y. Evaluation of the awareness and knowledge levels of dentists regarding bisphosphonates and bisphosphonate-related jaw necrosis. J Craniofac Surg. 36 (4), e376-e382 (2025).
  52. Lijuan, W., et al. An ultra-performance liquid chromatography photodiode array detection tandem mass spectrometric method for simultaneous determination of seven major bioactive constituents in Xiaochaihutang and its application to a fourteen-compound compatibility study. J Chromatograph Sci. 53 (9), 1570-1576 (2015).
  53. Wang, D. L., Fang, F. F., Liu, C. S., Su, J. C. expert consensus on integrated traditional chinese and western medicine diagnosis and treatment for osteoporotic fractures. Zhongguo gu shang China. J Orthopaed Traumatol. 37 (3), 242-250 (2024).
  54. Shimeng, L., et al. Antidepressant active components of bupleurum chinense dc-paeonia lactiflora pall herb pair: Pharmacological mechanisms. BioMed Res Int. 2022, 1024693-1024693 (2022).
  55. Ran, S., et al. Bupleurum in treatment of depression disorder: A comprehensive review. Pharmaceuticals (Basel). 17 (4), 512(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Postmenopausal OsteoporosisOvariectomized RatsBone MicrostructureChai Hu TreatmentBone Loss InhibitionInflammatory CytokinesAnti Inflammatory PathwaysEstrogen DeficiencyBone DestructionDose Response

Related Articles