Article de méthode

Dosage de dilution FRET pour l’analyse de l’échange dynamique entre assemblages de protéines

DOI :

10.3791/68678

⸱

19 septembre 2025

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology and the Institute for Collaborative Biotechnologies, University of California, Santa Barbara

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit la purification et le marquage covalent de la réfletine A1 ainsi qu’un test de dilution FRET pour caractériser l’échange dynamique de protéines de réflectine entre les assemblages de protéines en fonction de l’âge.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En tant que moteur moléculaire de l’iridescence accordable chez les céphalopodes, le comportement de phase accordable de la protéine de réflectine A1 continue d’être au centre de l’ingénierie des biomatériaux. La modulation de la concentration en sel et de la densité de charge nette protéique de la réflectine A1 pousse la protéine à former des assemblages dynamiques en tant qu’intermédiaires de la séparation de phase liquide-liquide. Les assemblages de réflectine, bien que limités en taille par l’étendue de la neutralisation de charge de la répulsion cationique et coulombienne de la protéine, sont initialement en échange dynamique avec les monomères ou les oligomères de la solution environnante. Un nouveau test de dilution par transfert d’énergie de résonance de fluorescence (FRET) a été utilisé, en conjonction avec des tests de diffusion dynamique de la lumière (DLS) et de concentration en protéines, pour caractériser le flux bidirectionnel de protéines entre les assemblages de réflectine A1 et une phase diluée en fonction de l’âge de l’assemblage. Ce test de dilution FRET fait la distinction entre le flux unidirectionnel et bidirectionnel de protéines dans et hors des assemblages de protéines et, par conséquent, peut être appliqué lors de la formation de l’assemblage. La différenciation entre les assemblages protéiques dynamiques et cinétiquement arrêtés est cruciale pour comprendre leurs origines biophysiques, et ce nouveau test de dilution FRET peut être adapté pour compléter les investigations biophysiques d’autres assemblages protéiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’iridescence accordable chez les calmars loliginidés est médiée par les protéines de réflectine dans les cellules iridocytaires 1,2,3. Les iridocytes contiennent des invaginations membranaires étendues et régulières qui forment des empilements de lamelles de Bragg riches en protéines, qui réfléchissent la lumière d’une manière dépendante de l’angle et de la longueur d’onde 1,4,5,6. Une cascade de signaux déclenchée par l’acétylcholine culmine dans la phosphorylation des protéines de réflectine cationiques 1,2,7, réduisant la répulsion électrostatique intra- et interprotéique et entraînant la condensation des réflectines dans les lamelles de Bragg de particules de rayon hydrodynamique de 10 à 50 nm à un condensat liquide dense 3,8,9. La réflectine A1 in vitro forme des assemblages de rayon de 10+ nm stables dont les tailles sont ajustées avec précision par la densité de charge nette de protéine 10,11,12, et ce comportement colloïdal accordable a suscité beaucoup d’intérêt en bio-ingénierie dans la conception de matériaux biophotoniques accordables à base de réflectine 13,14,15,16,17,18. Il a récemment été démontré que le NaCl pilote l’assemblage de la réflectine A1 et la LLPS (séparation de phase liquide-liquide) en augmentant entropiquement la contribution énergétique de l’effet hydrophobe et en criblant les charges répulsives des liants cationiques alternatifs19.

Pour les condensats liquides denses en protéines, l’échange dynamique entre la phase dense et la phase diluée peut être facilement analysé à l’aide de la FRAP (récupération de fluorescence après photoblanchiment) de gouttelettes entières20 ; Un test analogue pour les assemblages de protéines à l’échelle nanométrique est nécessaire. Des rapports récents d’assemblages de protéines physiologiquement pertinents en tant qu’intermédiaires de LLPS 19,21,22 ont suggéré la nécessité de méthodes équivalentes pour interroger la dynamique d’assemblage et l’échange dynamique entre les assemblages et la phase diluée coexistante. Les clusters de protéines peuvent inclure des colloïdes de type verre cinétiquement arrêtés produits par décomposition spinodale arrêtée, des assemblages d’équilibre dynamique qui échangent des monomères ou des oligomères de la phase diluée, et des clusters métastables 23,24,25,26,27. La dynamique de l’assemblage des protéines en fonction de l’âge est donc essentielle pour comprendre les processus physiques à l’origine de la formation des assemblages de protéines dans le contexte d’un comportement de phase plus complexe.

Des approches basées sur le FRET analysant l’interaction entre les assemblages de protéines marquées au fluorophore donneur et les assemblages de protéines marquées au fluorophore accepteur ont été utilisées pour caractériser la dynamique des amas de protéines métastables21. Lors du mélange de ces amas, l’émergence du FRET démontre l’échange et le transport de protéines dans les amas21. Cependant, pour certaines protéines, telles que la réflectine A1, des amas se forment et se développent continuellement pendant la durée de l’expérience19. Pour de telles protéines, une approche qui déconvolue le transport unidirectionnel des protéines en grappes, comme cela pourrait se produire lors de la formation continue de grappes arrêtées dynamiquement, et le transport bidirectionnel des protéines entre les assemblages est nécessaire.

Une approche de dilution FRET permet d’y parvenir via une dilution fluorophore (Figure 1), dans laquelle une diminution de FRET signifie un transport bidirectionnel de la protéine entre les assemblages. Des assemblages protéiques de protéine de réflectine ont été préparés qui contenaient des quantités égales de protéines marquées avec un fluorophore accepteur ou un fluorophore donneur. Ces assemblages de réfletine co-marqués ont été dilués avec une solution contenant des assemblages de réflectine non marqués, et l’échange dynamique de protéines entre les assemblages a été analysé en fonction de l’âge de l’assemblage. Cette méthode distingue la formation continue d’amas de protéines cinétiquement arrêtées des amas dynamiques, y compris, mais sans s’y limiter, les amas métastables, les amas qui se développent en raison de la maturation d’Ostwald ou d’autres processus de grossissement similaires, les amas qui se développent par fusion et les amas qui ne sont pas des intermédiaires pour les LLPS. Il ne fait pas uniquement la distinction entre ces différents mécanismes d’échange dynamique, ce qui nécessite des méthodes orthogonales telles que la diffusion dynamique de la lumière, l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et les tests de Bradford19,21. Ce protocole décrit les méthodes de purification de la réflecine A1 de type sauvage et du mutant unique contenant de la cystéine A1-C232S, le marquage covalent de A1-C232S et l’analyse de dilution FRET.

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Protocole

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Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Purification des protéines et marquage covalent

  1. Transformation
    1. Clonez les gènes de la réflectine A1 et de la réflectine A1 C232S (GenBank KF661517.1) dans les plasmides pj411.
    2. Transfectez les cellules de Rosetta 2 (DE3) avec des plasmides en utilisant un traitement par choc thermique28.
    3. Déposer sur plaque les cellules transfectées sur une gélose contenant 50 μg/mL de kanamycine.
    4. Sélectionner une colonie isolée et l’ajouter à 5 mL de TB (Terrific Broth) contenant 50 μg/mL de kanamycine et incuber à 37 °C sur un agitateur à 250 tr/min pendant la nuit.
    5. Isolez les plasmides à l’aide du protocole du kit d’isolement de plasmides pour le séquençage.
  2. Expression de protéines, lyse et purification du corps d’inclusion
    1. Ajouter 5 mL de culture à 1 L LB (bouillon de lysogénie) avec 50 μg/mL de kanamycine, et incuber à 37 °C en agitant. À un A600 de 0,6-0,7, induire l’expression en ajoutant de l’IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) à une concentration finale de 5 mM.
    2. Après 16 h, les cellules de granulés ont été centrifugées à 12 000 x g pendant 10 min. Décantez les granulés de surnageant et de congélation dans un congélateur à -80 °C.
    3. Lyser les cellules et purifier les corps d’inclusion à l’aide du réactif de purification des corps d’inclusion conformément au protocole du fabricant, y compris un traitement de 20 minutes avec 1 μL (25-29 unités) de benzonase et 3-5 KU de lysozyme par ml de réactif de purification des corps d’inclusion après la remise en suspension initiale de la pastille cellulaire. Les corps d’inclusion purifiés apparaîtront sous forme de pastilles brun foncé.
  3. FPLC (chromatographie liquide à protéines rapides)
    1. Préparez 2 L de solution d’acide acétique 8 M d’urée : 5 % v/v (tampon A) et 1 L de chlorhydrate de guanidinium 8 M : solution d’acide acétique à 5 % v/v (tampon B). Filtrez les deux à l’aide d’un filtre à vide de 0,22 μm.
      ATTENTION : Évitez l’inhalation, le contact oculaire et cutané avec le chlorhydrate de guanidinium et portez un EPI (équipement de protection individuelle) approprié lors de la manipulation. Jeter dans un conteneur à déchets dédié.
    2. Mettre en suspension les granulés corporels à inclusion dans une solution d’urée à 5 % d’urée à 5 % par agitation vigoureuse à l’aide d’une barre d’agitation magnétique. La solution apparaîtra trouble. Centrifugeuse de pré-refroidissement à 4 °C, centrifugeuse à 18 000 x g à 4 °C pendant 70 min et collecte du surnageant pour FPLC. Le surnageant apparaîtra brun et transparent.
    3. En utilisant un débit de 2 mL/min pour toutes les étapes suivantes, équilibrez 10 mL de la colonne d’échange cationique avec 5 volumes de colonne (CV) de 95 % de tampon A, 5 % de tampon B, et chargez l’échantillon. Laver l’échantillon non lié avec 5 CV, puis effectuer le gradient d’étape : 5 CV de tampon A à 94 % / 6 % de tampon B, puis 5 CV de tampon B à 10 %.
    4. Évaluer la pureté des fractions correspondant au changement initial de l’étape à 10 % de tampon B par SDS-PAGE et le pool s’il est similaire. Pré-refroidir une centrifugeuse à 4 °C et concentrer les fractions à un volume final de 4 à 5 mL à l’aide d’un concentrateur de centrifugation MWCO de 15 mL et 10 kDa.
  4. HPLC (chromatographie liquide à haute performance)
    1. Préparez 2 L d’eau de 18 mΩ avec 0,1 % d’acide trifluoroacétique (TFA) et 2 L d’acétonitrile avec 0,1 % de TFA. Filtrez les deux à l’aide d’un filtre à vide de 0,22 μm.
      ATTENTION : Le TFA est un acide fumant puissant. Manipuler dans une hotte, en portant l’EPI approprié, et transférer uniquement à l’aide de verre. Évitez l’inhalation, le contact oculaire et cutané avec l’acétonitrile, et portez un EPI approprié lors de la manipulation. Jeter dans un conteneur à déchets dédié.
    2. En utilisant un débit de 1 mL/min pour toutes les étapes suivantes, équilibrez la colonne C4 avec 5 CV de 85 % d’eau de 18 mΩ, 0,1 % d’AFT, 15 % d’acétonitrile et 0,1 % d’AGT.
    3. Commencez à couler et injectez l’échantillon. Écoulez 2 CV, puis commencez une pente constante jusqu’à 80 % d’acétonitrile, 0,1 % de TFA sur 5 CV. La réflectine A1 élue généralement à 73 % d’acétonitrile.
    4. Congelez en coquille des fractions contenant de la protéine de réflectine dans des tubes de 5 mL à l’aide d’un bain d’éthanol et de glace sèche. Lyophiliser et conserver à - 80 °C. Les protéines apparaîtront sous forme de fines feuilles blanches.
  5. Préparation de bouillon de protéines non étiqueté
    1. Préparez 4 L de tampon d’acide acétique pH 4, 25 mM (21,05 mM d’acide acétique, 3,95 mM d’acétate de sodium trihydraté) en utilisant de l’acide acétique glacial et de l’acétate de sodium trihydraté. Ajustez le pH si nécessaire avec 4 M HCl ou 4 M NaOH. Filtrez à l’aide d’un filtre à vide de 0,22 μm.
      ATTENTION : Manipulez les acides/bases forts en portant un EPI approprié. N’ajoutez jamais d’eau à un acide ou à une base forte concentrée.
    2. Décongelez le tube contenant la protéine de réflecutine lyophilisée et, avec le tube dans un bain de glace, résolvez-le avec un tampon d’acide acétique de pH 4 et 25 mM. Une solution protéique complètement résoluble apparaîtra incolore sans turbidité ni précipité visible.
      1. À l’aide d’une cassette de dialyse coupée de poids moléculaire de 10 kDa, dialysez la protéine de réflecine résoluble dans un volume d’échantillon de 1000x de pH 4, tampon d’acide acétique de 25 mM pré-refroidi à 4 °C en utilisant deux changements de 12 h à 4 °C.
    3. Diluer l’échantillon avec un tampon d’acide acétique pH 4, 25 mM pour obtenir une concentration finale en protéines de 100 μM et un volume final d’au moins 150 μL. À l’aide d’un spectromètre UV-VIS, mesurez l’absorbance à 280 nm et utilisez le coefficient d’absorption molaire29 de la réflectine A1 (123,685 M-1 cm-1) pour déterminer la concentration en protéines.
    4. Transférez le stock de protéines de réflectine dans un tube de microcentrifugation à bouchon pression de 0,5 ml et conservez-le à 4 °C jusqu’à 7 jours. Immédiatement avant les expériences, centrifuger le stock de protéines de réflectine à 4 °C dans une microcentrifugeuse pré-réfrigérée à 18 000 x g pendant 15 min. Préparez la réflecine A1 C232S de la même manière en utilisant le coefficient d’absorption molaire de 123 540 M-1 cm-1.
  6. Marquage des protéines
    1. Préparez séparément des stocks de 10 mg/mL de FMTS (fluorescéine-méthanethiosulfonate) et de SRMT (méthanethiosulfonate de sulforhodamine) en ajoutant 1 mL de diméthyl-sulfoxyde sec (DMSO) dans un flacon contenant 10 mg de mélange de sonde fluorescente et de pipette.
      ATTENTION : Éviter tout contact par inhalation, avec les yeux et la peau avec les réactifs de méthanétiosulfonate.
    2. Ajouter 7,7 μL de la matière première FMTS de 10 mg/mL ou 10,4 μL de la matière première SRMT de 10 mg/mL à un tampon d’acide acétique de pH 4, 25 mM jusqu’à un volume final de 150 μL et une concentration finale de 500 μM FMTS ou SRMT. La solution apparaîtra trouble. Aliquote et congélation du reste des stocks de sondes fluorescentes à -80 °C.
    3. Mélanger avec 150 μL de stock de protéines de réflectine 100 μM et bien pipeter le mélange. La concentration finale en protéines est de 50 μM et la concentration finale de la sonde fluorescente est de 500 μM. La turbidité de la solution diminuera.
    4. Enveloppez-les dans du papier d’aluminium et incuberez à la verticale en remuant doucement à température ambiante pendant 4 h, puis toute la nuit à 4 °C. La turbidité de la solution ne doit pas changer.
    5. S’il y a du précipité, remettre en suspension en mélangeant vigoureusement à la pipette. La solution sera trouble. Concentrer la réflectine à l’aide d’un filtre centrifuge MWCO de 10 000 kDa jusqu’à un volume cible de 100 μL et une concentration de 150 μM.
    6. Utilisez la même méthode HPLC et lyophilisation que pour la purification des protéines afin d’éliminer la sonde fluorescente non liée et de stocker les protéines à -80 °C enveloppées dans une feuille d’aluminium. Soluubiliser la protéine marquée en utilisant la même méthode pour la protéine non marquée. Déterminez le degré d’étiquetage.
      REMARQUE : La protéine de réflectine resolubilisée marquée par fluorescence apparaîtra jaune-vert (C199-F) ou rouge foncé (C199-R) sans turbidité ni précipitation.
  7. Préparation de stock de protéines co-étiquetées
    1. Ajouter 27 μL de 100 μM de protéines A1 dans une microcentrifugeuse à bouchon pression de 0,5 mL.
    2. Ajouter 1,5 μL de réflectine A1-C232S marquée à la fluorescéine (appelée C199-F pour désigner la position des acides aminés de la fluorescéine) dans le même tube.
    3. Ajouter 1,5 μL de réflectine A1-C232S marquée à la sulforhodamine (appelée C199-R pour désigner la position des acides aminés de la fluorescéine) dans le même tube. Les concentrations finales sont de 90 μM A1, 5 μM C199-F et 5 μM C199-R.
    4. Envelopper dans du papier d’aluminium et conserver à 4 °C jusqu’à 7 jours.

2. Séries chronologiques FRET

  1. Préparation des tampons et filtration
    1. Préparez 500 ml de tampon d’acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique (MOPS) de 25 mM. Ajustez le pH de la solution à 7 en ajoutant lentement 4 M d’hydroxyde de sodium. Filtrez 10 mL à l’aide d’une seringue de 10 mL et d’un filtre pour seringue de 0,22 μm.
  2. Protéine de centrifugation
    1. Pré-refroidissez la microcentrifugeuse de table à 4 °C. La réfletine A1 non étiquetée et co-marquée stocke à 18 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
  3. Préparation d’assemblages A1 étiquetés
    1. Pour préparer trois répétitions, pipetez 9,6 μL de tampon MOPS (pH 7, 25 mM) dans trois tubes de microcentrifugation à bouchon encliquetant de 0,5 mL.
    2. Ajoutez 0,4 μL de stock de protéines marquées dans chaque tube contenant déjà 9,6 μL de tampon MOPS pour une concentration finale de protéines de 4 μM. Pipetez lentement le mélange deux fois en aspirant et en distribuant tout le volume de l’échantillon.
    3. Enveloppez-les immédiatement dans du papier d’aluminium et placez-les dans l’incubateur à 25 °C. Cette solution et toutes les solutions d’assemblage suivantes sont dépourvues de turbidité ou de précipitation apparente avant ou après l’incubation.
  4. Préparation d’assemblages A1 non étiquetés
    1. Pour préparer trois répétitions, pipetez 38,4 μL de tampon MOPS dans trois tubes de microcentrifugation à bouchon encliquetant de 0,5 mL.
    2. Ajoutez 1,6 μL de stock de protéines de réflectine A1 dans chaque tube contenant déjà 38,4 μL de tampon MOPS pour une concentration finale de protéines de 4 μM. Pipeter lentement le mélange deux fois en aspirant et en distribuant tout le volume de l’échantillon.
    3. Enveloppez-les immédiatement dans du papier d’aluminium et placez-les dans l’incubateur à 25 °C.
  5. Chronométrage et mélange d’assemblages A1 co-marqués et non étiquetés
    1. Ordonner la préparation des assemblages comme suit : préparer simultanément et séparément les assemblages d’un appareil expérimental co-marqué réflectine et d’un expérimental non étiqueté réflectine. Répétez les étapes 2.3 et 2.4.
    2. Mélangez en ajoutant 40 μL d’assemblage A1 expérimental non étiqueté à 10 μL d’expérimental co-marqué, et pipetez doucement le mélange en aspirant et en distribuant tout le volume deux fois. Les mesures seront effectuées 24 h après cette étape.
    3. Le temps écoulé entre l’assemblage de la réflectine A1 par dilution dans un tampon MOPS (pH 7, 25 mM) et le mélange des assemblages marqués et non étiquetés est l’âge de l’assemblage. Les âges des assemblées utilisés pour ces données étaient les suivants : 0 min, 1 min, 10 min, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min, 540 min, 1080 min et 1620 min.
  6. Contrôles
    1. Contrôle positif
      1. À partir des stocks de protéines A1 et marqués, préparez 20 μL de stock de protéines qui sont 80 μM A1 et 20 μM de stock de protéines co-marquées.
      2. Ajoutez 38,4 μL de tampon MOPS dans des tubes de microcentrifugation à bouchon encliquetant de 0,5 mL, puis ajoutez 1,6 μL de protéines marquées A1/20 μM de 80 μM et mélangez deux fois à la pipette en aspirant lentement et en distribuant tout le volume. Couvrir immédiatement dans une feuille d’aluminium et placer dans l’incubateur à 25 °C. Répétez l’opération pour un total de 9 échantillons.
    2. Contrôle négatif
      1. Ajoutez 0,4 μL de stock étiqueté à un tube de microcentrifugation à bouchon encliquetable de 0,5 ml contenant déjà 9,6 μL de tampon MOPS. Pipeter lentement le mélange deux fois en aspirant et en distribuant tout le volume de l’échantillon.
      2. Ajoutez 40 μL de tampon MOPS et mélangez deux fois la pipette en aspirant et en distribuant tout le volume de l’échantillon. Couvrir immédiatement dans une feuille d’aluminium et placer dans l’incubateur à 25 °C. Répétez l’opération pour un total de 9 échantillons.
  7. Cuvette et tampon vierge
    1. Réglez le fluorimètre pour qu’il excite à 488 nm et enregistre des spectres continus de 520 à 700 nm.
    2. Remplissez une cuvette de fluorimètre submicro en quartz propre avec 50 μL de tampon MOPS (pH 7, 25 mM) et mesurez.
    3. Retirez la mémoire tampon.
  8. Procédure expérimentale
    REMARQUE : Toutes les expériences doivent être enregistrées 24 h après le mélange d’assemblages de réflectine A1 co-marqués et non étiquetés. Pipeter doucement 50 μL de la solution expérimentale dans la cuvette et mesurer.
    1. Prélever l’échantillon, le rincer avec un tampon d’acide acétique de 500 μL, puis avec de l’eau filtrée de 500 μL à 0,22 μm et à 18 mΩ. Effectuez une mémoire tampon vierge.
  9. Contrôles
    1. Mesurer à 1440 min, 1960 min et 3060 min après préparation des commandes (correspondant à des âges d’assemblage de 0 min, 520 min et 1620 min). Ces mesures concluent la partie expérimentale du protocole.

3. Analyse des données

  1. Soustrayez les spectres de l’ébauche de tampon des spectres expérimentaux.
  2. Déterminez le rapport Em588/Em520.
  3. Pour chaque répétition, déterminez la moyenne et l’écart-type de chaque groupe de trois répétitions. Tracer Em588/Em520 en fonction de l’âge de l’assemblage.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Après dilution d’assemblages de réfletine A1 contenant à la fois de la protéine marquée au fluorophore donneur et de la protéine accepteur marquée au fluorophore avec des assemblages de réfletine A1 non marqués, une diminution initiale de l’émission de FRET à 588 nm par rapport aux assemblages non dilués a été observée (Figure 2A). La FRET pour les assemblages d’âge 0 min était similaire à celle du témoin positif, et la FRET pour les assemblages d’âge de 1620 min (le temps entre la formation...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un point commun de perte de protéines pendant la purification est la remise en suspension incomplète des granules de corps d’inclusion pour toutes les étapes du protocole de purification du corps d’inclusion, et la remise en suspension finale des corps d’inclusion purifiés dans de l’urée 8 M à 5 % v/v d’acide acétique. La resolbilisation du corps d’inclusion peut prendre jusqu’à 24 h d’agitation vigoureuse avec une petite barre d’agitation magnétique dans un tube conique de 40 ml. Pour é...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La recherche a été soutenue par l’Institute for Collaborative Biotechnologies par le biais des subventions W911NF-19-2-0026 et W911NF-23-1-0330 du U.S. Army Research Office. Le contenu de l’information ne reflète pas nécessairement la position ou la politique du gouvernement, et il ne faut pas en déduire qu’il y a eu approbation officielle.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 &mu ; Micropipette d’une capacité L
2 &mu ; Micropipette d’une capacité L
2-[(5-fluorescéinyl)aminocarbonyl]méthanethiosulfonate d’éthyleSanta Cruz BiotechnologiesSC-216155CAS  ; 351330-42-2
20 &mu ; Micropipette d’une capacité L
200 &mu ; Micropipette d’une capacité L
Acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique, acide 4-morpholinepropanesulfoniqueSigma-AldrichM1254NCA 1132-61-2
Acide acétiqueSigma-AldrichA6283NCA 64-19-7
AcétonitrileSigma-AldrichRéférence 34851-1LNCA 75-05-8
Poudre d’agarBiologique de la Caroline842133NCA 9002-18-0
Aluminium
Filtre centrifuge Amicon Ultra, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC501008Contenance de 0,5 ml
Filtre centrifuge Amicon Ultra, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC901008Capacité de 15 ml
balance analytique
BenzonaseMillipore-Sigma70664-3NCA 9025-65-4
Réactif d’extraction de protéines BugBusterMillipore Sigma70584-3
Spectromètre de fluorescence Cary EclipseCary-Eclipse
Logiciel Cary Eclipse
Tubes à centrifuger Corning 50 mlMillipore-SigmaCLS430829
Seringues jetables, Luer-Lok 10 mLCole-ParmerUX-12915-02
DMSOSigma-AldrichD8418NCA 67-68-5
Neige carbonique
Système FPLC à double pompe
Système HPLC à double pompe
ÉthanolMillipore SigmaEX0280-3NCA 64-17-5
Rotor de centrifugeuse au sol d’une capacité de 500 ml
Centrifugeuse au sol  ;
Congélateur, -80° ; C
Hotte
Chlorhydrate de guanidineThermo ScientificAAA135430B50-01-1
Colonne de chromatographie d’échange de cations HiTrap SP HPCytiva17115101
Acide chlorhydriqueSigma-AldrichRéférence 258148-25MLCAS 7647-01-0
Incubateur
Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranosideSigma-AldrichI6758-1G
Sulfate de kanamycineSigma-AldrichK1637NCA 25389-94-0
Lyophilisateur
LysozymeThermo Scientific90082
Barre d’agitation magnétique
Plaque d’agitation magnétique
Micro-électrode de pH S7Metler Toledo51343160
Microcentrifugeuse avec contrôle de la température
Filtre à seringue Millex PVDFMilliporeSLGVR33RS0,22 &mu ; m, 33mm diam.
Filtre Milli-Q MillipakMillipore SigmaMPGP002A1
Système de purification d’eau Milli-Q UltraPureMillipore Sigma
NaClThermo ScientificAA12314A9NCA 7647-14-5
Flacons de centrifugation Nalgene, style 3120Millipore-SigmaRéf. B1283-4EAPour l’enrobage des bactéries
Laboratoire orbital  ; agitateur avec incubateur
PC
PétriSigma-AldrichRéf. P5731-500EA
Plasmide PJ411ADN 2.0
Protéine LoBind  ; Tubes coniquesEppendorfEP30108302Contenance de 5 ml
Protéine LoBind  ; Tubes de microcentrifugationEppendorfEP022431102Contenance de 0,5 ml
Erlenmeyer à chicanes en pyrex 1 000 mlMillipore-SigmaCLS44501Pour l’incubation de cultures bactériennes
Bécher Griffon en Pyrex 2 000 mLMillipore-SigmaCLS10002LPour toute la préparation du tampon et de la solution  ;
Flacons de stockage ronds en pyrex 1 000 mlMillipore-SigmaCLS13951LPour le stockage de toutes les préparations de tampons et de solutions, utiliser avec des filtres à flacons sous vide
Qiaprep Spin Miniprep KitQiagen27104
Réfrigérant
Cellules compétentes de Rosetta 2(DE3)Novagen71397-3
Cassettes de dialyse Slide-a-lyzer 10K MWCOThermo ScientificPI66383Contenance de 0,5 ml
Acétate de sodium trihydratéSigma-AldrichRéférence S8625NCA 6131-90-4
Hydroxyde de sodiumSigma-AldrichRéférence 567530-250GMNCA 1310-73-2
Steritop Filtre supérieur pour bouteille sous videMillipore SigmaS2GPT05RE0,22 &mu ; Filtre stérile M
Sous-microcuvette, capacité de 50 uLCellules de Starna16.40F-Q-10/Z15
méthanéthiosulfonate de sulforhodamineSanta Cruz BiotechnologiesSC-220172CAS  ; 386229-71-6
Acide trifluoroacétiqueSigma-AldrichRéférence 106232-25GNCA 407-25-0
TryptoneSpectrum Chemical  ;Réf. T1333
UréeThermo ScientificAAA123600ENCA 57-13-6
Spectromètre UV-VIS
Extrait de levureGibco211929

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeMartini, D. G., Izumi, M., Weaver, A. T., Pandolfi, E., Morse, D. E. Structures, organization, and function of reflectin proteins in dynamically tunable reflective cells. J Biol Chem. 290 (24), 15238-15249 (2015).
  2. Izumi, M., et al. Changes in reflectin protein phosphorylation are associated with dynamic iridescence in squid. J R Soc Interface. 7 (44), 549-560 (2010).
  3. Tao, A. R., et al. The role of protein assembly in dynamically tunable bio-optical tissues. Biomaterials. 31 (5), 793-801 (2010).
  4. Ghoshal, A., DeMartini, D. G., Eck, E., Morse, D. E. Optical parameters of the tunable Bragg reflectors in squid. J R Soc Interface. 10 (85), 20130386(2013).
  5. Ghoshal, A., DeMartini, D. G., Eck, E., Morse, D. E. Experimental determination of refractive index of condensed reflectin in squid iridocytes. J R Soc Interface. 11 (95), 20140106(2014).
  6. Ghoshal, A., Eck, E., Gordon, M., Morse, D. E. Wavelength-specific forward scattering of light by Bragg-reflective iridocytes in giant clams. J R Soc Interface. 13 (120), 20160285(2016).
  7. Mäthger, L. M., Collins, T. F. T., Lima, P. A. The role of muscarinic receptors and intracellular Ca2+ in the spectral reflectivity changes of squid iridophores. J Exp Biol. 207 (11), 1759-1769 (2004).
  8. Morse, D. E., Taxon, E. Reflectin needs its intensity amplifier: Realizing the potential of tunable structural biophotonics. Appl Phys Lett. 117 (22), 220501(2020).
  9. Hanlon, R. T., Cooper, K. M., Budelmann, B. U., Pappas, T. C. Physiological color change in squid iridophores. Cell Tissue Res. 259, 3-14 (1990).
  10. Levenson, R., et al. Calibration between trigger and color: Neutralization of a genetically encoded coulombic switch and dynamic arrest precisely tune reflectin assembly. J Biol Chem. 294 (45), 16804-16815 (2019).
  11. Levenson, R., Bracken, C., Bush, N., Morse, D. E. Cyclable condensation and hierarchical assembly of metastable reflectin proteins, the drivers of tunable biophotonics. J Biol Chem. 291 (8), 4058-4068 (2016).
  12. Levenson, R., et al. Protein charge neutralization is the proximate driver dynamically tuning a nanoscale Bragg reflector. bioRxiv. 9, (2021).
  13. Tobin, C. M., et al. Reversible and size-controlled assembly of reflectin proteins using a charged azobenzene photoswitch. Chem Sci. 15, 13279-13289 (2024).
  14. Loke, J. J., Hoon, S., Miserez, A. Cephalopod-mimetic tunable photonic coatings assembled from quasi-monodispersed reflectin protein nanoparticles. ACS Appl Mater Interfaces. 14 (18), 21436-21452 (2022).
  15. Kramer, R. M., Crookes-Goodson, W. J., Naik, R. R. The self-organizing properties of squid reflectin protein. Nat Mater. 6 (7), 533-538 (2007).
  16. Xu, C., Stiubianu, G. T., Gorodetsky, A. A. Adaptive infrared-reflecting systems inspired by cephalopods. Science. 359 (6383), 1495-1500 (2018).
  17. Ordinario, D. D., et al. Bulk protonic conductivity in a cephalopod structural protein. Nat Chem. 6 (7), 596-602 (2014).
  18. Ordinario, D. D., et al. Protochromic devices from a cephalopod structural protein. Adv Opt Mater. 5 (20), 1600751(2017).
  19. Gordon, R., et al. Charge screening and hydrophobicity drive progressive assembly and liquid-liquid phase separation of reflectin protein. J Biol Chem. 301 (3), 108277(2025).
  20. Bracha, D., Walls, M. T., Brangwynne, C. P. Probing and engineering liquid-phase organelles. Nat Biotechnol. 37 (12), 1435-1445 (2019).
  21. Kar, M., et al. Phase separating RNA binding proteins form heterogeneous distributions of clusters in subsaturated solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2202222119(2022).
  22. Lan, C., et al. Quantitative real-time in-cell imaging reveals heterogeneous clusters of proteins prior to condensation. Nat Commun. 14 (1), 4831(2023).
  23. Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2 (11), 2346(2010).
  24. Gibaud, T., Schurtenberger, P. A closer look at arrested spinodal decomposition in protein solutions. J Phys Condens Matter. 21 (32), 322201(2009).
  25. Cardinaux, F., Gibaud, T., Stradner, A., Schurtenberger, P. Interplay between spinodal decomposition and glass formation in proteins exhibiting short-range attractions. Phys Rev Lett. 99 (11), 118301(2007).
  26. Sciortino, F., Mossa, S., Zaccarelli, E., Tartaglia, P. Equilibrium cluster phases and low-density arrested disordered states: The role of short-range attraction and long-range repulsion. Phys Rev Lett. 93 (5), 055701(2004).
  27. Segrè, P., Prasad, V., Schofield, A., Weitz, D. Glass-like kinetic arrest at the colloidal-gelation transition. Phys Rev Lett. 86 (26), 6042-6045 (2001).
  28. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  29. Gill, S. C., Von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
  30. Lychko, I., Soares, C. L., Dias, A. M. G. C., Roque, A. C. A. A scalable method to purify reflectins from inclusion bodies. Sep Purif Technol. 315, 123736(2023).
  31. Berliner, L. J., Grunwald, J., Hankovszky, H. O., Hideg, K. A novel reversible thiol-specific spin label: Papain active site labeling and inhibition. Anal Biochem. 119 (2), 450-455 (1982).
  32. Kenyon, G. L., Bruice, T. W. Novel sulfhydryl reagents. Methods Enzymol. 47, 407-430 (1977).
  33. Renault, K., Fredy, J. W., Renard, P. Y., Sabot, C. Covalent modification of biomolecules through maleimide-based labeling strategies. Bioconjug Chem. 29 (8), 2497-2513 (2018).
  34. Northrop, B. H., Frayne, S. H., Choudhary, U. Thiol-maleimide "click" chemistry: Evaluating the influence of solvent, initiator, and thiol on the reaction mechanism, kinetics, and selectivity. Polym Chem. 6 (18), 3415-3430 (2015).
  35. Stauffer, D. A., Karlin, A. Electrostatic potential of the acetylcholine binding sites in the nicotinic receptor probed by reactions of binding-site cysteines with charged methanethiosulfonates. Biochemistry. 33 (22), 6840-6849 (1994).
  36. Bressloff, P. C. Active suppression of Ostwald ripening: Beyond mean-field theory. Phys Rev E. 101 (4), 042804(2020).
  37. Berry, J., Brangwynne, C. P., Haataja, M. Physical principles of intracellular organization via active and passive phase transitions. Rep Prog Phys. 81 (4), 046601(2018).

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