Lymphadénectomie mésentérique murine pour la perturbation sélective de la communication lymphatique avec l’intestin régional

Résumé

Ce protocole décrit une procédure de survie pour une lymphadenectomie mésentérique murine sûre et bien tolérée à chacune des quatre stations le long de la chaîne ganglionnaire mésentérique. Cette procédure est adaptable pour permettre une perturbation sélective de la communication lymphatique avec le côlon distal, le côlon proximal et/ou l’intestin grêle.

Résumé

L’immunosurveillance versus la tolérance aux antigènes est un équilibre délicat dans le microenvironnement intestinal, durant lequel le rôle crucial de l’amorçage des lymphocytes circulants dans les ganglions lymphatiques locaux est bien connu. Après l’amorçage des lymphocytes T, la littérature récente a commencé à démontrer un rôle unique et non redondant des lymphocytes T non circulants résidant dans le ganglion lymphatique drainant d’un organe. Cela peut être particulièrement vrai dans l’intestin, où le drainage lymphatique est connu pour être très spécifique. Cependant, pour comprendre pleinement l’impact unique de ces cellules locales face à la redondance fonctionnelle systémique, la communauté scientifique nécessite une procédure bien décrite pour isoler et perturber sélectivement ces nœuds. Voici une procédure de survie pour une lymphadénectomie mésentérique murine, sûre et bien tolérée, à chacune des quatre stations le long de la chaîne ganglionnaire mésentérique. Cette procédure est adaptable pour permettre une perturbation sélective de la communication lymphatique avec le côlon distal, le côlon proximal et/ou l’intestin grêle. On y trouve des instructions détaillées, des supports visuels, des conseils utiles pour améliorer le succès, ainsi que des solutions de dépannage pour une survie sous-optimale. Les ganglions lymphatiques réséqués sont immédiatement prêts pour un traitement ultérieur si nécessaire. Cette technique convient particulièrement aux études nécessitant une perturbation sélective du drainage lymphatique du côlon distal, du côlon proximal et/ou de l’intestin grêle.

Introduction

Les lymphocytes T sont l’un des principaux types de cellules effectrices dans l’immunité adaptative, avec des rôles décrits dans diverses catégories de maladies, notamment les infections, l’auto-immunité et la^{malignité 1,2,3}. Une étape cruciale pour la fonctionnalité des lymphocytes T est l’amorçage triphasé par les cellules présentatrices d’antigènes dans les organes lymphatiques secondaires, tels que les ganglions^{locaux 4}. En médecine moderne, un pilier d’une résection oncologique appropriée à travers plusieurs systèmes d’organes comprend un certain degré d’échantillonnage local ou de résection ganglionnaire en^bloc 5,6,7,8. Par exemple, dans le cas du cancer du côlon, les recommandations de consensus recommandent de retirer et d’examiner 12 ganglions lymphatiques lors d’une résection à intention curative en raison d’une corrélation claire avec une meilleure survie à^{long terme 6,7}. Cependant, les ganglions lymphatiques locaux peuvent-ils vraiment être réséqués en toute impunité ? Des études récentes chez la souris ont démontré que le ganglion lymphatique drainant la tumeur contient un réservoir de précurseurs antitumoraux des lymphocytes T, qui peuvent être protégés contre la différenciation terminale et l’épuisement des lymphocytes T qui se produisent dans le microenvironnement^{tumoral 9,10,11}. Cela suggérerait que la suppression d’une population aussi critique pourrait affaiblir les capacités d’immunosurveillance en cours.

Le schéma de drainage de la lymphe intestinale chez la souris est connu pour être assez spécialisé le long de la chaîne des ganglions mésentériques ; par exemple, le côlon proximal est presque exclusivement drainé par la première station ganglionnaire, l’intestin grêle par la deuxième/troisième station, et le côlon distal principalement par la quatrième station¹² (Figure 1, Figure supplémentaire 1). Ainsi, la communication directe entre les segments de l’intestin et les lymphatiques peut être perturbée par une ablation ciblée de ces ganglions. Pour bloquer le trafic entre les ganglions lymphatiques et les tissus, des agonistes du récepteur S1P, tels que FTY720, et le blocage de l’intégrine sont couramment utilisés ; Cependant, ces médicaments inhibent globalement le trafic et ne peuvent donc pas être utilisés pour étudier la contribution de ganglions lymphatiques^{spécifiques 13,14}. Cependant, la capacité de la communauté scientifique au sens large à étudier l’effet local des interactions immunitaires au sein des ganglions lymphatiques intestinaux est limitée par l’absence d’une résection chirurgicale bien décrite pour chaque station. Avec cette lacune en tête, une procédure de survie pour la lymphadénectomie mésentérique murine à chaque station ganglionnaire a été développée et est décrite ici. L’objectif global de cette intervention est d’assurer une excision sûre et fiable des stations ganglionnaires mésentériques chez les souris présentant une forte survie postopératoire et une tolérance élevée.

Cette procédure a été testée et est facilement réalisée chez des souris juvéniles et adultes, sur plusieurs souches (c’est-à-dire Balb/c, C57BL/6J, 129S4), mais elle est limitée par le besoin de ganglions lymphatiques accessibles et facilement identifiables. Par conséquent, il peut ne pas être bien adapté à la combinaison avec des modèles murins ou des génotypes ayant des ganglions lymphatiques plus petits que la normale ou imperceptibles (par exemple, des souris déficientes en lymphotoxine alpha)¹⁵. De plus, les souris plus âgées (>15 semaines) ont tendance à avoir une adiposité viscérale plus élevée, ce qui rend l’identification et l’isolement des ganglions plus difficiles, et bien que ce ne soit pas une contre-indication, cela peut limiter le succès ou la procédure. En dehors de ces limitations, la lymphadénectomie mésentérique offre une perturbation des ganglions lymphatiques hautement contrôlée et très sélective. Cette procédure serait la mieux adaptée pour résoudre des questions sur l’effet local des ganglions lymphatiques et leurs cellules immunitaires résidentes associées ainsi que leurs interactions sur les segments de l’intestin (par exemple, côlon proximal, côlon distal, intestin grêle).

Figure 1 : Points de repère anatomiques des stations dans la chaîne des ganglions lymphatiques mésentériques. (A) Représentation non marquée et (B) marquée de quatre stations ganglionnaires mésentériques majeures in situ. Le drainage proximal du côlon se fait principalement via la station 1, l’intestin grêle est principalement la station 2/3, et le côlon distal est principalement la station 4. (DC = côlon distal, ICV = vaisseaux iléocoliques, PC = côlon proximal, CEC = cécum, IV/JV = vaisseaux iléaux/vaisseaux jéjunaux, SI = intestin grêle). Barres d’échelle : 1,5 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Protocole

Toutes les procédures sont réalisées conformément aux protocoles du Comité d’Utilisation et de Soins Institutionnels des Animaux de Yale. Pour développer cette procédure, on a utilisé la souche C57BL/6 de 8 à 12 semaines, des souris sauvages et des témoins simulés jumelés âge/sexe/génotype. Les souris mâles et femelles étaient incluses. Le poids corporel variait de 18 à 25 g. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation des instruments, des animaux et de la salle d’opération

1. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux. Assurez-vous que la surface d’opération et le cône anesthésiant du nez sont nettoyés avec 70 % d’éthanol.
2. Installez la machine à vaporisateur anesthésique inhalé avec un cône de nez et une aspiration pour récupérer l’excès d’anesthésique. Installez une surface de fonctionnement avec un tampon de circulation d’eau tiède pour maintenir la température corporelle et les fournitures de l’animal dans un endroit pratique et stérile.
   REMARQUE : Cette procédure ne nécessite pas de microscope opératoire ; Cependant, envisagez d’inclure cet instrument pour améliorer la visualisation.
3. Induire l’anesthésie en administrant 2 % à 3 % d’isoflurane inhalé avec un débit d’oxygène de 2 L/ min via le cône nasal provenant d’une machine à vaporisateur anesthésique inhalé (selon les protocoles approuvés par l’institution).
   1. Assurez-vous d’un plan d’anesthésie approprié en confirmant une fréquence respiratoire d’environ 30 à 40 respirations/minute et l’absence de réponse au pincement de l’arrière-pied. Vérifiez périodiquement le plan d’anesthésie approprié et ajustez en conséquence le débit d’isoflurane.
      REMARQUE : Sinon, un anesthésique injectable est également approprié.
4. Suivez les recommandations de l’institut pour l’analgésie appropriée et l’anesthésie locale. Par exemple, administrez un analgésique à action prolongée comme 3,25 mg/kg de buprénorphine XR par voie sous-cutanée et administrez jusqu’à 0,04 mL/5g de poids corporel de solution de lidocaïne de 1 mg/mL par voie sous-cutanée à l’incision prévue.
5. Préparez l’animal à la procédure en positionnant allongé, en appliquant du lubrifiant oculaire, en arrachant ou en coupant la fourrure abdominale, puis en stérilisant l’abdomen avec une solution de povidone/iode, suivie d’un traitement à 70 % d’éthanol (Figure 2A).
6. Utilisez des gants stériles et appliquez des rideaux stériles sur l’animal avec une fenêtre donnant sur le champ opératoire. Maintenez la stérilité tout au long de la procédure.

Figure2 : Images représentatives des étapes procédurales majeures de la lymphadénectomie mésentérique. (A) Fenêtre abdominale épilée et stérilisée. (B) Incision de 0,5 cm à travers la peau et la ligne alba. (C) Exposition de la chaîne ganglionnaire mésentérique en orientant l’iléon droit, le côlon proximal gauche et le cécum inférieur. Le premier ganglion lymphatique mésentérique se trouve le long de l’artère iléocolique (flèche blanche). (D) ganglion lymphatique mésentérique excisé (flèche délavée). Barres d’écaille : 0,5 cm. (E) ganglion lymphatique mésentérique ex vivo (flèche blanche ; 2,5 mm x 3 mm). Tiques = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

2. Préparation de la lymphadénectomie mésentérique

1. Faites une incision médiane de 0,5 à 1 cm à travers la peau. Disséquez la peau de façon directe en l’éloignant de la paroi abdominale et identifiez la ligne blanche. Effectuer une incision de 0,5 à 1 cm à travers la ligne alba pour accéder à la cavité péritonéale (Figure 4B).
   REMARQUE : Pour améliorer l’accès aux ganglions de la station 2/3/4, envisagez d’étendre l’incision céphalée, mais sans dépasser le processus xiphoïde cartilagineux.
2. Injectez 1 mL de solution saline stérile à température corporelle dans la cavité péritonéale à l’aide d’une aiguille à pointe émoussée et humidifiez les rideaux stériles en préparation de la position intestinale. Utilisez des écussonnettes stériles et humidifiées à bout de coton pour identifier et éviscérer le cecum à travers l’incision.
   1. Évitez d’utiliser des instruments tranchants pour manipuler l’intestin, car cela peut entraîner des blessures. Humidifiez périodiquement les rideaux et les intestins pour éviter les dommages causés par le séchage.
      REMARQUE : Le cæcum murin réside généralement dans le quadrant inférieur gauche de l’abdomen, mais peut être logé dans n’importe quel quadrant.
3. Clarifiez la ou les stations de ganglions mésentériques cibles pour la résection et suivez les instructions spécifiques ci-dessous (c’est-à-dire 3.1-3.4). Voir la Figure 1A,B pour les repères anatomiques et l’identification.

3. Dissection et excision des stations ganglionnaires mésentériques

1. Première station ganglionnaire (drainage proximal du côlon ; Figure supplémentaire 1A,B').
   1. Orienter l’intestin extériorisé sur des rideaux humides avec le cécum en bas, le côlon proximal en haut, et l’iléon terminal vers la droite du chirurgien (côté gauche de l’animal ; Figure 1A, Figure 2C).
   2. Identifiez la chaîne ganglionnaire mésentérique, qui suit longitudinalement le côlon. À l’aide de pinces à pointe fine inclinées, disséquez brutalement la première station ganglionnaire à l’écart des vaisseaux iléocoliques en plaçant des pinces fermées dans l’espace entre ces structures et en laissant la pince s’ouvrir doucement.
      1. Retirez les pinces et répétez cette manœuvre 2 à 3 fois ou jusqu’à ce qu’un plan suffisant soit créé pour une excision sûre. Éviter les dommages aux principaux vaisseaux sanguins du côlon (Figure 3A,B).
         REMARQUE : Si un saignement important est constaté, interrompez la procédure et euthanasiez l’animal de manière humaine (conformément aux protocoles institutionnels approuvés).
   3. OPTIONNEL : Pour diminuer le risque théorique de collatéralisation vers les ganglions voisins, réalisez une ligature de suture optionnelle avec des points de suture simples interrompus le long de la chaîne ganglionnaire (un 1 mm distal et un 1 mm proximal à la première station ganglionnaire) en utilisant une suture en nylon monofilament noir 9-0 et des pinces à pointe fine pour enfoncer l’aiguille (Figure 3C,D).
   4. Rétractez doucement la station lymphatique ligatuée de la caude et, à l’aide de ciseaux à pointe fine, excisez la station ganglionnaire cible de la céphale à la caude (Figure 3E).
      REMARQUE : Souvent, les souris ont un petit vaisseau d’alimentation visible quittant l’artère iléocolique vers la face postérieure du ganglion lymphatique. Le saignement de ce vaisseau peut être contrôlé par une pression douce avec un coton-bouchon jusqu’à ce que l’hémostasie soit atteinte.

Figure3 : Images annotées et commentaires de la lymphadenectomie mésentérique (première station). (A) Une orientation correcte de l’intestin expose la première station ganglionnaire mésentérique (flèche blanche). (B) Un plan est créé entre l’artère iléocolique (flèche bleue) et le nœud. (C) La ligature par suture des vaisseaux d’alimentation entrant par l’apex du ganglion lymphatique (flèche bleue) est effectuée en excluant les vaisseaux iléocoliques en sortant de l’espace entre ces structures (flèche blanche). (D) Une ligature par suture de la base du ganglion lymphatique est réalisée, en notant à nouveau et en évitant les branches distales de l’artère iléocolique. (E) Le ganglion est excisé le long du plan tissulaire précédemment créé, restant haut vers le ganglion lymphatique et laissant derrière eux des ligatures de suture (flèches noires). (F) L’hémostasie est confirmée, des branches distales de l’artère iléocolique sont observées pour assurer un bon flux sanguin, et l’espace vide (flèche estompée) où le ganglion se trouvait auparavant est noté comme étant exempt de ganglion résiduel. Barres d’échelle : 0,5 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Deuxième station ganglionnaire (drainage intestin grêle distal)
   1. Éviscérez doucement aussi l’intestin grêle. Orienter l’intestin extériorisé sur des rideaux humides avec le cécum en bas, le côlon proximal en haut, et l’intestin grêle vers la droite du chirurgien (côté gauche de l’animal ; Figure 1A).
   2. Identifiez la chaîne ganglionnaire mésentérique, qui suit longitudinalement le côlon. La deuxième station commence à la confluence des vaisseaux iléaux/jéjunaux (Figure 1B).
      1. À l’aide de pinces à pointe fine inclinée, disséquez de manière directe la deuxième station de ganglion lymphatique, à l’écart des vaisseaux du côlon, en plaçant des pinces fermées dans l’espace entre ces structures et en laissant les pinces s’ouvrir doucement.
      2. Retirez les pinces et répétez cette manœuvre 2 à 3 fois ou jusqu’à ce qu’un plan suffisant soit créé pour une excision sûre. Évitez les dommages aux principaux vaisseaux sanguins du côlon. Faites également une attention particulière aux vaisseaux iléaux et jéjuns, qui seraient préjudiciables en cas de blessure.
         REMARQUE : En cas de saignement important, interrompez la procédure et euthanasiez l’animal de manière humaine.
   3. OPTIONNEL : Pour diminuer le risque théorique de collatéraux pour les ganglions voisins, réalisez une ligature de suture optionnelle avec des sutures simples interrompues le long de la chaîne ganglionnaire (une distale de 1 mm et une de 1 mm proximale à la deuxième station ganglionnaire) à l’aide d’une suture en nylon monofilament noir 9-0 et des pinces à pointe fine pour enfoncer l’aiguille (Figure supplémentaire 2A).
   4. Rétractez doucement la station lymphatique ligatuée du caudad et, à l’aide de ciseaux à pointe fine, excisez la station ganglionnaire cible du céphalat au caudad (Figure supplémentaire 2B).
      REMARQUE : Souvent, les souris ont un petit vaisseau d’alimentation visible quittant l’artère iléocolique vers la face postérieure du ganglion lymphatique. Le saignement de ce vaisseau peut être contrôlé par une pression douce avec un coton-bouchon jusqu’à ce que l’hémostasie soit atteinte.
3. Deuxième et troisième station ganglionnaire (drainage prox-mid-distal de l’intestin grêle ; Figure supplémentaire 1C,D'
   1. Éviscérez doucement l’intégralité de l’intestin grêle jusqu’au point de fixation postérieure (ligament de Treitz). Orienter l’intestin extériorisé sur des rideaux humides avec le cécum en bas, le côlon proximal en haut, et l’intestin grêle vers la droite du chirurgien (côté gauche de l’animal ; Figure 1A).
   2. Identifiez la chaîne ganglionnaire mésentérique, qui suit longitudinalement le côlon. La deuxième station commence à la confluence des vaisseaux iléaux/jéjunaux (Figure 1B).
      1. À l’aide de pinces à pointe fine inclinée, disséquez de façon directe les deuxième et troisième ganglions lymphatiques loin des vaisseaux du côlon en plaçant des pinces fermées dans l’espace entre ces structures et en laissant la pince s’ouvrir doucement.
      2. Retirez les pinces et répétez cette manœuvre 2 à 3 fois ou jusqu’à ce qu’un plan suffisant soit créé pour une excision sûre. Évitez les dommages aux principaux vaisseaux sanguins du côlon. Faites également une attention particulière aux vaisseaux iléaux et jéjuns, qui seraient préjudiciables en cas de blessure.
         REMARQUE : En cas de saignement important, interrompez la procédure et euthanasiez l’animal de manière humaine.
   3. OPTIONNEL : Pour diminuer le risque théorique de collatéraux aux ganglions proches, effectuer une ligature de suture optionnelle avec des sutures simples interrompues le long de la chaîne ganglionnaire (généralement une distale de 1 mm, deux latérales de 1 mm, et une de 1 mm proximale aux deuxième/troisième ganglions) en utilisant une suture en nylon monofilament noir 9-0 et des pinces à pointe fine pour enfoncer l’aiguille (Figure supplémentaire 3B, C).
      1. Notez les voies lymphatiques afférentes, qui se trouvent juste superficielles des faisceaux vasculaires iléaux/jéjunaux (Figure supplémentaire 3B). Prenez soin de garantir des ligatures de suture profondes jusqu’aux lymphatiques et superficielles à grandes structures vasculaires, car les dommages aux faisceaux vasculaires ilés/jéjunaux seraient préjudiciables.
   4. Rétractez doucement les stations lymphatiques ligées céphalées et, à l’aide de ciseaux à pointe fine ou extra-fine, excisez les stations ganglionnaires cibles de la caudad à la céphale.
      REMARQUE : Avant de continuer, assurez-vous que l’intestin grêle reste rose et bien perfusé. La ligature incidentelle des vaisseaux iléaux/jéjunaux entraînera l’intestin grêle ischémique.
4. Quatrième ganglion lymphatique (drainage distal du côlon ; Figure supplémentaire 1E,F')
   1. Éviscérez doucement l’intégralité de l’intestin grêle jusqu’au point de fixation postérieure (ligament de Treitz). Orienter l’intestin extériorisé sur des rideaux humides avec le cécum en bas, le côlon proximal en haut, et l’intestin grêle vers la droite du chirurgien (côté gauche de l’animal ; Figure 1A).
   2. Identifiez la chaîne ganglionnaire mésentérique, qui suit longitudinalement le côlon. La quatrième station se trouve juste à la médiane du côlon distal et latéralement à la troisième station (Figure 1B, Figure 4A).
      1. À l’aide de pinces à pointe fine inclinées ou de ciseaux à point extra-fin, disséquez de manière brutale la quatrième station ganglionnaire loin des vaisseaux du côlon et de l’adipeux environnant en plaçant des pinces/ciseaux fermés dans l’espace entre ces structures et en laissant les pinces s’ouvrir doucement.
      2. Retirez les pinces ou ciseaux et répétez cette manœuvre 2 à 3 fois ou jusqu’à ce qu’un plan suffisant soit créé pour une excision sûre. Évitez les dommages aux principaux vaisseaux sanguins du côlon.
         REMARQUE : En cas de saignement important, interrompez la procédure et euthanasiez l’animal de manière humaine.
   3. OPTIONNEL : Pour diminuer le risque théorique de collatéraux vers les ganglions voisins, effectuez une ligature de suture optionnelle avec des sutures simples interrompues à chaque ganglion lymphatique identifiable (généralement un à 1 mm du ganglion) en utilisant du nylon monofilament noir 9-0 et des pinces à pointe fine pour enfoncer l’aiguille (Figure 4B - D).
   4. Rétractez doucement les stations lymphatiques ligées céphalades et, à l’aide de ciseaux à point extra-fin, excisez la station ganglionnaire cible de la caudad à la céphale (Figure 4D,E).

Figure 4 : Images annotées et commentaires de la lymphadénectomie mésentérique (quatrième station). (A) Une orientation intestinale correcte expose la quatrième station ganglionnaire mésentérique (flèches blanches) médiale au côlon distal et latérale à la troisième station. (B,C) Après une dissection contundente de la station ganglionnaire, une ligature par suture (flèche noire) est réalisée à chaque ganglion identifiable, en veillant à inclure tous les vaisseaux d’alimentation des ganglions lymphatiques (flèches bleues). (D) Le ganglion est excisé le long du plan tissulaire précédemment créé, restant haut vers les ganglions lymphatiques et laissant derrière eux des ligatures de suture (flèches noires). (E) Après excision de la station nodiculaire (flèches blanches), l’hémostasie est confirmée, les ligatures de suture sont visibles (flèches noires), et l’espace vide (flèches estompées) où le nœud vivait auparavant est noté comme étant exempt de nœud résiduel. Barres d’échelle : 0,2 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

4. Complétion de la lymphadénectomie mésentérique

1. Observez les branches distales des vaisseaux iléocoliques, des vaisseaux iléaux et/ou des vaisseaux jéjuns pour vous assurer que l’apport sanguin est intact. L’intestin bien perfusé est vif et rose avec des pulsations visibles.
   1. À l’aide de tige-cotons à bout de coton, réintroduisez le contenu abdominal dans la cavité péritonéale. Veillez à retirer tout fragment de coton, de charpie, de drapé ou de suture des intestins avant le retour, car cela peut entraîner une inflammation chirurgicale supplémentaire.
   2. Assurez-vous que l’intestin n’est pas tordu sur son mésentère en confirmant que l’intestin reste clair/rose (perfusionné) plutôt que terne/gris/violet (ischémique).
2. Injectez 1 mL de solution saline stérile à température corporelle dans l’abdomen juste avant la fermeture pour combler la perte ou l’évaporation insensible de liquides. Fermez l’abdomen en deux couches (paroi abdominale et peau) avec une suture en polypropylène monofilament 6-0 en mode courant.
3. Appliquez de la colle chirurgicale stérile sur la plaie.
   REMARQUE : Sinon, des points de suture interrompus ou des pinces de plaie peuvent être utilisés pour la fermeture de la peau.

5. Soins postopératoires

1. Relocalisez l’animal dans une cage propre, à moitié sur un tapis de circulation à eau chaude avec accès à la nourriture et à l’eau sans hésiter.
2. Laissez l’animal récupérer de l’anesthésie et surveillez de près les signes de détresse. Si les animaux ne se remettent pas rapidement de l’anesthésie avec des comportements appropriés (c’est-à-dire augmentation de la fréquence respiratoire, redressement, déplacement, toilettage), euthanasiez l’animal de manière humaine.
3. Lorsque tous les animaux se sont remis de l’anesthésie, ramenez les cages à l’établissement de soins avec accès à l’eau, à la nourriture, à la literie et aux matériaux d’enrichissement ad libium.
4. Évaluez les souris post-opératoirement toutes les 12 heures pendant 3 jours pour détecter des signes de douleur ou de détresse (c’est-à-dire posture voûtée, diminution de l’activité, diminution de l’engagement, mauvaise toilettage). Euthanasiez humainement les souris présentant des signes de détresse.
5. Si vous utilisez une suture permanente (comme le polypropylène monofilament 6-0), examinez les incisions au jour 10 postopératoires et retirez tout matériau restant pour la suture.

6. Manipulation des ganglions lymphatiques

1. Effectuez immédiatement un test de flottabilité en plaçant le tissu excisé dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL contenant 500 μL de solution physiologique tamponnée phosphate (PBS). Confirmez l’excision des ganglions en observant l’enfoncement des tissus dans le PBS versus un adipeux réséqué accidentellement, qui flottera (Figure 5A).
   REMARQUE : Le(s) poste(s) ganglionnaire(s) excisé sont immédiatement prêtes à entrer en traitement ultérieur.
2. Pour les techniques de cellules vivantes, placez une ou plusieurs stations ganglionnaires excisées dans des milieux de culture cellulaire (par exemple, DMEM, RPMI) ou PBS sur de la glace. Pour l’histologie planifiée, placez la ou les stations ganglionnaires excisées dans un fixateur (par exemple, 10 % de formaline neutre tamponnée, 4 % de paraformoldéhyde).

Résultats

Pour confirmer la précision de cette procédure, des lymphadénectomies mésentériques ont été réalisées sur onze frères de portée C57BL/6J âgés de 4 à 6 semaines, d’âge, de sexe et de génotype appariés. Les temps de procédure variaient de 5 à 15 minutes par souris. Toutes les souris ont bien toléré la procédure, avec une survie périopératoire de 100 %. Des échantillons excisés ont été placés dans PBS sur glace. Tous les échantillons ont immédiatement coulé, confirmant une faible teneur en ...

Discussion

Décrit ici une procédure de survie pour une lymphadénectomie mésentérique murine, sûre et bien tolérée, à chacune des quatre stations ganglionnelles. La principale limitation de cette procédure est la relation indirecte entre l’exposition et la progression des ganglions lymphatiques le long de la chaîne mésentérique. La première station ganglionnaire est facilement et facilement exposée dans son intégralité. La deuxième station ganglionnaire est souvent visible, et l’exposition aux^d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Circuit anesthésique	N’importe lequel		Ou anesthésique injectable
Cytomètre en flux BD LSRII (ou équivalent)	BD Biosciences		Équipé du logiciel FACS Diva (pour la cytométrie en flux) et nbsp ;
Buprénorphine XR	N’importe lequel		Pour l’analgésie
Milieu de culture cellulaire & nbsp ;	N’importe lequel		(pour les techniques de cellules vivantes ; c’est-à-dire DMEM ou RPMI)
DAPI	Biolégende	422801	Concentration de travail : 15 ug/mL
Éthanol (70 % dans l’eau)	N’importe lequel		Pour le nettoyage
CD45.2 (104) conjugué à la souris FITC	Biolégende	109806	Concentration de travail : 5 ug/mL
Pinces : pinces à pointe fine inclinée	Roboz	RS-5058	Matériel : Dumoxel ; Motif #5, angle de 45 degrés ; pointe 0,1 x 0,06mm
Pinces : pinces à pointe fine	Roboz	RS-4960	Matériel : Dumostar ; Modèle #1 ; Pointe : 0,20 x 0,12 mm
Pinces : pinces à pointe fine	Roboz	RS-4966	Matériel : Dumostar, Biologie tip ; Modèle #3 ; Pointe : 0,08 x 0,04 mm
Lidocaïne	N’importe lequel		Pour l’analgésie
Aiguille métallique à gavage	N’importe lequel		Aiguille orale recte réutilisable calibre 20/22, acier inoxydable.
Tourne-aiguilles	Roboz	RS-6410	porte-aiguilles Castroviejo ; Straight
OPTIONNEL :   ;   ;   ; Lampes LED à col de groise doubles ou doubles	N’importe lequel
OPTIONNEL : teinture bleue Evans	Sigma	E2129-10G	Pour un traçage lymphatique optionnel.
OPTIONNEL : Microscope opératoire	Leica	MZ9.5	Microscope stétéo opérateur à tête Leica Mz9.5
Solution physiologique tamponnée phosphate (PBS)	N’importe lequel
Solution de povidone/iode	N’importe lequel		Pour la préparation/stérilisation de la peau
Ciseaux : ciseaux à pointe extra fine	Roboz	RS-5605	McPherson-Vannas ; Tranchant de 3 mm ; courbes (pour les nœuds de la station 3/4)
Ciseaux : ciseaux à pointe fine	Roboz	RS-5650SC	Surecut Castroviejo ciseaux (pour les nœuds station 1/2/3)
Ciseaux : Ciseaux moyens	Roboz	RS-5676	Noyes ; Tranchant de 13 mm ; Droit
Colle chirurgicale	N’importe lequel		Adhésif de tissu 3M Vetbond
Suture : 6-0 polypropylène monofilament bleu	N’importe lequel
Suture : suture nylon monofilament noir 9-0	N’importe lequel		(optionnel) On peut aussi utiliser le 8-0 un peu plus grand Taille de la suture.
Fixateur tissulaire	N’importe lequel		(pour l’histologie programmée ; c’est-à-dire 10 % de formol tampon neutre ou 4 % de paraformaldéhyde)
Bouillotte à circulation d’eau chaude	N’importe lequel