Nous présentons ici une méthode permettant de prélever un grand volume de sang de porcs à l’aide d’une canulation intracardiaque percutanée reliée à une pompe à vide, en tant que procédure terminale.
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Article de méthode
Prélèvement sanguin de grand volume chez le porc pour des applications in vitro : utilisation de la canulation intracardiaque et d’une pompe à vide comme procédure terminale
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le prélèvement sanguin régulier est requis dans de nombreuses études de recherche fondamentale et appliquée. Plusieurs méthodes de prélèvement de sang de porc sont bien décrites. Il s’agit notamment d’utiliser les veines auriculaires pour la collecte de petits volumes sanguins, et les veines jugulaires ou la veine cave crânienne pour la collecte de volumes sanguins plus importants. Certaines expériences nécessitent de grands volumes de sang d’un seul animal à la fois pour l’analyse ou l’utilisation dans des cultures de cellules primaires, ce qui peut être réalisé au mieux par l’exsanguination. Le sang prélevé pour la culture cellulaire primaire doit être fraîchement et soigneusement traité pour maintenir l’intégrité cellulaire. Nous décrivons une méthode de prélèvement aseptique de sang de porcs sous un plan chirurgical d’anesthésie, à l’aide d’un stylet de cathéter intravasculaire de gros calibre inséré percutanéement dans le cœur et d’une pompe à vide, qui est efficace, fournit un rendement élevé et minimise la lyse cellulaire. Cette technique est réalisée une fois sur un animal, à un plan chirurgical d’anesthésie, en tant qu’intervention terminale, offrant un risque minimal de douleur ou de détresse.
Introduction
Les porcs ont été utilisés dans la recherche dans des études allant des études cardiovasculaires à la cicatrisation des plaies et à la toxicologie, ainsi que dans la recherche agricole, l’immunologie et les études de maladies1. Le sang recueilli dans le cadre de la recherche peut être utilisé pour étudier les maladies, la pharmacologie, la génétique, la recherche sur le système immunitaire et la découverte de biomarqueurs. La culture cellulaire est l’une des procédures les plus fondamentales de la recherche et permet aux chercheurs d’étudier le comportement et la fonction cellulaires, ainsi que des modèles de maladies et le développement de vaccins2. La culture d’agents pathogènes pathogènes, tels que le virus de la peste porcine africaine, se fait souvent dans un milieu de culture prédéterminé dans des conditions de laboratoire aseptiques strictes. La propagation de la maladie peut se produire par invasion, propagation ou attachement, ce qui nécessite des cellules saines et stables3. Les agents pathogènes étudiés peuvent avoir un tropisme cellulaire spécifique dans lequel ils peuvent être propagés, et le fait d’avoir un grand volume de sang produit de plus grandes quantités de cellules à utiliser.
Pour obtenir un rendement élevé de cellules d’un animal individuel, pour la différenciation cellulaire, un grand volume de sang doit être délicatement prélevé pour maintenir l’intégrité cellulaire avant la séparation cellulaire. Chez les porcs, le volume sanguin total peut être calculé à 65 mL/kg 4,5. D’après notre expérience avec la collecte de grands volumes, environ la moitié du volume sanguin total d’un animal peut être récupérée. Par conséquent, chez les gros porcs adultes, pesant jusqu’à 600 livres (273 kg), un rendement de 6 à 8 L est possible. Chez les porcs, de grands volumes de sang peuvent être prélevés par voie percutanée dans la veine cave crânienne, la veine jugulaire externe, la veine saphène par canulation ou le cœur 4,5,6. Cependant, le prélèvement sanguin intracardiaque à l’aide d’une canule de grand calibre permet de collecter efficacement le plus grand volume de sang avec un risque minimal de lyse cellulaire. En tant qu’intervention terminale, celle-ci doit être réalisée sous un plan chirurgical d’anesthésie5. Cet article décrit une méthode d’utilisation d’une pompe à vide pour recueillir plusieurs litres de sang de porcs en utilisant une approche percutanée du cœur avec un stylet de cathéter IV de gros calibre connecté à une pompe à vide 7,8.
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Protocole
Cette étude a été approuvée par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de Midwest Veterinary Services Inc. Comme la principale méthode d’euthanasie approuvée par l’IACUC au cours de cette procédure est l’exsanguination, on s’attend à ce que certains porcs atteignent un arrêt cardiaque en raison d’une perte de sang. Lorsque cela se produit, une méthode d’euthanasie secondaire, telle que la thoracotomie bilatérale, est pratiquée. Une fois le volume sanguin requis recueilli, s’il y a un rythme cardiaque palpable, une seringue contenant une solution d’euthanasie est fixée au stylet et administrée par voie intracardiaque comme méthode d’euthanasie primaire, suivie d’une méthode physique secondaire. Les porcs sont entretenus conformément au Guide sur le soin et l’utilisation des animaux d’élevage en recherche et en enseignement, au Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et à la Loi sur le bien-être des animaux, selon le cas.
1. Préparation du matériel et des animaux (Tableau des matériaux et figure 1A-C)
- Assemblez le tube à des pailles en acier inoxydable et fixez l’extrémité du tuyau au tuyau bulle.
- Fixez le tube à la bouteille à roulettes à l’aide d’un bouchon en caoutchouc avec deux pailles métalliques inégales et une bouteille en verre.
REMARQUE : Le verre empêche l’effondrement du récipient créé par la pompe à vide, mais tout matériau qui ne s’effondre pas sous pression peut être utilisé. - Instillez aseptiquement 10 ml d’héparine sodique (1 000 USP/mL) à travers la tubulure d’aspiration et le stylet du cathéter pour prévenir la coagulation. Ajouter aseptiquement 50 ml d’héparine sodique (1 000 USP/mL) dans chaque flacon roulant pour obtenir une concentration finale de 50 UI/mL dans chaque litre de sang et empêcher la coagulation du sang pendant le prélèvement. Assurez-vous que la pompe à vide n’est pas réglée sur plus de 7 livres de tirage pour éviter d’endommager les cellules.
2. Anesthésie et positionnement de l’animal
- Pesez l’animal au plus tard 24 heures avant l’intervention pour calculer la dose requise de l’association de médicaments anesthésiques.
- Injectez du télazol (3,0 à 5,0 mg/kg), de la kétamine (8 à 12 mg / kg) et de la xylazine (4,0 à 6,0 mg / kg) par voie intramusculaire dans le cou ou d’autres gros muscles abdominaux (par exemple les muscles épaxiaux), à l’aide d’un ensemble d’extension de 30 pouces et d’une aiguille de 18 g x 1,5 " pour induire une anesthésie profonde.
REMARQUE : Chez les porcs de grande taille, le volume maximal recommandé d’injection IM est de 10 ml, de sorte qu’il peutêtre nécessaire de changer d’endroit après chaque 10 ml d’administration9. Bien que nous ayons choisi ce cocktail, cette procédure peut être effectuée dans le cadre de n’importe quel protocole d’anesthésie approuvé par l’IACUC qui produit un plan chirurgical d’anesthésie. - Une fois que l’animal est dans un plan chirurgical d’anesthésie (~5-8 min), ne montrant aucun réflexe palpébral, un tonus de la mâchoire lâche et aucune réponse aux stimuli de douleur, placez le porc sur une table élévatrice, un sol ou une autre surface plane, en décubitus latéral droit.
- Coupez les poils du thorax situé au-dessus du cœur, si nécessaire, près du quatrième et du cinquième espace intercostal, juste caudal jusqu’à la pointe du coude.
- Si possible, utilisez une échographie (Figure 2A) pour identifier le ventricule gauche. S’il n’est pas disponible, le ventricule gauche est situé le plus près du quatrième ou du cinquième espace intercostal médial jusqu’au point d’impulsion maximale8.
- Frottez aseptiquement la zone avec des éponges de gaze de 4 pouces x 4 pouces imbibées d’un gommage de chlorhexidine à 2 % et d’éponges de gaze de 4 pouces x 4 pouces imbibées d’alcool isopropylique à 70 %. Préparez la peau en frottant de manière circulaire, en commençant par le point d’injection et en tournant vers l’extérieur, pendant un minimum de 3x, en alternant entre les deux désinfectants.
3. Prélèvement sanguin intracardiaque
- Vérifiez que l’animal est resté dans un plan chirurgical d’anesthésie en vérifiant le réflexe palpébral, le tonus de la mâchoire et le réflexe de la pédale.
REMARQUE : Vérifiez la profondeur de l’anesthésique, ainsi que les fréquences cardiaque et respiratoire, tout au long de la procédure pour vous assurer que l’animal reste à un plan chirurgical de l’anesthésie. - Retirez le stylet du cathéter IV. Placez le stylet sur le ventricule gauche et avancez-le perpendiculairement à la peau pour insérer le stylet dans le ventricule gauche (Figure 2B). Lorsque le sang commence à jaillir du stylet, fixez-le au connecteur d’extrémité du tuyau à bulles qui est fixé au flacon roulant, puis allumez la pompe à vide (Figure 1A et Figure 2C).
- Confirmez que le sang circule en un flux régulier. Lorsque le sang est aspiré dans le flacon roulant, faites tourner doucement le flacon pour permettre le mélange du sang avec l’anticoagulant afin d’éviter la formation de caillots.
- Une fois que 1 L de sang est prélevé, utilisez des hémostatiques pour serrer le tube à bulles près de la bouteille à roulettes. Débranchez le bouchon en caoutchouc et appliquez-le sur la bouteille à roulettes suivante. Retirez l’hémostat et laissez le sang circuler librement tout en faisant tourner doucement le flacon roulant.
- Continuez ce processus jusqu’à ce que le sang requis ait été prélevé. Une fois terminé, clampez le tube pour éviter tout déversement excessif de sang et éteignez la pompe.
- Retirez le connecteur de la tubulure du stylet du cathéter et fixez la seringue de pentobarbital de sodium au stylet. Tirez sur la seringue pour vous assurer qu’un éclair de sang est présent, puis injectez la solution d’euthanasie. Confirmer la mort par l’absence de rythme cardiaque, de respiration, de tonus musculaire et de réflexes. Une fois que la mort est confirmée, retirez l’aiguille du cœur et placez-la dans un contenant pour objets tranchants.
- Jetez le tuyau bulle dans un conteneur à déchets biologiques. Retirez le sang grossier des articles en acier inoxydable restants (par exemple, les pailles en acier inoxydable, les connecteurs d’extrémité de tuyau) à l’aide d’une brosse à tube, puis d’un autoclave pour une utilisation future.
- Placez les bouchons en caoutchouc, les pailles, les raccords d’extrémité de tuyau et les hémostats nettoyés dans un nouveau sachet d’autoclave et stérilisez-les avant la prochaine utilisation.
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Résultats
Avant le prélèvement sanguin, les truies ont été présélectionnées pour Mycoplasma hyopneumoniae, l’adénovirus porcin, le parvovirus porcin, les coronavirus porcins (gastro-entérite transmissible, diarrhée épidémique porcine), l’encéphalomyélite hémoagglutinante porcine, le syndrome reproducteur et respiratoire porcin, le groupe de grippe A, les circovirus 1 et 2 et le virus Seneca A. Nous avons répété cette procédure plusieurs fois chez des truies croisées Yorkshire femelles pes...
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Discussion
La procédure décrite ici décrit un ensemble de type cathéter et pompe à vide pour recueillir un grand volume de sang unique au cœur des truies. En raison du potentiel de douleur et de détresse, cette procédure ne doit être effectuée que chez les animaux qui se trouvent dans un plan chirurgical d’anesthésie. L’immobilité de l’anesthésie permet aux débutants d’apprendre cette procédure et de la maîtriser rapidement. Plusieurs veines peuvent être utilisées pour recueillir le sang des animau...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Nous tenons à remercier tout particulièrement la branche des ressources animales du Plum Island Animal Disease Center, les techniciens en santé animale et les soins aux animaux pour leur excellente assistance technique. Le financement du projet par l’organisme de recherche sous contrat a été fourni par l’USDA, ARS, Animal Resources Unit de la NBAF.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Pompe à membrane modèle laboratoire 1/8 HP & tableau de bord ; 115 V, 60 PSI Max & Nbsp ; | Centre d’approvisionnement de la base & nbsp ; | 80058845 ; | |
| 10 G x 6 pouces cathéter sur aiguille ; ; | Covetrus North American Veterinary Supplies & nbsp ; | 024616 ; | |
| 50 mL seringue, verrou luer & nbsp ; | Fisher Scientific & nbsp ; | 13-689-8 ; | |
| Gel bleu Aquasonic 100 ultrasound & nbsp ; | Approvisionnement vétérinaire du Midwest & nbsp ; | 001.02109.2 ; | |
| Tubulure à bulles argyl, non conductrice (¼ ; ") ; ; | Fisher Scientific & nbsp ; | NC2282605 (Catalogue des fournisseurs # 8888280412) ; | |
| Chlorhexidine Q Scrub 2 % & nbsp ; | Approvisionnement vétérinaire du Midwest & nbsp ; ; | 562.30804.3 ; | |
| Bouteilles à rouleaux jetables Corning. ; | Fisher Scientific & nbsp ; | 06-413 ; | |
| Corning PYREX à bouche étroite, fiole Erlenmeyer ou similaire créant une succion ; | Fisher Scientific & nbsp ; | 10-040F ; | |
| Brosse à éprouvette en nylon Eisco & nbsp ; | Fisher Scientific & nbsp ; | S13962 | |
| Bouchons en caoutchouc à deux trous Fisherbrand & nbsp ; | Fisher Scientific & nbsp ; | Selon la taille et le nbsp ; | |
| Kétamine (10 mg/mL) & nbsp ; | Approvisionnement vétérinaire du Midwest & nbsp ; | 275.22100.3 ; | |
| MLL vers l’extrémité du tuyau de 6 mm (acier inoxydable) & nbsp ; | Cadence Science & nbsp ; | 6547IND ; | |
| MLL vers l’extrémité du tuyau 8 mm (acier inoxydable) & nbsp ; | Cadence Science & nbsp ; | 6549IND ; | |
| MVet gaze éponge non tissée 4 x 4 4 contreplaqué ; ; | Approvisionnement vétérinaire du Midwest & nbsp ; ; | 000.30156.2 ; | |
| MVet alcool isopropylique 70 % ; | Approvisionnement vétérinaire du Midwest & nbsp ; | 000.50054.3 ; | |
| Pinces hémostatiques MVet Kelly droites 5,5" ; | Approvisionnement vétérinaire du Midwest & nbsp ; | 000.36800.2 ; | |
| Héparine sodique (1000 U/mL) & nbsp ; | Approvisionnement vétérinaire du Midwest & nbsp ; | 191.46701.3 ; | |
| Pentobarbital sodique (390 mg/mL) & nbsp ; | Approvisionnement vétérinaire du Midwest & nbsp ; | 749.20000.3 ; ; ; | |
| Pailles en acier inoxydable & nbsp ; | Lobby Hobby ; | 1893635 ; | |
| Télazol (100 mg/mL) & nbsp ; | Approvisionnement vétérinaire du Midwest & nbsp ; ; | 275.40000.3 ; | |
| Xylazine (100 mg/mL) & nbsp ; | Approvisionnement vétérinaire du Midwest & nbsp ; ; | 310.01150.3 ; |
Références
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Réimpressions et autorisations
