Administration endotrachéale non invasive de lipopolysaccharide pour induire une lésion pulmonaire aiguë chez les rongeurs

Résumé

Dans cette étude, une technique d’instillation endotrachéale non invasive a démontré le développement d’AL chez les rats à l’aide d’un laryngoscope basique pour garantir une livraison précise de LPS aux poumons. Le LPS est injecté via un tube endotrachéal à l’aide d’un laryngoscope. L’ampleur de la lésion pulmonaire est évaluée à plusieurs moments.

Résumé

La lésion pulmonaire aiguë (LI) est une affection inflammatoire potentiellement mortelle caractérisée par une hypoxémie artérielle, un œdème alvéolaire, une intégrité de la barrière capillaire épithéliale-endothéliale compromise, suivie d’une infiltration des cellules inflammatoires dans le tissu pulmonaire, évoluant souvent vers une forme plus sévère, le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), qui aboutit souvent à une insuffisance respiratoire aiguë. Les modèles murins ALI, principalement induits par le lipopolysaccharide (LPS), constituent un outil clé dans la recherche visant à comprendre les mécanismes de l’inflammation pulmonaire et ses traitements. Les modèles de lésions pulmonaires directes et indirectes chez les rongeurs offrent des avantages et des limites distincts, notamment en termes de taux de survie, de durée de la phase de résolution de l’inflammation, de risques de traumatisme chirurgical et d’infection. Dans la présente étude, une technique d’instillation endotrachéale non invasive a été utilisée pour développer un modèle d’ALI direct chez les rats. Cette technique garantit une livraison ciblée du LPS ou du matériel de test dans les poumons via la voie endotrachéale à l’aide d’un laryngoscope basique. La procédure commence par l’anesthésiation du rat et son positionnement dans une posture semi-couchée. Par la suite, la solution de LPS est administrée près de l’ouverture trachéale à l’aide d’une seringue fixée à un tube endotrachéal de rat. Au moment de la fin de l’expérience, des échantillons pulmonaires ou de lavage sont prélevés pour évaluer les paramètres inflammatoires et l’architecture pulmonaire. Cette technique surpasse les autres modèles en termes de rapidité, de spécificité et de fiabilité, offrant un ciblage spécifique avec un minimum de dommages tissulaires, un faible risque de mortalité et une inflammation négligeable hors site. Cette méthode est particulièrement précieuse dans les études précliniques sur l’IA, le SDRA et des affections apparentées telles que l’anaphylaxie ou l’arrêt cardiaque. En comparaison, cette méthode s’intègre davantage à des techniques d’imagerie avancées telles que la microscopie intravitale pour surveiller la distribution des médicaments et la progression de la maladie en temps réel.

Introduction

La lésion pulmonaire aiguë (LI) est une affection inflammatoire potentiellement mortelle caractérisée par une hypoxémie artérielle, un œdème pulmonaire, une intégrité endothéliale-épithéliale compromise et une infiltration massive des cellules immunitaires dans les^{poumons 1}. La physiopathologie de l’AL est complexe et implique l’interaction et la perturbation de multiples voies qui se chevauchent et interagissent, telles que la coagulation, les lésions tissulaires, ainsi que l’inflammation pulmonaire et systémique. La suppression rapide de cette réponse inflammatoire est cruciale pour restaurer l’homéostasie tissulaire. Si elle n’est pas traitée, cette maladie qui progresse rapidement évolue fréquemment vers le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), une affection plus grave définie par une hypoxémie réfractaire. La pathogenèse de l’AL a été associée à des lésions pulmonaires et à des dommages ou à la mort des cellules épithéliales alvéolaires et des cellules endothéliales^{microvasculaires} 1,2,3,4.

L’étiologie responsable de l’ALI/SDRA concerne un large éventail d’agents infectieux et non infectieux, provenant à la fois de sources directes et indirectes de lésions^{pulmonaires 5}. Les causes directes incluent la^{pneumonie 6}, quasi-noyade⁷, l’aspiration de contenu^{gastrique 8}, l’inhalation de toxines telles que le gaz^{chloré 9}, l’infection^{bactérienne 10,} et une infection virale telle que le SARS-CoV-2 11,12,13,14. Les causes indirectes proviennent de processus systémiques qui exercent leur influence secondaire sur les poumons, notamment la^{septicémie 15}, le traumatisme¹⁶, la pancréatite¹⁷, une overdose de médicaments et les transfusions^{sanguines 18}.

L’objectif principal de cette méthode est d’établir un modèle reproductible et non invasif d’ALI chez les rongeurs via l’administration endotrachéale d’endotoxine. La raison de développer cette technique découle des limites des méthodes de délivrance conventionnelles. La technique a été démontrée dans le but d’obtenir une livraison directe précise aux alvéoles pulmonaires, de minimiser l’exposition systémique et d’en faire une approche prometteuse pour les futures thérapies pulmonaires ciblées. L’ininstallation intranasale pose plusieurs défis, dont certains peuvent avoir un impact significatif sur les résultats des études, tels qu’une mauvaise ciblisation des régions pulmonaires profondes et la variabilité respiratoire chez^{les animaux 19}. D’autres facteurs, tels que la dose limitée et la possible irritation nasale, sont moins critiques mais peuvent tout de même affecter la régularité. En comparaison, l’administration endotrachéale offre une délivrance plus précise et directe aux voies respiratoires inférieures, assurant une meilleure ciblage pulmonaire et une meilleure uniformité de dosage avec une variabilité minimale entre les animaux, rendant cette voie plus efficace et fiable pour une exposition^{pulmonaire 20}. La voie de l’inhalation est cliniquement pertinente en raison de sa nature non invasive, mais elle est également associée à certaines limitations dans la recherche préclinique, telles que la perte de médicament dans les voies respiratoires supérieures et une efficacité réduite dans le ciblage des régions pulmonaires distales. Ces limitations deviennent plus marquées dans les modèles sévères, y compris les blessures à double impact ou les modèles génétiquement modifiés impliquant des souris knock-in ou knock-out. En revanche, l’administration endotrachéale assure une plus grande régularité pour l’administration directe du médicament aux voies respiratoires inférieures, minimisant la perte et permettant un ciblage efficace dans des modèles précliniques complexes^{également 21}. Une autre voie d’administration pertinente utilisée en recherche préclinique est l’administration intratrachéale invasive. Bien qu’efficace, il est associé au risque de stress chirurgical, d’infection, de variations dans la lecture et de la nécessité de maintenir la température²². En revanche, la méthode endotrachéale offre une alternative fiable et non invasive, ce qui la rend idéale pour les études impliquant des évaluations répétées sur de longues périodes d’observation.

Cette méthode peut être appliquée dans des modèles animaux au-delà de l’ALI, notamment l’asthme, la fibrose pulmonaire, la BPCO, la pneumonie et les maladies pulmonaires infectieuses. Il est également pertinent dans des domaines de recherche préclinique tels que l’anaphylaxie, l’arrêt cardiaque et les arythmies cardiaques. Notamment, la méthode endotrachéale est déjà établie en pratique clinique pour l’administration de certains médicaments, selon l’urgence et le scénario^clinique 23,24,25.

Protocole

Toutes les directives institutionnelles et de la CPCSEA ont été suivies pour les soins et l’utilisation des animaux. Les animaux ont été continuellement surveillés après la procédure afin d’assurer leur bien-être et de se conformer aux directives éthiques animales du CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, Jammu, sous l’approbation du Comité d’éthique animale institutionnelle (IAEC) numéro : 468/87/8/2025. Ce protocole décrit l’instillation endotrachéale non invasive de lipopolysaccharides (LPS) en utilisant la méthode d’administration directe visuelle, comme démontré précédemment, avec quelques améliorations méthodologiques introduites dans la présente^étude 26,27,28. La technique est optimisée pour induire l’AL de manière contrôlée et constante, garantissant des résultats expérimentaux robustes tout en maintenant des normes élevées de soins aux animaux. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation à l’anesthésie et au LPS

1. Mesure du poids animal et calcul de la dose de LPS
   1. Peser chaque animal à l’aide d’une balance calibrée pour calculer la dose précise de LPS. Sélectionnez des rats Wistar pesant entre 140 et 160 g pour l’étude.
   2. Préparez la solution de LPS en diluant le LPS lyophilisé d’Escherichia coli dans une solution saline phosphate tamponnée stérile (PBS) pour atteindre la concentration souhaitée. Une solution LPS fraîchement préparée (5 μg/g de poids corporel)^29,30 est utilisée.
2. Induction de l’anesthésie et moment critique
   1. Anesthésiez les animaux par injection intrapéritonéale d’un cocktail kétamine-xylazine fraîchement préparé (kétamine : 75 mg/kg et xylazine : 10 mg/kg) à l’aide de 1 mL de seringue. Après l’injection, laissez environ 2 à 5 minutes l’anesthésie faire effet, sans déranger les animaux.
   2. Confirmez une anesthésie adéquate en veillant à l’absence de mouvements spontanés et à un réflexe pincé négatif de l’orteil. Le LPS est administré par instillation endotrachéale 5 à 8 minutes après l’induction de l’anesthésie. Le jour de la fin de l’expérience, effectuer des procédures telles que la trachéotomie et la thoracotomie 4 à 7 minutes après l’induction de l’anesthésie.
      REMARQUE : Une profondeur anesthésique appropriée est essentielle pour réussir une installation endotrachéale. La sur-anesthésiation peut supprimer le réflexe nauséeux, tandis qu’une sous-anesthésiation peut provoquer une détresse ou des mouvements pendant la procédure. Utilisez des LPS fraîchement préparés pour maintenir la cohérence entre les expériences. Surveillez les animaux de près pendant et après l’intervention afin d’assurer un bien-être approprié.

2. Instillation endotrachéale de LPS

1. Évaluation de l’adéquation de l’anesthésie : Après l’administration du cocktail anesthésiant, évaluez la profondeur de l’anesthésie en appliquant un stimulus de pincé léger de patte. Après confirmation de l’état d’anesthésie, procéder au protocole d’instillation. Placez la souris en position semi-couchée, suspendue par des incisives sur une plateforme solide de soutien.
2. Visualisation de la trachée : Ouvrez la bouche de l’animal anesthésié, saisissez doucement la langue à l’aide de pinces, puis insérez soigneusement le laryngoscope en l’alignant précisément pour une visualisation optimale de l’ouverture trachéale. Assurez-vous que la lumière est correctement dirigée pour illuminer la région laryngée, facilitant ainsi un accès sans entrave.
3. Manipulation de la langue : Utilisez des pinces courbes à extrémités émoussées pour saisir délicatement la langue et la rétracter délicatement vers le haut et latéralement.
   REMARQUE : Utilisez des loupes portatives pour améliorer la clarté de l’anatomie laryngée et assurer un alignement méticuleux de l’appareil d’instillation pour une précision accrue.
4. Administration du LPS : Prélever 100 μL de solution de LPS dans la seringue et la fixer à un tube endotrachéal de rat de 16 G ; administrez la solution de SPLP près de l’ouverture trachéale. Immédiatement après l’installation, obstruez doucement les narines pendant 2 à 4 secondes à l’aide de pinces émoussées pour favoriser l’aspiration de la solution LPS dans les poumons via la trachée. Surveillez en continu la livraison à l’aide d’un laryngoscope à source lumineuse pour confirmer une administration précise et complète.
5. Surveillance post-procédurale : Repositionner soigneusement la langue à son orientation anatomique normale après une livraison réussie du LPS. Transférez l’animal dans la cage et surveillez de près tout signe de compromission respiratoire ou d’étouffement pendant au moins 1 minute.
6. Considérations clés
   1. Acuité visuelle : Assurez un alignement optimal du laryngoscope pour une livraison précise du LPS. Utilisez des outils de grossissement pour améliorer la précision et l’efficacité.
   2. Saisissez la langue avec précaution et maintenez-la contre la mâchoire inférieure ou le bord de la bouche pour la stabiliser.

3. Collecte d’échantillons

1. Effectuer un lavage bronchoalvéolaire (BAL) comme décrit dans des études antérieures, avec des modifications^mineures 31,32,33. Après la trachéotomie, injectez doucement 2 mL de PBS froid dans les poumons et récupérez le liquide.
2. Centrifugez le fluide collecté à 5000 x g pendant 5 minutes à 4 °C et utilisez le surnageant pour la détection des marqueurs inflammatoires. Collecter les poumons pour un examen histopathologique ou homogénéiser pour l’activité de la myélooperoxydase (MPO). Conservez les échantillons sur la glace pendant la collecte afin de préserver l’intégrité de l’échantillon.

Résultats

Le modèle a été validé en mesurant des marqueurs inflammatoires, notamment les niveaux d’IL-1β, l’activité MPO, la teneur totale en protéines et l’histopathologie à 24 h et 120 h après l’instillation du LPS. L’étude comprenait trois groupes expérimentaux : un groupe témoin (non traité) et deux groupes soumis à une instillation de LPS, l’un étant euthanasié à 24 heures et l’autre à 120 heures (suivant des protocoles institutionnels approuvés).

...

Discussion

La méthode d’instillation endotrachéale offre une approche non invasive, reproductible et ciblée pour l’administration pulmonaire, contournant ainsi ainsi la nécessité d’intervention chirurgicale. Cette méthode réduit considérablement les risques liés aux traumatismes chirurgicaux, tels que les lésions tissulaires, tout en minimisant le risque d’infections post-opératoires et de dommages non intentionnels aux organes pouvant survenir lors de procédures invasives. En administrant directem...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
; Prism 8	Graphpad	https://www.graphpad.com/features
Bradford Reagent   ;	Himedia, Inde	ML106-500 ML  ;   ;   ;   ;   ;
DL-Dithiothréitol	Himedia, Inde & nbsp ;	RM525-25G
Éosine  ;	Loba Chemie, Inde	3660
Acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA)	Loba Chemie, Inde	6381926
Pinces & nbsp ;		-
Formalin 10 %  ;	Sigma Aldrich, USA & nbsp ;	HT501320
Hématoxyline	SDFCL	74108G05
HEPES	Himedia, Inde	MB016
Peroxyde d’hydrogène & nbsp ;   ;	Avra, Inde	7722841
Kétamine  ;	Neon Laboratories Ltd, Inde	-  ;
Laryngoscope	Medical Sources Co., Ltd., Chine & nbsp ;	MS-LA500FV  ;
Lipopolysaccharide d’Escherichia coli O55 :B5  ;   ;   ;   ;   ;	Sigma Aldrich, États-Unis	L2880  ;   ;   ;   ;   ;
o-Diannisidine dihydrochlorure   ;	Sigma Aldrich, États-Unis	D3252-5G  ;
Solution tampon de phosphate (PBS) et nbsp ;	Invitrogen, États-Unis	3002
Orthophosphate de dihydrogène potassique	Himedia, Inde	IN26185530500
Cocktail inhibiteur de protéines	Sigma Aldrich	P8340
Rat IL-1 & bêta ; ELISA Kit & nbsp ;	Thermofisher, États-Unis	BMS630
Chlorure de sodium	Himedia, Inde	TC046M
Fluorure de sodium	Himedia, Inde	GRM7502
Orthovanadate de sodium	Sigma Aldrich, États-Unis	S6508
Sodium Pyrophosphate	Merck, États-Unis	MA3M722243
Acide sulfurique	Sigma Aldrich, États-Unis	339741
Triton X-100	Thermofisher, États-Unis	T8787
Xylazine  ;	Indian Immunologicals Ltd, Inde	-