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Article de méthode

3D Flipwell Engineering pour le développement de systèmes asynchrones pour les thérapies toxicologiques et immunomodulatrices dans les cellules bactériennes, intestinales et immunitaires

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DOI :

10.3791/68701

⸱

17 octobre 2025

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

Dans cet article

Résumé

Cet article fournit un protocole détaillé avec des étapes clés pour guider l’ingénierie et l’utilisation de 3D Flipwell. Nous décrivons et montrons comment assembler les piles d’inserts de co-culture et les utiliser pour co-cultiver des couches stratifiées de bactéries intestinales, d’épithéliums intestinaux et de macrophages afin de modéliser l’environnement de la muqueuse intestinale.

Résumé

Pour étudier les rôles du sécrétome bactérien dans la polarisation des cellules immunitaires et l’homéostasie de la muqueuse intestinale, nous avons développé un modèle de co-culture en 3 dimensions utilisant des inserts disponibles dans le commerce dans un format empilé dos à dos. Nous avons appelé ce système 3D Flipwells, et avons co-cultivé avec succès des bactéries, des cellules épithéliales du côlon et des cellules immunitaires dans des couches stratifiées pour récapituler le microenvironnement de la muqueuse intestinale. Ce système de co-culture permet l’ensemencement de cellules épithéliales du côlon d’un côté de la membrane et de monocytes non adhérents indifférenciés de l’autre, permettant la progression synchrone de la polarisation épithéliale du côlon, de la formation de mucus et de la différenciation et de la polarisation monocytes-macrophages au sein d’une seule co-culture sans qu’il soit nécessaire de détacher et de replaquer des macrophages pré-différenciés. Ce système est facile à construire et ne nécessite que quelques matériaux et outils facilement disponibles. Nous avons testé son utilité en analysant les réponses des composants de co-culture à la sépiaptérine (SEP), le précurseur endogène de BH4 (tétrahydrobioptérine) - un cofacteur de l’oxyde nitrique synthase (NOS). Nous avons démontré que le traitement SEP de 3D Flipwell induisait la formation de biofilms par les bactéries intestinales, la production de mucus par l’épithélium du côlon et la polarisation pro-immunogène des macrophages. Cela indique que la SEP déclenche l’activation d’un mécanisme de défense de la muqueuse par la diaphonie entre différents composants cellulaires. D’autres expériences sont nécessaires pour étudier le rôle des communications muqueuses qui conduisent à la reprogrammation des cellules immunitaires et pour évaluer l’utilité de ce système de co-culture pour dépister de nouvelles thérapies immunomodulatrices.

Introduction

La diaphonie entre les cellules immunitaires et le microbiome intestinal influence grandement l’efficacité des différents traitements contre les maladies. Une telle diaphonie est nettement modifiée par des stimuli externes, y compris, mais sans s’y limiter, les anomalies métaboliques de l’hôte, les changements alimentaires, la manifestation de la maladie et le traitement pharmacologique. Ces changements pourraient entraîner un déséquilibre dans la composition de la microflore, une condition appelée dysbiose 1,2,3.

Pour mieux comprendre les interactions entre les microbes et les cellules immunitaires de l’hôte dans l’intestin, des systèmes de co-culture élaborés ont été développés par différents groupes pour tenter de récapituler l’environnement de la muqueuse intestinale. Du système d’intestin sur puce développé par Kim et al.4 à un assemblage plus complexe à l’aide d’un substrat absorbant spécialisé5, ces systèmes de co-culture ne sont pas simples à construire et sont incapables de retenir tout le spectre des composants sécrétés en raison de leur absorption par le substrat de co-culture. Noël et al. ont donc développé un système alternatif de co-culture pour modéliser la muqueuse intestinale qui est relativement plus facile à fabriquer6. Ce nouveau système utilise un seul insert de culture avec des cellules épithéliales du côlon ensemencées d’un côté de la membrane et des macrophages prédifférenciés de l’autre côté6. Cependant, l’ensemencement de macrophages pré-différenciés nécessite leur pré-différenciation ailleurs, leur dissociation et leur replacage dans une co-culture, affectant potentiellement leur intégrité cellulaire et leur viabilité.

En incorporant des améliorations à ces systèmes précédents, nous avons développé un nouveau système de co-culture multicouche tridimensionnel (3D) que nous avons appelé le système 3D Flipwell 7,8. Ce système est composé d’inserts de culture cellulaire empilés dos à dos, permettant la progression synchrone de la polarisation épithéliale du côlon, de la formation de mucus, de la différenciation des macrophages et de la polarisation au sein d’une seule co-culture. Ce système nous permet d’examiner les changements dans l’environnement de la muqueuse intestinale et les interactions entre les bactéries intestinales, les cellules épithéliales et les cellules immunitaires. De plus, ce système peut être utilisé pour examiner les effets de stimuli externes, y compris les métabolites bactériens, les toxines, les nutriments alimentaires et les produits pharmaceutiques, sur la muqueuse intestinale et le reste du corps 7,8.

En utilisant le nouveau système d’insertion de co-culture, nous avons examiné les réponses de différents composants cellulaires à la sépiaptérine (SEP), le précurseur endogène de BH4 (tétrahydrobioptérine), un cofacteur de l’oxyde nitrique synthase (NOS). Nous avons précédemment montré que SEP exerce des activités pro-immunogènes sur le microenvironnement de la tumeur du sein en reprogrammant les macrophages associés à la tumeur en un type pro-immunogène 9,10,11,12. Nous avons démontré que la SEP induit des événements synchrones de formation de biofilm par les bactéries intestinales, de production de mucus par l’épithélium du côlon et de polarisation pro-immunogène des macrophages dans les co-cultures, indiquant l’activation d’un mécanisme de défense de la muqueuse7. Ces résultats confirment l’utilité de ce nouveau système de co-culture dans la modélisation du microenvironnement de la muqueuse intestinale7.

L’objectif global de ce protocole est de fournir des instructions étape par étape pour la construction de cette nouvelle co-culture de bactéries intestinales, d’épithéliums intestinaux, de mucus et de cellules immunitaires afin de modéliser l’environnement de la muqueuse intestinale. Nous démontrons également comment nous pourrions visualiser la diaphonie de cellules co-cultivées sous l’influence d’un stimulus externe, par exemple, le traitement SEP. D’autres recherches utilisant ce système de co-culture sont nécessaires pour déterminer les composants cellulaires sécrétés qui facilitent les interactions entre différentes cellules en co-culture, ainsi que pour tester l’utilité de ce modèle de co-culture pour le criblage à haut débit de nouveaux traitements. De plus, pour atteindre l’état physiologique de l’environnement de la muqueuse intestinale, ce système de co-culture nécessiterait d’autres modifications. Par exemple, pour co-cultiver des cellules de mammifères aérobies avec des bactéries anaérobies, ces bactéries devraient être cultivées séparément dans des milieux anaérobies qui éliminent l’oxygène ou recouvertes de paraffine liquide qui empêche l’entrée d’oxygène, comme indiqué ailleurs. Une telle utilité et une telle application avancées de ce système de co-culture justifieraient une enquête plus approfondie.

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Protocole

1. 3D Ingénierie Flipwell

  1. Tout le travail doit être effectué à l’intérieur d’une armoire de culture cellulaire. Placez toutes les fournitures à l’intérieur de l’armoire.
  2. Ouvrez le couvercle de la boîte de Pétri et réservez. Ouvrez la lame du scalpel de son boîtier de protection et placez-la sur le bord du fond de la boîte de Pétri. Assurer la stérilité.
    ATTENTION : Une manipulation soigneuse de la lame du scalpel est nécessaire. Utilisez des gants résistants aux coupures et renforcés de fibres pour protéger les mains si nécessaire.
  3. Ouvrez l’emballage de protection stérile de l’insert commercial à 12 puits. Assurer la stérilité. Prenez une pince à épiler stérile. Saisissez doucement l’insert et retirez-le de l’emballage.
  4. Tenez l’insert de manière à ce que son bas soit vers le haut. De l’autre main, prenez la lame de scalpel stérile et amenez-la jusqu’à l’insert.
  5. À l’aide d’un mouvement en forme de C, percez la membrane sur le bord et faites glisser doucement la lame du scalpel autour du bas de l’insert, en restant près de la paroi en plastique.
  6. Découpez la membrane en PET et utilisez la deuxième pince à épiler pour retirer la membrane. Jetez la membrane.
  7. Utilisez la lame du scalpel pour gratter les copeaux de membrane blancs afin de nettoyer le bord et le bord de l’insert. Remettez soigneusement l’insert nouvellement préparé dans son emballage stérile d’origine.
  8. Ensuite, prenez le tube adhésif en silicone et coupez la pointe de la buse avec la lame du scalpel pour faire une ouverture. Cette ouverture doit avoir une largeur de 3 mm.
  9. Testez la taille de la perle en pressant la colle sur l’essuie-tout. La perle doit avoir une épaisseur de 2 à 3 mm. Ajustez la buse si la perle est inférieure à 2 mm et qu’elle est difficile à presser hors du tube.
    1. Une autre façon d’appliquer et d’étaler la perle de colle est d’utiliser une pointe de pipette de 200 μL avec sa pointe coupée. Coupez 3-4 mm avec des ciseaux et utilisez une spatule pour étaler la colle autour du bord de l’insert.
  10. Décollez le couvercle de protection du deuxième insert et mettez-le de côté. Prenez la pince stérile, saisissez le deuxième insert de son emballage avec la membrane vers le haut.
  11. Étalez doucement un mince cordon de silicone de 2 à 3 mm tout autour du fond de l’insert, en faisant attention de ne pas toucher la membrane.
  12. Prenez le deuxième ensemble de pinces stériles et soulevez avec précaution le premier insert (sans la membrane) de son emballage protecteur.
  13. Rapprochez les deux inserts de bas en bas afin que les jantes inférieures s’alignent. L’excès de colle peut être expulsé du joint. Laissez sécher la colle. Il peut être coupé une fois la colle complètement sèche (24-72 h). Ceci est facultatif.
    REMARQUE : La dernière pile d’inserts de co-culture (FCI) de Flipwell ne doit avoir qu’une seule membrane en PET au milieu. Il est préférable d’avoir les poignées en forme de L des inserts commerciaux positionnées de manière à ce qu’elles soient situées à 180° les unes des autres (à 3 et 6 heures). Suivez les recommandations du fabricant de colle silicone pour le temps de séchage, qui peut être de 24 à 72 h selon la marque. Pour la plupart des colles à base de silicone, un temps de séchage de 72 h est préférable. La colle peut également être séchée pendant seulement 24 h avec une stérilisation UV.
  14. Lorsque la pile FCI est collée, placez-la à l’intérieur de l’emballage stérile d’origine pour qu’il sèche ou à l’intérieur d’une boîte de Pétri profonde. Utilisez le couvercle des boîtes de Pétri spécifiées pour couvrir l’ensemble de la pile.
  15. Pour stériliser les assemblages de la pile, ouvrez le couvercle de la boîte de Pétri. À l’aide d’une pince stérile, placez la pile de FCI sur le bord de la boîte de Pétri profonde.
  16. Fermez le châssis en verre de l’armoire BSC. Allumez la lumière UV. Éloignez-vous de l’armoire pour plus de sécurité et stérilisez chaque côté de la membrane 30 min-1 h. Éteignez la lumière UV lorsque chaque cycle de stérilisation est terminé.
  17. Placez le couvercle de la boîte de Pétri (comme spécifié) sur la boîte de Pétri avec les piles d’inserts et mettez-le de côté.

2. Test de fuite avant l’enrobage de collagène

  1. Retirez le couvercle de la boîte de Pétri. Ajouter 500 μL de PBS stérile ou d’eau déminéralisée stérile.
    REMARQUE : À titre d’aide visuelle, DMEM a été utilisé pour aider à visualiser l’intégrité des piles FCI.
  2. Couvrez la boîte de Pétri. Laissez reposer toute la nuit. Vérifiez l’intégrité de la FCI le matin. Jetez les FCI si une fuite est détectée. Faites de nouvelles piles d’inserts au besoin.
  3. Aspirer le liquide (PBS ou eau) utilisé pour l’essai. Couvrez la boîte de Pétri avec un couvercle.
  4. Laisser sécher les piles (1 à 2 h) à l’intérieur de l’ESB. Conservez les ICF dans un BSC jusqu’au moment de les utiliser ou recouvrez-les de collagène pour ensemencer les cellules adhérentes.

3. Revêtement en collagène de la membrane Flipwell

  1. Préparez une quantité provisoire de la solution de collagène en diluant la solution de collagène fournie à 3 mg/mL à une dilution 1:30 à 100 μg/mL. Ajouter 33 μL de solution de collagène fabriquée dans le commerce à 1 mL d’eau déminéralisée stérile dans un tube de microcentrifugation. Mélanger par vortex.
    REMARQUE : Pour un volume plus important, augmentez et utilisez un tube conique de 15 ml en fonction du nombre d’empilements d’inserts à revêtir des deux côtés de la membrane. Faites-le frais à chaque fois. Ne réutilisez pas le stock de travail.
  2. Ouvrez le couvercle de la boîte de Pétri. Laissez le Flipwell pendre du bord de la boîte de Pétri. Ajoutez délicatement 200 μL de solution de collagène sur un côté de la pile d’inserts.
  3. Laissez reposer 1 h. Aspirez la solution de collagène. Ajouter 200 μL de PBS stérile. Aspirer PBS.
  4. Couvrez la boîte de Pétri avec un couvercle et laissez sécher la membrane pendant 60 min à l’intérieur de l’armoire. Lorsque la membrane est sèche, prenez la pince/pince à épiler stérile et retournez le Flipwell du côté opposé et laissez-le pendre du bord de la boîte de Pétri.
  5. Ajoutez 200 μL de solution de collagène sur la face non enrobée (maintenant supérieure) de la membrane. Laissez reposer 1 h.
  6. Aspirez la solution de collagène. Ajouter 200 μL de PBS stérile. Aspirer PBS. Couvrez la boîte de Pétri avec un couvercle et laissez sécher la membrane pendant 60 min à l’intérieur de l’armoire. Laissez la pile FCI sécher pendant la nuit ou grainez le même jour.
    REMARQUE : L’intégrité du revêtement de collagène n’a pas été testée dans de longues conditions de stockage. Une fois que les Flipwells sont pré-enduits, ils doivent être utilisés dans les 24 heures.

4. Construction d’insert bactérien pour les cultures bactériennes

  1. Placez deux ensembles de pinces stériles et les inserts à 24 puits à l’intérieur de l’ESB. Ouvrez soigneusement les inserts et laissez-les à l’intérieur de leur emballage stérile.
  2. À l’aide d’une pince à épiler stérile, soulevez l’insert de son emballage stérile. Avec la deuxième pince à épiler/pince, cassez les petits pieds en plastique au bas de l’insert.
  3. Testez l’insert à 24 puits en l’insérant dans l’une des piles stériles de l’ICF ou dans l’insert original à 12 puits.
  4. Si l’insert ne glisse pas dans le puits, utilisez à nouveau une pince à épiler pour casser plus de matière plastique de la jante à l’endroit où la jante et les pieds se rencontrent.
  5. Testez à nouveau l’ajustement jusqu’à ce que l’insert à 24 puits puisse glisser à l’intérieur du puits à insert à 12 puits. Placez l’insert soit à l’intérieur de son emballage stérile, soit à l’intérieur d’une boîte de Pétri stérile.
  6. Stérilisez par UV ou à l’éthanol l’insert (facultatif). Couvrez l’emballage ou couvrez avec le couvercle de la boîte de Pétri jusqu’au moment de l’utiliser.

5. Construction de l’aiguille

  1. Apportez les outils et toutes les fournitures à l’intérieur d’une BSC. Tenez soigneusement une aiguille avec la pince à nez.
  2. Mesurez l’emplacement de chaque pli sur l’aiguille à l’aide d’une règle. Avec le deuxième jeu de pinces à nez, saisissez l’aiguille à l’endroit choisi et pliez l’aiguille.
  3. Créez le deuxième pli. Pour tordre l’aiguille, saisissez l’aiguille avec une pince à la base et au coude en forme de U et tournez-la dans la direction opposée pour créer une torsion de 4 à 5 mm. Cette étape est essentielle pour insérer facilement l’aiguille à l’intérieur du Flipwell pour l’élimination des bulles d’air.
  4. Fixez l’aiguille sur une seringue stérile de 3 ou 5 mm. Stérilisez l’aiguille et la base de la seringue dans 20 ml d’éthanol à 70 % à 95 % à l’intérieur d’un tube conique de 50 ml.
  5. Tirez l’éthanol à travers l’aiguille et la seringue pour vous assurer que l’aiguille et la base de la seringue sont stérilisées.
  6. Retirez la seringue et l’aiguille du tube conique avec de l’éthanol et laissez sécher à l’air libre en les posant sur une boîte de Pétri. Purgez l’aiguille à l’air libre pour qu’elle sèche et laissez-la sécher pendant quelques minutes.

6. Ensemencement des lignées cellulaires de l’épithélium du côlon Caco-2 :HT29-MTX-E12

  1. Commencer à cultiver les lignées cellulaires Caco-2 et HT29-MTX 2 à 3 semaines avant l’expérience dans des boîtes séparées de 100 mm recouvertes de TC dans leurs milieux de croissance respectifs.
    1. Pour le milieu HT-29-MTX, utilisez 440 ml de DMEM à haute teneur en glucose (4,5 g/L) et un milieu Glutamax à 1 % (v :v) avec 50 ml de FBS inactivé à 10 % (v :v), 5 mL de 1 % (v :v) Pen Strep et 5 mL de HEPES 10 mM de concentration finale.
    2. Pour le milieu Caco-2, utilisez 440 ml de DMEM à haute teneur en glucose (4,5 g/L) et un milieu Glutamax à 1 % (v :v) avec 50 ml de FBS inactivé à 10 % (v :v), 5 ml de 1 % (v :v) Pen Strep et 5 ml d’acides aminés non essentiels.
      REMARQUE : Déterminer la densité d’ensemencement de la lignée cellulaire Caco-2 à l’aide de puits de plaque à 12 puits recouverts de culture tissulaire. Calculer le nombre de jours jusqu’à 100 % de confluence en fonction de la densité de semis de départ. Nous fournissons une densité d’ensemencement à titre indicatif ; cependant, cela variera en fonction de la formulation du milieu de croissance, du fournisseur et du FBS utilisé. Cette étape est essentielle pour garantir une monocouche pour le côté épithélial intestinal du Flipwell après que les cellules THP-1 ont été mises en plaques et que des traitements bactériens/SEP ont été effectués.
  2. Pour passer les cellules Caco-2 et HT-29, aspirez le milieu de culture. Laver avec 10 mL de PBS.
  3. Trypsinisez les cellules en ajoutant 2 ml de Trypsine-EDTA à 0,25 %. Incuber 5 à 10 min à 37 °C avec 5 % de CO2.
  4. Ajouter 7 mL de milieu de croissance approprié à la cellule dans les plaques. Transférer les cellules dans des tubes coniques stériles séparés de 15 ml.
  5. Granulé par centrifugation pendant 5 min à 500 x g à température ambiante. Aspirez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire.
  6. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de média HT-29 préchauffé à base de DMEM. Comptez les cellules à l’aide d’un hémacytomètre ou d’un compteur de cellules.
  7. Combinez les deux types de cellules Caco-2 :HT-29 avec un rapport de 9:1 dans un nouveau tube conique de 15 ml ou 50 ml, selon le nombre de cellules nécessaires pour le nombre souhaité de Flipwells.
  8. Utilisez des Flipwells pré-enduits de collagène pour les étapes ci-dessous. Accrochez les piles FCI pré-enrobées de collagène au bord de la boîte de Pétri profonde.
  9. Graine de 500 μL de 7,5 x 104 cellules par cm2 (2,6 x 105 cellules /12 puits insérés) par face apicale de Flipwell. Calculez le nombre de cellules de départ en fonction du nombre de piles utilisées. Cela inclura les deux types de cellules dans un rapport de 9:1.
  10. Couvrez les assemblages avec un couvercle de boîte de Pétri. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant la nuit jusqu’à ce que les cellules se fixent. Les cellules commencent à produire du mucus environ 7 à 10 jours en culture. Changez de média tous les deux jours pour maintenir les cultures.
    REMARQUE : Le nombre total de jours de culture avec des traitements doit être calculé à l’avance. Le retournement et la densité de semis initiale dépendront de cette durée.

7. Retournement du Flipwell 3D en préparation de l’ensemencement des cellules THP-1

  1. Lorsque les cellules Caco-2 :HT-29 se fixent et commencent à proliférer (la confluence exacte doit être estimée en fonction du milieu/FBS utilisé et de la durée de la culture) mais ne sont pas à 100 % de confluence, retournez le Flipwell pour ensemencer les cellules THP-1 de l’autre côté de la membrane.
    REMARQUE : Les cellules THP-1 doivent avoir été développées dans une culture distincte à ce stade, et le nombre exact de cellules nécessaires sera estimé en fonction du nombre d’empilements FCI utilisés.
  2. Ouvrez le couvercle de la boîte de Pétri et aspirez le support DMEM du côté apical (épithélial intestinal) de la pile FCI.
  3. À l’aide d’une pince stérile, saisissez le Flipwell avec précaution par le crochet et faites-le pivoter à 180°. Avec la deuxième paire de pinces stériles, saisissez la pile FCI par l’autre crochet qui est maintenant tourné vers le haut.
  4. Abaissez l’ensemble dans la boîte de Pétri et accrochez le crochet sur le bord de la boîte de Pétri. Si vous n’êtes pas prêt à ensemencer les cellules THP-1, ajoutez suffisamment de milieu dans la boîte de Pétri profonde pour amener le niveau du milieu vers le haut et juste vers le haut de la membrane.
    REMARQUE : Le Flipwell doit être stable dans cette position, et l’ensemencement avec des cellules THP-1 et l’ajout de milieux doit être envisagé dès maintenant. Ces étapes se font rapidement. Les cellules THP-1 doivent être comptées et prêtes à être plaquées. Les cellules THP1 ont été ensemencées en premier pour alourdir la pile FCI afin d’obtenir une plus grande stabilité et un poids final. Le média DMEM a ensuite été ajouté à la boîte de Pétri profonde pour amener le niveau du média jusqu’à la face inférieure de la membrane. L’aiguille sur mesure a ensuite été utilisée pour retirer la bulle d’air, ce qui a stabilisé davantage la pile FCI et permis les derniers ajustements de volume.
  5. Utilisez l’aiguille pour retirer la bulle d’air comme décrit à l’étape suivante.

8. Élimination des bulles d’air

  1. Préstérilisez l’aiguille et la seringue dans de l’éthanol et séchez-les à l’air libre avant utilisation (voir étape 5). Plongez le piston de la seringue.
  2. Tenez la pile FCI par le bras avec une pince stérile. Abaissez soigneusement l’aiguille dans et sous l’ensemble d’insertion et placez très doucement la pointe souple de l’aiguille de gavage jusqu’à la bulle d’air.
  3. Tirez doucement et très lentement le piston de la seringue vers le haut et regardez la bulle d’air disparaître lentement. Arrêtez-vous lorsque la bulle d’air a un diamètre d’environ 2 mm, ce qui est suffisant pour conserver une bonne couverture DMEM pour les cellules épithéliales du côlon.
  4. Retirez délicatement l’aiguille et la seringue du Flipwell. Passez à l’autre assemblage de l’insert dans la boîte de Pétri profonde.

9. Ensemencement THP-1 et traitement PMA

  1. Préparez le milieu THP1 avec 420 ml de milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640, 50 ml de FBS inactivé à 10 % (v :v), 5 mL de Glutamax 1 % (v :v), 5 mL de HEPES (concentration finale de 10 mM), 11 mL de glucose (concentration finale de 4,5 g/L) et 5 mL de Pen-Strep (1 % v :v).
    REMARQUE : Les cellules THP-1 doivent être cultivées dans un milieu de culture à base de RPMI pendant plusieurs jours avant d’être ensemencées dans les inserts. Effectuez des calculs de comptage cellulaire avant l’ensemencement et augmentez l’échelle en fonction du nombre de piles FCI à utiliser.
  2. Préparez la suspension cellulaire sur la base d’un volume de 500 μL et à raison de0,5 x 10 6 cellules par 500 μL de milieu THP-1. Si le PMA doit être utilisé pour la différenciation et la polarisation, ajoutez-le au milieu RPMI à 100 ng/μL.
    1. Pour faire de la PMA, reconstituez 5 mg d’acétate de myristate de phorbol (PMA) dans 1 mL de DMSO pour obtenir une solution mère de 5 mg/mL. Mélanger par vortex. Effectuer l’aliquote dans des tubes de microcentrifugation à 20 μL chacun et les conserver à -20 °C.
    2. Pour utiliser le PMA, faire une pâte de travail à 50 μg/mL en diluant 1 μL de 5 mg/mL dans 99 μL (1:100) de milieu de croissance complet. Ajouter 1 μL de matériau de travail à 500 μL de fluide, ou 20 μL de matériau de travail à 10 mL de support.
  3. Centrifuger les cellules THP-1 à 94 x g pendant 5 min à RT à granuler. Remettre en suspension dans 5 à 10 ml de support RPMI. Comptez les cellules THP-1 avec la méthode de comptage de votre choix.
  4. Centrifuger à nouveau à 94 x g pendant 5 min à RT. Remettre en suspension à 0,5 x 106 cellules par 500 μL de milieu THP-1.
  5. Ajouter 500 μL de suspension de cellules THP-1 sur la face apicale de la pile d’inserts de co-culture. Ajustez le média HT-29 pour les cellules épithéliales du côlon en ajoutant du milieu dans la boîte de Pétri du puits profond.
  6. Retirez la bulle d’air avec une aiguille à gavage comme indiqué à l’étape 8, si nécessaire. Cultivez les deux types de cellules dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C, 5 % de CO2, 100 % d’humidité jusqu’à ce que les cellules THP-1 se fixent (pendant la nuit) et prolifèrent pendant 1 à 2 jours.
  7. Préparez-vous à faire des traitements avec SEP ou d’autres médicaments ou préparez-vous à des inserts bactériens (voir étape 4). Commencez à cultiver des bactéries 1 jour avant le prochain retournement de pile FCI.

10. Deuxième Flipwell Flip et élimination des bulles d’air pour les inserts SEP et bactériens

  1. Ouvrez le couvercle de la boîte de Pétri. Aspirer le média RPMI du côté apical. Tenez le Flipwell par le bras à l’aide d’une pince à épiler stérile et soulevez la pile.
  2. Faites pivoter la pile à l’envers. À l’aide de la deuxième pince à épiler, tenez l’ensemble de pile sur le bras disponible.
  3. Abaissez la pile dans une nouvelle boîte de Pétri stérile et suspendez-la au-dessus du bord. Ajoutez 500 μL de média DMEM à la face épithéliale épithéliale intestinale.
  4. Ajoutez suffisamment de média RPMI dans la boîte de Pétri profonde jusqu’à ce que le média soit juste au sommet de la membrane. Le volume de l’IPRP a été estimé à environ 40 à 55 ml, mais il changera en fonction du nombre de piles de FCI utilisées par boîte de Pétri profonde.
  5. Retirez la bulle d’air à l’aide de l’étape 8 en laissant une bulle de 2-3 mm. Ajustez le support RPMI si nécessaire. Couvrez l’assiette.
  6. Culture jusqu’à ce que les cellules épithéliales du côlon commencent à produire du mucus. Changez partiellement de support tous les deux jours.
    REMARQUE : Si les cellules épithéliales du côlon ont été cultivées assez longtemps et ont déjà produit du mucus, elles peuvent procéder à l’insertion bactérienne ou aux traitements. Ne laissez pas le fluide dans le compartiment inférieur passer sous la membrane inférieure de l’insert. Ajoutez plus de média DMEM pour maintenir le niveau de média au niveau de la membrane. La méthode idéale pour changer de média est de retirer la moitié du média du compartiment basolatéral et de laisser un petit volume de média dans le compartiment apical pour éviter les infiltrations d’air.
  7. Pour les traitements SEP, ajouter SEP à la concentration finale de 100 μM dans les puits à ce moment si la culture bactérienne n’est pas utilisée. Si une culture bactérienne et un insert sont utilisés, ajoutez SEP à la culture bactérienne. Pour la culture bactérienne, voir l’étape 11.
    1. Pour faire de la SEP, ajoutez 100 mg de L-Sépiaptérine à 84,3 mL de DMSO et mélangez par vortex. Aliquote dans des tubes de microcentrifugation à 100 μL chacun. Conserver à -20 °C. Utiliser des aliquotes SEP à raison de 1 μL par 500 μL de milieu par insert (concentration finale de 100 μM).

11. Démarrage de la culture bactérienne (facultatif)

  1. Pour étudier l’effet des métabolites bactériens sur les cellules immunitaires, le mucus et l’épithélium du côlon, ajoutez un insert bactérien sur le côté apical de l’ensemble d’insert. Pour la construction d’inserts bactériens, suivez l’étape 4. Nous avons cultivé Bacillus subtilis la veille de l’utilisation de l’insert bactérien.
  2. Fabriquez et autoclavez le Miller LB 2 jours avant l’utilisation de l’insert bactérien. Pour faire de la LB, mélangez 6,25 g de Miller LB avec 250 ml d’eau déminéralisée dans une fiole en verre de 500 ml. Couvrir de papier d’aluminium. Autoclave, refroidissement à RT. Peut stocker le LB stérile à 4 °C ou RT.
  3. Commencez à cultiver des bactéries Bacillus subtilis à partir de glycérol la veille de l’utilisation de l’insert bactérien.
  4. Pour commencer la culture bactérienne, inoculer 10 mL de Miller LB avec Bacillus subtilis à partir d’un stock de glycérol congelé à l’intérieur d’un tube conique stérile de 50 mL. Ne laissez pas le bouillon de glycérol décongeler.
  5. À l’aide d’une pointe stérile de 200 μL, prélevez une petite quantité de bactéries dans le stock de glycérol. Éjectez l’embout dans 10 mL de LB dans le tube conique stérile de 50 mL.
  6. Si vous utilisez le SEP, commencer le traitement avec 20 μL de stock SEP (la concentration finale doit être de 100 μM). Ajouter directement à la culture bactérienne de 10 mL dans la culture de démarreur en tube conique de 50 mL.
  7. Culture de Bacillus subtilis pendant 8 h dans un incubateur agitateur à 220 tr/min et 37 °C. Ajouter le deuxième traitement de SEP à la fin de la journée - ajouter 20 μL de SEP à la concentration finale de 100 μM à 10 mL de LB avec des bactéries.
  8. Culture toute la nuit à 220 tr/min, 37 °C. Ajouter le troisième traitement de 20 μL de SEP à 10 mL de LB avec Bacillus subtilis le lendemain matin et continuer à agiter jusqu’au moment de faire les inserts bactériens.

12. Ajout d’un insert bactérien au Flipwell (facultatif)

  1. Effectuez la construction de l’insert bactérien comme décrit à l’étape 4. Effectuer la culture bactérienne comme décrit à l’étape 11.
    REMARQUE : Si une armoire de culture cellulaire séparée est disponible, cela fonctionnera mieux. Sinon, divisez en deux la zone de travail à l’intérieur d’une armoire de culture cellulaire. Séparez les cultures bactériennes et cellulaires. Les cultures cellulaires ne doivent pas être renvoyées dans l’incubateur de culture cellulaire. L’ESB devra être stérilisée et exposée aux rayons UV pendant 24 heures ou plus après l’exécution de cette méthode.
  2. Utilisez deux paires de pinces stériles pour les étapes ci-dessous. Toutes les étapes ci-dessous doivent être effectuées dans le BSC.
  3. À l’aide d’une pince, soulevez l’insert stérile à 24 puits préfabriqué de son emballage. Placez l’insert dans une boîte de Pétri stérile et couvrez le couvercle.
  4. Répétez l’opération pour le nombre d’inserts bactériens nécessaires. Transférez la boîte de Pétri avec les Flipwells de l’incubateur dans le BSC et mettez-la de côté opposé avec des inserts bactériens.
  5. Retirez 300 μL du média DMEM de la face apicale (supérieure) du Flipwell pour permettre l’insertion bactérienne. Laissez environ 200 μL dans la face supérieure de la pile FCI. Placez le couvercle de la boîte de Pétri sur les inserts.
  6. Ajouter 50 à 100 μL de culture de B. subtilis dans les inserts bactériens à 24 puits. Veillez à ne pas renverser ou contaminer la paroi extérieure et le bord de l’insert bactérien. OD600 peut être utilisé pour surveiller la phase de croissance de la culture.
  7. À l’aide d’une pince stérile, soulevez l’insert bactérien avec culture et insérez-le soigneusement à l’intérieur de la face supérieure du Flipwell. Faites pivoter le bras et suspendez-le au bord de la pile FCI. Tenez la pile avec le deuxième ensemble de pinces stériles.
  8. Répétez l’opération pour le reste des piles FCI. Couvrez la boîte de Pétri et laissez reposer à l’intérieur du BSC 3 h. Ne pas rentrer à l’intérieur de l’incubateur.
  9. Après 3 h, utilisez une pince stérile pour retirer l’insert bactérien du Flipwell. Répétez l’opération pour le reste des assemblages d’inserts. Jetez les inserts bactériens.
    REMARQUE : Jetez les bactéries et les inserts bactériens conformément aux politiques d’élimination des déchets biologiques dangereux de l’établissement et aux directives de sécurité et de santé. Les composants bactériens ou les bactéries elles-mêmes n’ont pas été examinés.
  10. Pour analyser les modifications des compartiments cellulaires muqueux, épithéliales et immunitaires, procédez au lavage des membranes et à leur préparation pour l’imagerie.
  11. Aspirez le support DMEM du haut du Flipwell. Laver avec 500 μL de PBS stérile. À l’aide d’une pince, soulevez la pile FCI de la boîte de Pétri et transférez-la dans une nouvelle boîte de Pétri.
  12. Retournez le Flipwell et accrochez-le sur le bord de la boîte de Pétri. Laver la membrane avec 500 μL de PBS stérile.
  13. Si un entreposage est nécessaire, stocker les piles FCI à court terme (30 minutes toute la nuit) dans du PBS stérile à l’intérieur d’un tube conique de 50 ml.
    REMARQUE : Il est important de déterminer quelle méthode d’imagerie sera utilisée ensuite et si la membrane sera coupée en deux pour la microscopie électronique et le marquage par anticorps fluorescents.

13. Démontage du Flipwell pour la microscopie électronique à balayage (MEB)

REMARQUE : Pour examiner les changements morphologiques dans les cellules épithéliales du côlon et les macrophages après des traitements SEP/bactériens, nous avons fixé les membranes dans un tampon de fixation, puis nous avons démonté les Flipwells pour la microscopie électronique à balayage (MEB). Le PFA a été utilisé comme fixateur ; Cependant, le glutaraldéhyde peut également être utilisé. Il est important de consulter le noyau de microscopie au sujet du tampon de fixation qu’il préfère, des étapes de déshydratation spécifiques et des concentrations initiales du tampon de fixation. Les membranes peuvent être stockées dans le tampon de fixation si un stockage est nécessaire. Le travail peut être effectué à l’extérieur de la BSC. Si le noyau d’imagerie colle la membrane, elle peut être coupée en deux et positionnée pour imager les deux côtés séparément.

  1. À l’aide d’un marqueur résistant aux solvants, étiquetez les côtés en plastique de la pile FCI avec un symbole codant pour le type de cellule utilisé. Vous pouvez également étiqueter la membrane directement à l’aide d’un point, d’une coche ou d’un x pour indiquer le type de cellule utilisé.
  2. Placez le Flipwell à l’intérieur d’un tube conique de 50 ml sans le démonter. Ajoutez 4 % de PFA suffisamment pour immerger la pile. Conserver 4 % de PFA pendant la nuit.
    1. Pour obtenir 4 % de PFA (sans méthanol), dissoudre 40 g de paraformaldéhyde dans 800 ml de 1x PBS. Pour obtenir 0,4 % de PFA, dissoudre 4 g de paraformaldéhyde dans 800 mL de 1x PBS ou diluer 4 % de PFA 1:10 avec 1x PBS en ajoutant 100 mL de 4 % de PFA à 900 mL de 1x PBS.
  3. Remplacez le PFA par 0,4 % pour un stockage plus long. Consultez le noyau de microscopie pour connaître la durée de stockage et les tampons.
  4. Pour démonter le Flipwell, tenez-le à deux mains et dévissez chaque partie collée de la pile. La pile se démontera en deux parties : une partie aura la membrane et l’autre sera l’insert sans la membrane. Jetez l’insert sans la membrane.
  5. Faites pivoter l’insert avec la membrane et posez-le avec la membrane vers le haut. Peut étiqueter la membrane avec un petit point ou un x sur le bord de la membrane pour savoir quel côté a quel type de cellule.
  6. Tenez l’insert par le mur à l’aide d’une pince. Découpez soigneusement la membrane à l’aide d’une lame de scalpel et placez-la dans un tube de 1,7 ml ou une petite bouteille en verre contenant 500 μL-1 mL de solution de PFA à 0,4 %-4 %.
  7. Soumettre à la carotte de microscopie pour les étapes de déshydratation et d’imagerie. Les étapes de déshydratation sont décrites dans Beamer et al7.
  8. Jetez le PFA ou d’autres fixateurs conformément aux politiques d’élimination des déchets dangereux et aux directives de santé et de sécurité de l’organisation.

14. Méthode de grosses gouttelettes pour démonter le Flipwell pour la microscopie confocale

REMARQUE : Une nouvelle méthode a été créée pour colorer et imager les membranes. La pile d’inserts de co-culture a été maintenue intacte avec les étapes initiales de fixation, de perméabilisation et de blocage effectuées à l’intérieur d’un tube conique de 50 ml. Le marquage immunofluorescent et la microscopie confocale ont été utilisés pour imager les deux côtés de la membrane. La méthode de la plaque à 12 puits a été utilisée pour les étapes d’incubation de nuit, et une méthode de grosses gouttelettes a été utilisée pour colorer le fond de l’insert démonté. L’empilement Z confocal a été utilisé pour imager les deux côtés avec la membrane. Les membranes colorées ont été prises en sandwich entre deux lamelles de verre circulaires, et l’ensemble en sandwich a été placé au milieu entre deux anneaux métalliques de la chambre ronde fabriquée dans le commerce pour imager. Le microscope confocal à balayage laser multiphoton a été utilisé avec un logiciel d’imagerie commercial.

  1. Pour laver la membrane, placez la pile d’inserts de coculture directement dans un tube conique de 50 ml et ajoutez 15 ml de PBS stérile ou lavez chaque côté séparément (décrit ci-dessous).
  2. Aspirez le DMEM et ajoutez 300 μL de PBS stérile sur le côté apical. Aspirez le PBS et retirez délicatement la pile de la boîte de Pétri.
  3. Retournez le Flipwell et ajoutez 300 μL de PBS au RPMI maintenant orienté vers le haut de la pile FCI. Aspirer le PBS.
  4. À l’aide d’un marqueur résistant aux solvants, étiquetez le haut et le bas de la pile pour savoir quel côté a quel type de cellule.
  5. Placez le Flipwell à l’intérieur d’un tube conique stérile de 50 ml. Ajouter 15 mL de PFA stérile à 4 % comme tampon de fixation initial pendant 10 min. Si une incubation d’une nuit est nécessaire, remplacer par 15 mL de PFA à 0,4 % dans du PBS, couvrir et laisser reposer toute la nuit.
  6. Pour procéder à l’immunomarquage, prévoyez un espace de paillasse pour la méthode des grosses gouttelettes.
    Déchirez des morceaux de pellicule plastique de 10 x 14 pouces et collez-les sur le banc aux coins pour créer une surface lisse.
  7. À l’aide d’une pipette de 200 μL, créez une grosse gouttelette avec 200 μL de PBS. Dévissez l’ensemble d’insertion pour qu’il se sépare dans les inserts.
  8. À l’aide d’un marqueur résistant aux solvants, placez un petit point près du bord d’un côté de la membrane pour savoir quel type de cellule est utilisé pour la coloration et l’imagerie.
  9. Retirez tout joint en silicone résiduel du fond de l’insert si l’insert avec la membrane a encore des résidus de colle. Ceci est fait pour s’assurer que l’insert restera droit pour les étapes ci-dessous.
  10. Positionnez soigneusement la pile FCI (avec des cellules THP-1) au-dessus de la grande goutte de 200 μL de PBS. Ajouter 200 μL de tampon de perméabilisation sur la face supérieure avec les cellules épithéliales du côlon et conserver pendant 10 min.
    1. Pour préparer le tampon de perméabilisation, utilisez du Triton-X100 à 0,1 % v/v dans PBS.
  11. Aspirer et ajouter 200 μL de PBS. Répétez ce lavage 2 fois. Créez une nouvelle gouttelette avec 250 μL de tampon de blocage.
    1. Pour faire un tampon de blocage, ajoutez 250 μL de sérum de chèvre normal dans 5 ml de 1x PBS (sérum final à 5 %). Ajouter 15 μL de Triton-X100 (0,3 % v :v final). Bien mélanger et conserver à 4 °C pendant 1 à 2 jours.
  12. Placez l’insert sur le dessus du tampon de blocage. Bloquer pendant 30 min à température ambiante. Aspirez le PBS par le côté apical et ajoutez 200 μL de tampon de blocage en haut de l’insert. Les deux côtés de la membrane sont maintenant prêts pour la coloration des anticorps pendant la nuit.

15. Coloration immunofluorescente (IF)

REMARQUE : La coloration se fait pendant la nuit à l’aide d’une méthode de plaque à 12 puits ou sur un banc à l’aide d’une méthode de grosses gouttelettes.

  1. Préparez les anticorps nécessaires à utiliser pour colorer les deux côtés de la membrane pendant la nuit à 4 °C ou sur la paillasse à RT. Diluez tous les anticorps 1:100 dans 1 % BSA dans PBS. Vous pouvez également suivre les recommandations du fabricant et optimiser la coloration pour déterminer les concentrations idéales et le tampon de dilution des anticorps.
  2. Méthode des grosses gouttelettes
    1. Créez un grand rectangle à l’aide d’une pellicule plastique sur le dessus du banc et collez les coins vers le bas. Pipette de 200 μL d’anticorps dilués sur le plastique pour créer une grosse gouttelette. Placez la membrane d’insertion sur la grosse gouttelette.
    2. Ajoutez 200 μL d’Ab primaire dans le haut de l’insert. Incuber à RT pendant 2 h.
  3. Méthode de la plaque à 12 puits
    1. Si vous utilisez une méthode sur plaque à 12 puits pendant la nuit, ajoutez 300 μL d’anticorps primaire dans le haut de l’insert.
    2. Ajoutez 300 μL d’anticorps primaire dans le puits de la plaque à 12 puits. Placez l’insert à l’intérieur du puits de la plaque à 12 puits sur le dessus de la gouttelette. Couvrez l’assiette avec un couvercle et placez-la à 4 °C pendant la nuit.
  4. Une fois la coloration terminée, lavez les deux côtés de la membrane avec du PBS. À l’aide d’une pipette et d’un embout de 200 μL, rincez soigneusement la face inférieure de l’insert 3 fois avec 200 μL de PBS. Pour le haut de l’insert, laver en ajoutant 200 μL de PBS sur le dessus, en aspirant et en répétant le lavage 3 fois.
  5. Préparez tous les anticorps secondaires (veuillez consulter le tableau des matériaux pour les anticorps spécifiques utilisés) selon les recommandations du fabricant ou une dilution de 1:1000 dans 1 % de BSA dans du PBS ou autre. La coloration secondaire des anticorps doit être effectuée dans l’obscurité ; Utilisez une boîte en carton ou un tiroir d’une armoire pour créer un environnement sans lumière.
  6. En utilisant la méthode des grosses gouttelettes ou celle de la plaque à 12 puits, préparez une nouvelle plaque stérile. Incuber pendant 2 h à RT dans un environnement sombre. Laver comme décrit au point 15.4.

16 : Préparation à l’imagerie confocale

  1. Si la membrane n’a pas encore été marquée comme décrit à l’étape 14, étiquetez-la pour connaître l’emplacement du type de cellule. Placez une petite marque (point, x, chèque, etc.) avec un marqueur résistant aux solvants à n’importe quel endroit (bord de préférence).
  2. Retirez délicatement les lamelles rondes du récipient de stockage et posez-les délicatement sur la surface de la paillasse.
  3. Diluer le DAPI dans le PBS à une dilution de 1:100. Pour distribuer du DAPI avec le distributeur de gouttelettes, ajoutez 1 à 3 gouttelettes au milieu de la lamelle. Sinon, pipetez 1 à 3 gouttelettes de DAPI au milieu de la lamelle.
  4. Tenez l’insert avec une pince. Découpez soigneusement la membrane avec une lame de scalpel dans un mouvement circulaire tout autour du bord/bord inférieur. Ne laissez pas la membrane tomber sur le banc. Posez l’insert en plastique sur le banc et tenez la membrane avec une pince tout en coupant les fibres finales avec la lame du scalpel.
  5. Placez l’insert sur le dessus du DAPI. Distribuez 1 à 3 gouttelettes de DAPI (dilution 1:100) vers le haut de la membrane afin que les deux côtés de la membrane aient du DAPI.
  6. Soulevez le deuxième couvercle avec les doigts (portez des EPI). N’utilisez pas de pinces car le couvercle est très fragile.
  7. Alignez la deuxième lamelle sur la première et abaissez-la délicatement sur le dessus de la membrane.
  8. À l’aide d’un marqueur résistant aux solvants, étiquetez soigneusement le côté de la lamelle si nécessaire pour coder le type/l’orientation de la cellule (facultatif). Si la membrane a été étiquetée, sautez cette étape.
  9. En fonction du nombre de lamelles à imager et du nombre d’anneaux métalliques disponibles, montez les lamelles entre les anneaux métalliques fabriqués dans le commerce pour maintenir les lamelles rondes ensemble pour l’imagerie ou rangez-les dans l’obscurité jusqu’à l’imagerie.
  10. Pour obtenir une image, montez la lamelle avec la membrane entre les anneaux métalliques de la chambre cellulaire et placez-la dans le support de microscope confocal. Contactez le noyau de microscopie confocale avant de voir quel support peut être nécessaire pour imager les lamelles rondes.
  11. Lorsque vous êtes prêt à prendre des images, enveloppez chaque sandwich dans une feuille d’aluminium et apportez-le à l’établissement.
  12. À l’aide de la fonction Z-stack, balayez chaque côté de la membrane individuellement en utilisant la longueur d’onde appropriée en fonction des fluorophores utilisés. Retournez et imagez le deuxième côté. Pour stocker les lamelles, conservez-les dans l’obscurité à 4 °C.

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Résultats

Pour déterminer la pertinence biologique des co-cultures Flipwell de bactéries intestinales, d’épithéliums du côlon et de macrophages, nous avons traité les co-cultures avec de la sépiaptérine (SEP), un modulateur du métabolisme de l’arginine, pour favoriser la production d’oxyde nitrique 9,10,11 par rapport au DMSO témoin. Nous avons déterminé les effets du traitement SEP sur chaque composant d...

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Discussion

Pour recréer l’architecture de la muqueuse intestinale in vitro, nous avons conçu un système de co-culture simple qui comprend des couches stratifiées de bactéries intestinales, de cellules épithéliales du côlon productrices de mucus et de macrophages. Ce système de multi-co-culture nous a permis d’étudier les effets de la diaphonie entre le sécrétome bactérien, les épithéliums intestinaux et les macrophages sur l’induction de mécanismes de reprogrammation immunogène et de défen...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts. Les auteurs déclinent par la présente toute garantie, expresse ou implicite, dans toute la mesure permise par la loi. En aucun cas, les auteurs ne pourront être tenus responsables, que ce soit en vertu d’une loi, d’un contrat, d’un délit ou de toute autre théorie juridique, de tout dommage spécial, accessoire, indirect, punitif, multiple ou consécutif découlant de ou lié à l’utilisation d’outils dans la construction des Flipwells, à l’utilisation de réactifs BSL, de lignées cellulaires, de cultures bactériennes, à l’utilisation du système Flipwell dans un environnement anaérobie dans une chambre anaérobie. Cette limitation de responsabilité inclut, sans s’y limiter, toute manière non spécifiée d’utiliser Flipwell qui n’est pas explicitement décrite dans les présentes.

Remerciements

L’auteur principal exprime sa sincère gratitude à la Dre Saori Furuta pour ses excellentes compétences en matière de mentorat, ses conseils et son soutien continus à longue distance, et sa conception de projet habile et continue qui favorisent de fantastiques opportunités d’apprentissage. Les auteurs remercient également la Dre Vandana Sharma pour son expertise et ses conseils en microbiologie et la Dre Veani R. Fernando pour la préparation des macrophages THP-1.  De plus, les auteurs remercient les Drs Andrew Kleinhenz et William T. Gunning de l’installation de microscopie électronique, ainsi que Cassandra Zamora et Kristin Kirschbaum du Centre d’instrumentation de l’Université de Toledo pour leurs suggestions constructives pour l’imagerie EM. Ce travail a été soutenu par le fonds de démarrage du campus des sciences de la santé de l’Université de Toledo, du Collège de médecine et des sciences de la vie, du Département de biologie du cancer à S.F ; Subvention de recherche sur le cancer de l’Ohio (projet # : 5017) à S.F ; Société de recherche médicale (Fondation Toledo, #206298) Prix à S.F ; Bourse de recherche de l’American Cancer Society (RSG-18-238-01-CSM) à S.F ; et la subvention de recherche de l’Institut national du cancer (R01CA248304) à SF.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,4 % de PFA (voir recette dans Reagents and Solutions)Décrit dans le texte
Pipette sérologique de 10 mlCorning4488
Plaque TC à 12 puits   ; PartenaireCorning3513
Tubes coniques de 15 ml, SpectraTubeAlkali ScientificC2715
200 & micro ; l conseils   ;USA Scientific1111-1700
Inserts à 24 puits - Inserts de culture pour plaques à 24 puits, PET 0,4 & micro ; m  ;BrandTech Scientific782710
Flipwells 3D préfabriqués, stérilisés aux UV & nbsp ;Faire en laboratoire
4 % de PFA (voir recette dans Réactifs et solutions)Décrit dans le texte
Stock de 50 mM de sépiaptérine (SEP, voir la recette dans Réactifs et solution)Carrière chez Henan Chemical CoCAS# : 17094-01-8
Tubes coniques de 50 mlGreiner Bio-One227261
Pipette sérologique de 5 mlCorning4487
70-95 % d’éthanol (alcool éthylique)Laboratoires de décontamination04-355-151
AluminiumFisher Scientific01-213-100
Aiguilles d’alimentation animale, calibre 20 1,5" longueur, usage unique   ;Fisher Scientific01-208-87
Tampon de dilution d’anticorps (voir la recette dans Réactifs et solutions)Décrit dans le texte
Chambre cellulaire Attofluor & nbsp ;ThermoFisher ScientificA7816
Bande autoclaveFisher Scientific15-901-111
Bactéries subtilis wt (3A1T) dans le stock de glycérol ()Centre de Stock Génétique Bacillus (https:// bgsc. org/
Gants BioGrip sans poudre en nitrile rose sans latexFabrication de haute qualitéP2810
Tampon de blocage (voir recette dans Réactifs et solutions - 10 % de sérum normal de chèvre dans PBS)Décrit dans le texte
Tampon de blocage (voir recette dans Réactifs et solutions)Décrit dans le texte
Microscope à champ clair (Nikon ou équivalent) Eclipse Ts2NikonTS2
Cellules Caco-2ATCCHTB-37
Incubateur de culture cellulaire, 37 et degrés ; C, 5 % de CO2 (Eppendorf CellXpert)Eppendorf6734010015
Centrifugeuse (Eppendorf, centrifugeuse 5804/5804 R ou équivalentEppendorf22622501
Tubes centrifugeuses 50 ml SpectraTubeAlkali ScientificC2750
Inserts de culture pour plaque à 12 puits, PET, 0,4 & micro ; m, stérileBrandTech Scientific, BRAND Insert 2en-1, BIO-CERT782730
Média de montage DAPI VectaShieldLaboratoires VectorH-1000
Fond profond de boîte de Petri, 100 x 25 mm de polystyrène profond avec une boîte de Petri empilable, stérile & nbsp ;USA Scientific8609-0625
XP d’aide à pipette DrummondDrummond & nbsp ;4-000-101
Centrifugeuse Eppendorf 5804 avec rotor à seau pivotante pour tubes coniques de 50 mlEppendorf22622501
Pinces, acier inoxydable, autoclave stérile, 2x setsVWR82027-438
Pinces, acier inoxydable, autoclave stérile, 2 ensembles, pinces à échantillonsVWR82027-438
Flasque en verre 500 mlCorning  ;4980-500
Hémacytomètre (Neubauer avec gloutis de couverture)Thermo Fisher Scientific50-312-90
Piles HT-29-MTX-E12Millipore Sigma12040401
ImmunoPen (optionnel)Fisher Scientific4021761EA
Gants résistants à base de Kevlar ou autres coupures (optionnel)Quincaillerie ou Amazon
Ruban de laboratoire ou ruban d’expéditionFisher Scientific & nbsp ;159015R
Hotte à écoulement laminaire série 1300 A2 BSC classe IIThermoFisher Scientific1375
Hotte à écoulement laminaire avec lumière UV SterilGARDLa Baker CompanySG403A-HE
Marqueurs à l’épreuve des solvantsVWR52877-310 ou 95042-566
Médias pour cellules Caco-2 (DMEM à base de glucose élevé, voir recette dans Réactifs et solutions)décrit dans   ; SMS
Médias pour cellules HT-29 (DMEM High Glucose, voir la recette dans Reagents and Solutions)Décrit dans le texte
Médias pour cellules THP-1 (RPMI, voir recette dans Réactifs et solutions)Décrit dans le texte
Tube de microcentrifuge, 1,7 ml, stérile & nbsp ;Alkali ScientificC3017-ST
Tubes microcentrifugesThermo Fisher3451
Média Miller LB (voir recette dans Réactifs et solutions)Sigma-Aldrich  ; L3522
Pinces à bec fin, 2 ensemblesQuincaillerie ou Amazon
Gants Aurelia Amazing sans poudre de nitrileMidSci92885
Couvercles de boîte de Petri, stériles de la boîte de Petri Falcon style 100x15 mmCorning Inc351029
Acétate de myristate de phorbol (PMA) (100 ng/&mu ; l, voir la recette dans Réactifs et solutions) & nbsp ;InvivoGenTlrl-pma
Pointes de pipet (10 & micro ; 1, 200 & micro ; 1000 & micro ; l) PurePoint ou équivalentAlkali Scientific & nbsp ;ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
Film plastiqueÉpicerie
Solution de collagénase de travail Purecol (100 & micro ; g/mL)Advanced BioMatrix5005-100ML
Caches ronds #1 1 oz (Corning Float Glass ou Fisherbrand)Corning ou Fisherbrand50143822 ou 12-546-2 25CIR-2
Lames de scalpel, stériles, jetables   ;Mopec ou Feather #10AJ136 ou 2975#10
Sépiaptérine (septembre 100 & micro ; M, voir la recette dans Réactifs et Solution)Carrière chez Henan Chemical CoCAS# : 17094-01-8
Incubateur secoué réglé à 220 tr/min 37° ; CEppendorf New Brunswick ScientificM12990080
Silicone adhésif Loctite Silicon transparent IDH ou 3M Marine Grade Silicone Joint Clear avec un nosetipLoctite ou 3M1745658 ou PN08019
Pipette à canal unique Eppendorf Research Plus, 200 & micro ; lEppendorf
Pipettes à canal unique (10 & micro ; 1, 200 & micro ; 1000 & micro ; l)Eppendorf2231001122
Spectrophotomètre NanoDropOneCThermo Fisher Scientific13-400-519
Eau déionisée stérile   ;   ;
Sérine tamponnée phosphate stérile (PBS) sans calcium ni magnésiumFisher Scientific  ; BSS-PBS-1X6
Seringue de 3 ml ou 5 ml avec embout Luer-LokBD309585 ou 309603
Cellules THP-1ATCCTIB-202
Pipettes de transfert, stérilesFisherbrand13-711-20
Triton X-100Millipore SigmaX100
Solution bleue de trypanVWR97063-702
Trypsine-EDTA 0,25 %Thermo Fisher Scientific25200-056
Wipe Kimwipes Professional avec le Polyshield Anti-Stat LintGuardKimberly-Clark34120
Anticorps primaires :   ;
Anti-humain CD163Abcam156769
Anti-humain CD68Novus BiologicalsNB100-683-0,1 mg
Anti-humain CD80, E3Q9VTechnologies de signalisation cellulaire15416
Anti-humains CK20  ;Technologies de viePA5-82875
MUC2 anti-humain (996/1)ThermoFisherMA5-12345
Anticorps secondaires :
Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit IgG (pour CD80 et CK20)ThermoFisherA11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (pour MUC2 et CD68 ou CD163)ThermoFisherA11005
Réactifs et Solutions :   ;   ;
< fort>Caco-2 Moyen :
DMEM avec un taux élevé de glucose (4,5g/L) et 1 % (v :v) de GlutaMax  ;Thermo Fisher Scientific35050061
FBS 10 % (v :v) inactivé par la chaleurSigmaF2242-500ML
Acides aminés non essentiels 1 % pour le milieu Caco-2Thermo Fisher Scientific11140076
Streptocoque du stylo 1 % (v :v)SigmaF2242-500ML
< Fort >HT-29-MTX Moyen
DMEM avec un taux élevé de glucose (4,5g/L) et 1 % (v :v) de GlutaMax  ;Thermo Fisher Scientific35050061
FBS 10 % (v :v) inactivé par la chaleurSigmaF2242-500ML
HEPES (concentration finale de 10 mM)Thermo Fisher Scientific15630080
Streptocoque du stylo 1 % (v :v)SigmaF2242-500ML
< fort >THP-1 Moyen :
FBS (10 % v :v) sérum fœtal bovin inactivé à la chaleurSigma  ;F2242-500ML
Glucose (concentration finale de 4,5 g/L)Thermo Fisher ScientificA249001
GlutaMax 1 % (v :v)  ; Concentration finale de 2 mMThermo Fisher Scientific35050061
HEPES (concentration finale de 10 mM)Thermo Fisher Scientific15630080
Streptocoque du stylo 1 % (v :v)SigmaF2242-500ML
Institut commémoratif Roswell Park (RPMI)-1640 moyenThermo Fisher Scientific11875119
Pyruvate de sodium (concentration finale de 1 mM)Thermo Fisher Scientific11360070
de collagénase agissant Purecol (dilution à 1:30 100 & micro ; G/ML) :
Purecol 3 mg/ml 1:30 à 100 & micro ; g/ml  ;Advanced BioMatrix5005-100ML
Eau déionisée stérile
L-Sépiaptérine (50 mM) :
L-Sépiaptérine (SEP)Carrière chez Henan Chemical CoCAS# : 17094-01-8
Phorbol myristate acétate (PMA, 5 mg/mL)InvivoGenTlrl-pma
BSA 1 % albumine sérique bovine   ;Sigma-Aldrich5470
DMSO  ;Sigma  ;D2650
Miller LBSigma-Aldrich  ; L3522
Sérum normal de la même espèce que l’anticorps secondaireSigma  ;NS02L-1ML
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich441244

Références

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