3D Flipwell Engineering pour le développement de systèmes asynchrones pour les thérapies toxicologiques et immunomodulatrices dans les cellules bactériennes, intestinales et immunitaires

Maria A. Beamer; Saori Furuta

doi:10.3791/68701

Method Article

3D Flipwell Engineering pour le développement de systèmes asynchrones pour les thérapies toxicologiques et immunomodulatrices dans les cellules bactériennes, intestinales et immunitaires

DOI:

10.3791/68701

⸱

October 17th, 2025

Maria A. Beamer¹ , Saori Furuta²

¹Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, ²MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article fournit un protocole détaillé avec des étapes clés pour guider l’ingénierie et l’utilisation de 3D Flipwell. Nous décrivons et montrons comment assembler les piles d’inserts de co-culture et les utiliser pour co-cultiver des couches stratifiées de bactéries intestinales, d’épithéliums intestinaux et de macrophages afin de modéliser l’environnement de la muqueuse intestinale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour étudier les rôles du sécrétome bactérien dans la polarisation des cellules immunitaires et l’homéostasie de la muqueuse intestinale, nous avons développé un modèle de co-culture en 3 dimensions utilisant des inserts disponibles dans le commerce dans un format empilé dos à dos. Nous avons appelé ce système 3D Flipwells, et avons co-cultivé avec succès des bactéries, des cellules épithéliales du côlon et des cellules immunitaires dans des couches stratifiées pour récapituler le microenvironnement de la muqueuse intestinale. Ce système de co-culture permet l’ensemencement de cellules épithéliales du côlon d’un côté de la membrane et de monocytes non adhérents indifférenciés de l’autre, permettant la progression synchrone de la polarisation épithéliale du côlon, de la formation de mucus et de la différenciation et de la polarisation monocytes-macrophages au sein d’une seule co-culture sans qu’il soit nécessaire de détacher et de replaquer des macrophages pré-différenciés. Ce système est facile à construire et ne nécessite que quelques matériaux et outils facilement disponibles. Nous avons testé son utilité en analysant les réponses des composants de co-culture à la sépiaptérine (SEP), le précurseur endogène de BH₄ (tétrahydrobioptérine) - un cofacteur de l’oxyde nitrique synthase (NOS). Nous avons démontré que le traitement SEP de 3D Flipwell induisait la formation de biofilms par les bactéries intestinales, la production de mucus par l’épithélium du côlon et la polarisation pro-immunogène des macrophages. Cela indique que la SEP déclenche l’activation d’un mécanisme de défense de la muqueuse par la diaphonie entre différents composants cellulaires. D’autres expériences sont nécessaires pour étudier le rôle des communications muqueuses qui conduisent à la reprogrammation des cellules immunitaires et pour évaluer l’utilité de ce système de co-culture pour dépister de nouvelles thérapies immunomodulatrices.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La diaphonie entre les cellules immunitaires et le microbiome intestinal influence grandement l’efficacité des différents traitements contre les maladies. Une telle diaphonie est nettement modifiée par des stimuli externes, y compris, mais sans s’y limiter, les anomalies métaboliques de l’hôte, les changements alimentaires, la manifestation de la maladie et le traitement pharmacologique. Ces changements pourraient entraîner un déséquilibre dans la composition de la microflore, une condition appelée dysbiose ^1,2,3.

....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 3D Ingénierie Flipwell

Tout le travail doit être effectué à l’intérieur d’une armoire de culture cellulaire. Placez toutes les fournitures à l’intérieur de l’armoire.
Ouvrez le couvercle de la boîte de Pétri et réservez. Ouvrez la lame du scalpel de son boîtier de protection et placez-la sur le bord du fond de la boîte de Pétri. Assurer la stérilité.
ATTENTION : Une manipulation soigneuse de la lame du scalpel est nécessaire. Utilisez des gants résistants aux coupures et renforcés de fibres pour protéger les mains si nécessaire.
Ouvrez l’emballage de protection stérile de l’insert....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour déterminer la pertinence biologique des co-cultures Flipwell de bactéries intestinales, d’épithéliums du côlon et de macrophages, nous avons traité les co-cultures avec de la sépiaptérine (SEP), un modulateur du métabolisme de l’arginine, pour favoriser la production d’oxyde nitrique ^9,10,11 par rapport au DMSO témoin. Nous avons déterminé les effets du traitement SEP sur chaque composant d.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour recréer l’architecture de la muqueuse intestinale in vitro, nous avons conçu un système de co-culture simple qui comprend des couches stratifiées de bactéries intestinales, de cellules épithéliales du côlon productrices de mucus et de macrophages. Ce système de multi-co-culture nous a permis d’étudier les effets de la diaphonie entre le sécrétome bactérien, les épithéliums intestinaux et les macrophages sur l’induction de mécanismes de reprogrammation immunogène et de défen.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts. Les auteurs déclinent par la présente toute garantie, expresse ou implicite, dans toute la mesure permise par la loi. En aucun cas, les auteurs ne pourront être tenus responsables, que ce soit en vertu d’une loi, d’un contrat, d’un délit ou de toute autre théorie juridique, de tout dommage spécial, accessoire, indirect, punitif, multiple ou consécutif découlant de ou lié à l’utilisation d’outils dans la construction des Flipwells, à l’utilisation de réactifs BSL, de lignées cellulaires, de cultures bactériennes, à l’utilisation du système Flipwell dans un environnement anaérobie dans une chambre anaérobie. Cette limitation de responsabilité inclut, sans s’y limiter, toute manière non spécifiée d’utiliser Flipwell qui n’est pas explicitement décrite dans les présentes.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’auteur principal exprime sa sincère gratitude à la Dre Saori Furuta pour ses excellentes compétences en matière de mentorat, ses conseils et son soutien continus à longue distance, et sa conception de projet habile et continue qui favorisent de fantastiques opportunités d’apprentissage. Les auteurs remercient également la Dre Vandana Sharma pour son expertise et ses conseils en microbiologie et la Dre Veani R. Fernando pour la préparation des macrophages THP-1. De plus, les auteurs remercient les Drs Andrew Kleinhenz et William T. Gunning de l’installation de microscopie électronique, ainsi que Cassandra Zamora et Kristin Kirschbau....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
0,4 % de PFA (voir recette dans Reagents and Solutions)	Décrit dans le texte
Pipette sérologique de 10 ml	Corning	4488
Plaque TC à 12 puits ; Partenaire	Corning	3513
Tubes coniques de 15 ml, SpectraTube	Alkali Scientific	C2715
200 & micro ; l conseils ;	USA Scientific	1111-1700
Inserts à 24 puits - Inserts de culture pour plaques à 24 puits, PET 0,4 & micro ; m ;	BrandTech Scientific	782710
Flipwells 3D préfabriqués, stérilisés aux UV & nbsp ;	Faire en laboratoire
4 % de PFA (voir recette dans Réactifs et solutions)	Décrit dans le texte
Stock de 50 mM de sépiaptérine (SEP, voir la recette dans Réactifs et solution)	Carrière chez Henan Chemical Co	CAS# : 17094-01-8
Tubes coniques de 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Pipette sérologique de 5 ml	Corning	4487
70-95 % d’éthanol (alcool éthylique)	Laboratoires de décontamination	04-355-151
Aluminium	Fisher Scientific	01-213-100
Aiguilles d’alimentation animale, calibre 20 1,5" longueur, usage unique ;	Fisher Scientific	01-208-87
Tampon de dilution d’anticorps (voir la recette dans Réactifs et solutions)	Décrit dans le texte
Chambre cellulaire Attofluor & nbsp ;	ThermoFisher Scientific	A7816
Bande autoclave	Fisher Scientific	15-901-111
Bactéries subtilis wt (3A1T) dans le stock de glycérol ()	Centre de Stock Génétique Bacillus (https:// bgsc. org/
Gants BioGrip sans poudre en nitrile rose sans latex	Fabrication de haute qualité	P2810
Tampon de blocage (voir recette dans Réactifs et solutions - 10 % de sérum normal de chèvre dans PBS)	Décrit dans le texte
Tampon de blocage (voir recette dans Réactifs et solutions)	Décrit dans le texte
Microscope à champ clair (Nikon ou équivalent) Eclipse Ts2	Nikon	TS2
Cellules Caco-2	ATCC	HTB-37
Incubateur de culture cellulaire, 37 et degrés ; C, 5 % de CO2 (Eppendorf CellXpert)	Eppendorf	6734010015
Centrifugeuse (Eppendorf, centrifugeuse 5804/5804 R ou équivalent	Eppendorf	22622501
Tubes centrifugeuses 50 ml SpectraTube	Alkali Scientific	C2750
Inserts de culture pour plaque à 12 puits, PET, 0,4 & micro ; m, stérile	BrandTech Scientific, BRAND Insert 2en-1, BIO-CERT	782730
Média de montage DAPI VectaShield	Laboratoires Vector	H-1000
Fond profond de boîte de Petri, 100 x 25 mm de polystyrène profond avec une boîte de Petri empilable, stérile & nbsp ;	USA Scientific	8609-0625
XP d’aide à pipette Drummond	Drummond & nbsp ;	4-000-101
Centrifugeuse Eppendorf 5804 avec rotor à seau pivotante pour tubes coniques de 50 ml	Eppendorf	22622501
Pinces, acier inoxydable, autoclave stérile, 2x sets	VWR	82027-438
Pinces, acier inoxydable, autoclave stérile, 2 ensembles, pinces à échantillons	VWR	82027-438
Flasque en verre 500 ml	Corning ;	4980-500
Hémacytomètre (Neubauer avec gloutis de couverture)	Thermo Fisher Scientific	50-312-90
Piles HT-29-MTX-E12	Millipore Sigma	12040401
ImmunoPen (optionnel)	Fisher Scientific	4021761EA
Gants résistants à base de Kevlar ou autres coupures (optionnel)	Quincaillerie ou Amazon
Ruban de laboratoire ou ruban d’expédition	Fisher Scientific & nbsp ;	159015R
Hotte à écoulement laminaire série 1300 A2 BSC classe II	ThermoFisher Scientific	1375
Hotte à écoulement laminaire avec lumière UV SterilGARD	La Baker Company	SG403A-HE
Marqueurs à l’épreuve des solvants	VWR	52877-310 ou 95042-566
Médias pour cellules Caco-2 (DMEM à base de glucose élevé, voir recette dans Réactifs et solutions)	décrit dans ; SMS
Médias pour cellules HT-29 (DMEM High Glucose, voir la recette dans Reagents and Solutions)	Décrit dans le texte
Médias pour cellules THP-1 (RPMI, voir recette dans Réactifs et solutions)	Décrit dans le texte
Tube de microcentrifuge, 1,7 ml, stérile & nbsp ;	Alkali Scientific	C3017-ST
Tubes microcentrifuges	Thermo Fisher	3451
Média Miller LB (voir recette dans Réactifs et solutions)	Sigma-Aldrich	; L3522
Pinces à bec fin, 2 ensembles	Quincaillerie ou Amazon
Gants Aurelia Amazing sans poudre de nitrile	MidSci	92885
Couvercles de boîte de Petri, stériles de la boîte de Petri Falcon style 100x15 mm	Corning Inc	351029
Acétate de myristate de phorbol (PMA) (100 ng/&mu ; l, voir la recette dans Réactifs et solutions) & nbsp ;	InvivoGen	Tlrl-pma
Pointes de pipet (10 & micro ; 1, 200 & micro ; 1000 & micro ; l) PurePoint ou équivalent	Alkali Scientific & nbsp ;	ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
Film plastique	Épicerie
Solution de collagénase de travail Purecol (100 & micro ; g/mL)	Advanced BioMatrix	5005-100ML
Caches ronds #1 1 oz (Corning Float Glass ou Fisherbrand)	Corning ou Fisherbrand	50143822 ou 12-546-2 25CIR-2
Lames de scalpel, stériles, jetables ;	Mopec ou Feather #10	AJ136 ou 2975#10
Sépiaptérine (septembre 100 & micro ; M, voir la recette dans Réactifs et Solution)	Carrière chez Henan Chemical Co	CAS# : 17094-01-8
Incubateur secoué réglé à 220 tr/min 37° ; C	Eppendorf New Brunswick Scientific	M12990080
Silicone adhésif Loctite Silicon transparent IDH ou 3M Marine Grade Silicone Joint Clear avec un nosetip	Loctite ou 3M	1745658 ou PN08019
Pipette à canal unique Eppendorf Research Plus, 200 & micro ; l	Eppendorf
Pipettes à canal unique (10 & micro ; 1, 200 & micro ; 1000 & micro ; l)	Eppendorf	2231001122
Spectrophotomètre NanoDropOneC	Thermo Fisher Scientific	13-400-519
Eau déionisée stérile ; ;
Sérine tamponnée phosphate stérile (PBS) sans calcium ni magnésium	Fisher Scientific	; BSS-PBS-1X6
Seringue de 3 ml ou 5 ml avec embout Luer-Lok	BD	309585 ou 309603
Cellules THP-1	ATCC	TIB-202
Pipettes de transfert, stériles	Fisherbrand	13-711-20
Triton X-100	Millipore Sigma	X100
Solution bleue de trypan	VWR	97063-702
Trypsine-EDTA 0,25 %	Thermo Fisher Scientific	25200-056
Wipe Kimwipes Professional avec le Polyshield Anti-Stat LintGuard	Kimberly-Clark	34120
Anticorps primaires : ;
Anti-humain CD163	Abcam	156769
Anti-humain CD68	Novus Biologicals	NB100-683-0,1 mg
Anti-humain CD80, E3Q9V	Technologies de signalisation cellulaire	15416
Anti-humains CK20 ;	Technologies de vie	PA5-82875
MUC2 anti-humain (996/1)	ThermoFisher	MA5-12345
Anticorps secondaires :
Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit IgG (pour CD80 et CK20)	ThermoFisher	A11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (pour MUC2 et CD68 ou CD163)	ThermoFisher	A11005
Réactifs et Solutions : ; ;
< fort>Caco-2 Moyen :
DMEM avec un taux élevé de glucose (4,5g/L) et 1 % (v :v) de GlutaMax ;	Thermo Fisher Scientific	35050061
FBS 10 % (v :v) inactivé par la chaleur	Sigma	F2242-500ML
Acides aminés non essentiels 1 % pour le milieu Caco-2	Thermo Fisher Scientific	11140076
Streptocoque du stylo 1 % (v :v)	Sigma	F2242-500ML
< Fort >HT-29-MTX Moyen
DMEM avec un taux élevé de glucose (4,5g/L) et 1 % (v :v) de GlutaMax ;	Thermo Fisher Scientific	35050061
FBS 10 % (v :v) inactivé par la chaleur	Sigma	F2242-500ML
HEPES (concentration finale de 10 mM)	Thermo Fisher Scientific	15630080
Streptocoque du stylo 1 % (v :v)	Sigma	F2242-500ML
< fort >THP-1 Moyen :
FBS (10 % v :v) sérum fœtal bovin inactivé à la chaleur	Sigma ;	F2242-500ML
Glucose (concentration finale de 4,5 g/L)	Thermo Fisher Scientific	A249001
GlutaMax 1 % (v :v) ; Concentration finale de 2 mM	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES (concentration finale de 10 mM)	Thermo Fisher Scientific	15630080
Streptocoque du stylo 1 % (v :v)	Sigma	F2242-500ML
Institut commémoratif Roswell Park (RPMI)-1640 moyen	Thermo Fisher Scientific	11875119
Pyruvate de sodium (concentration finale de 1 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360070
de collagénase agissant Purecol (dilution à 1:30 100 & micro ; G/ML) :
Purecol 3 mg/ml 1:30 à 100 & micro ; g/ml ;	Advanced BioMatrix	5005-100ML
Eau déionisée stérile
L-Sépiaptérine (50 mM) :
L-Sépiaptérine (SEP)	Carrière chez Henan Chemical Co	CAS# : 17094-01-8
Phorbol myristate acétate (PMA, 5 mg/mL)	InvivoGen	Tlrl-pma
BSA 1 % albumine sérique bovine ;	Sigma-Aldrich	5470
DMSO ;	Sigma ;	D2650
Miller LB	Sigma-Aldrich	; L3522
Sérum normal de la même espèce que l’anticorps secondaire	Sigma ;	NS02L-1ML
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	441244

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
Xuan, C., et al.

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