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Amélioration de l’édition du génome via une technique d’électroporation in vivo basée sur l’administration d’acides nucléiques oviductaux pour la génération de souris knock-out

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DOI :

10.3791/68704

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26 août 2025

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1Center of Transgenesis and Genome Editing, St. Petersburg State University, 2Resource Center Molecular and Cell Technologies, St. Petersburg State University, 3Amyloid Biology Laboratory, St. Petersburg State University, 4DNA-Nanosensoric laboratory, ITMO University, 5Laboratory of Toxinology and Molecular Systematics, L.A. Orbeli Institute of Physiology, National Academy of Sciences of the Republic of Armenia

Dans cet article

Résumé

L’efficacité de la méthode I-GONAD (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) est comparable à celle de la micro-injection traditionnelle, qui nécessite la collecte de zygotes sur les femelles donneuses et le transfert à des femelles pseudo-enceintes. Ce protocole démontre son efficacité en introduisant des mutations induites par CRISPR/Cas9 dans le locus ROSA26 sur le chromosome 6.

Résumé

Les méthodes de création de souris knock-out impliquent généralement trois étapes principales : (1) collecter des embryons à partir de femelles donneuses, (2) micro-injecter des constructions génétiques dans les zygotes ex vivo et (3) les transférer chirurgicalement dans l’oviducte de femelles pseudo-enceintes. Ce processus nécessite un nombre important d’animaux, car il implique non seulement des femelles donneuses, mais aussi des mâles vasectomisés et des femelles pseudo-enceintes. De plus, les micro-injections dans le cytoplasme ou le pronucléus des zygotes de souris présentent des défis tels que le colmatage des aiguilles, des problèmes de perméabilité membranaire dus à une élasticité élevée et la mort potentielle de l’embryon. Le développement d’électroporateurs avancés, tels que le Nepa21, offre une occasion unique de générer des souris avec des gènes inactivés ciblés en une seule étape grâce à une méthode connue sous le nom d’édition améliorée du génome via l’administration d’acides nucléiques oviductaux (I-GONAD). Cette technique consiste à micro-injecter des composants CRISPR-Cas (protéine Cas9 et ARN guide) dans les oviductes de femelles gestantes 0,7 jour après la conception, suivi d’une électroporation in vivo pour délivrer ces composants directement dans les zygotes. Après la procédure I-GONAD, la souris enceinte porte et donne naissance à des petits avec le gène ciblé knock-out. Cet article fournit un protocole détaillé, étape par étape, pour la mise en œuvre de la méthode I-GONAD chez la souris, offrant une alternative plus efficace et plus accessible aux techniques traditionnelles de génération de souris knock-out.

Introduction

Comprendre la base génétique des maladies est essentiel pour identifier les mécanismes moléculaires sous-jacents à leur étiologie et à leur pathogenèse. Une étape clé de cette recherche est le développement de modèles animaux avec des knock-outs de gènes ciblés qui simulent des maladies humaines. Les souris sont particulièrement précieuses pour ces études en raison de leur similitude génomique générale avec celle des humains, de leur petite taille, de leur courte durée de vie et de leur fertilité élevée. Les modèles de souris sont importants pour la recherche fondamentale et les tests précliniques1.

Pour créer une souris knock-out à l’aide du système CRISPR-Cas9, les chercheurs injectent généralement un complexe d’ARN guide et de nucléase Cas9 dans un zygote, provoquant une cassure double brin dans l’ADN cible et activant ainsi le système de réparation de la cellule pour provoquer une mutation au site de la cassure 1,2. La micro-injection dans les zygotes reste la référence à cet effet. Cependant, cette méthode nécessite plusieurs étapes : isoler les embryons des femelles donneuses, effectuer des micro-injections de constructions génétiques dans des zygotes et les transférer chirurgicalement dans les oviductes de femelles pseudo-enceintes. Par conséquent, il est nécessaire de maintenir un grand nombre d’animaux, y compris des femelles donneuses, des mâles vasectomisés et des femelles pseudo-enceintes. De plus, l’isolement des zygotes nécessite l’euthanasie des femelles donneuses. Par conséquent, les protocoles qui minimisent l’utilisation des animaux sont préférables, conformément aux principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement)3.

Les progrès de la technologie d’électroporation, tels que l’utilisation du système Nepa21, offrent une occasion unique de générer des souris ciblées à inactivation génique en une seule étape à l’aide d’une technique connue sous le nom d’édition améliorée du génome via l’administration d’acides nucléiques oviductaux (I-GONAD)4. Le Super Electroporator NEPA21 Type II utilise un système d’électroporation à impulsions multiples en 4 étapes, assurant une efficacité d’électroporation élevée tout en maintenant une viabilité embryonnaire élevée. I-GONAD consiste à micro-injecter des composants CRISPR-Cas (protéine Cas9 (500-600 ng/μl) et ARN guide (80-100 ng/μl)) dans les oviductes de souris enceintes 0,7 jour après la conception, suivi d’une électroporation in vivo pour délivrer ces composants directement dans les zygotes5. Après la procédure I-GONAD, la souris enceinte donne naissance à des petits avec le gène ciblé knock-out 6,7,8. L’efficacité de cette méthode varie en fonction de la cible souhaitée, mais elle est comparable à celle des techniques standard basées sur la micro-injection (environ 50 %)9,10. De plus, I-GONAD pourrait potentiellement être adapté pour l’édition du génome chez d’autres espèces.

Cet article présente un protocole étape par étape pour mettre en œuvre la méthode I-GONAD afin de générer des souris knock-out. À titre d’exemple, son efficacité a été démontrée en ciblant le locus du génome ROSA26 sur le chromosome 6 de la souris. Ce locus a été choisi car il subit une transcription constitutive sans traduction ultérieure. Par conséquent, il est peu probable que l’introduction d’une mutation à ce locus ait un effet négatif sur la santé des petits résultants.

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Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche animale de l’Université d’État de Saint-Pétersbourg (approbation n° 131-03-5, 11 octobre 2022). Toutes les procédures ont été strictement respectées dans les lignes directrices décrites dans le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des souris de souche CD1 consanguines en laboratoire ont été obtenues du Centre d’utilisation collective de l’Institut des composés physiologiquement actifs de l’Académie des sciences de Russie (IPAC RAS). Des souris CD1 femelles âgées de 2 à 3 mois (poids moyen de 27 à 30 g) ont été utilisées pour l’accouplement avec des souris CD1 mâles âgées de 2,5 à 4 mois (poids moyen de 35 à 37 g). Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Conception d’ARN à guide unique (ARNsg) et préparation pour la transfection

  1. Utilisez des outils d’analyse informatique tels que CHOPCHOP, SYNTHEGO Knockout Guide Design ou CRISPOR pour identifier les séquences potentielles d’ARNsg ciblant le gène d’intérêt sélectionné.
    REMARQUE : Le logiciel peut identifier des séquences potentielles d’ARNsg dans l’ensemble du gène et suggère plusieurs variantes à la sortie. Ces outils suggéreront les options d’ARNsg les plus optimales et permettront à l’utilisateur de choisir parmi tous les variants identifiés si nécessaire. Lors de votre sélection, tenez compte des critères suivants :
    1. Proximité des exons : Choisissez des séquences situées dans les exons qui sont aussi proches que possible du point de mutation souhaité. Pour de meilleurs résultats, envisagez les isoformes d’épissage alternatives et sélectionnez la séquence cible présente dans le plus grand nombre d’isoformes. Tenez compte des navigateurs du génome (par exemple, Ensembl) pour une sélection précise des exons.
    2. Considérations hors cible : analysez les effets hors cible potentiels à l’aide du système de notation de l’outil, en sélectionnant les séquences qui présentent l’activité hors cible prévue la plus faible.
      REMARQUE : Les outils informatiques tels que CHOPCHOP ou Synthego sont très efficaces pour évaluer la proximité des exons et les effets hors cible, aidant à identifier les séquences optimales d’ARNg pour une édition précise du génome. Lors de la conception d’ARN guides, il est important de tenir compte de la séquence spécifique du gène d’intérêt dans la souche de souris utilisée. Pour certaines souches de souris (p. ex. C57Bl, CBA, C3H), la séquence génomique complète est disponible. Si ces données ne sont pas disponibles, il peut être judicieux d’effectuer un séquençage préliminaire du gène cible dans la région d’édition prévue. Des décalages uniques dans l’ARN guide, causés par des polymorphismes, peuvent compromettre l’efficacité de l’édition. Le locus du génome de la souris ROSA 26 a été ciblé avec la séquence d’ARNsg : 5'-ACTCCAGTTTTTCTAGAAGA-3'.
  2. Commandez un ensemble d’amorces pour l’amplification par PCR de la matrice sgRNA comme décrit dans le Tableau 1.
    REMARQUE : L’ARNg peut être commandé ailleurs, soit en tant qu’ARNsg, soit en tant qu’ARNcr :ARNtracr duplex.
  3. Produire un modèle linéaire d’ADNdb.
    1. Préparez le mélange maître comme indiqué dans le tableau 1. Ajoutez la polymérase à la fin et gardez le mélange principal sur de la glace pour maintenir la stabilité.
    2. Exécutez la PCR dans les conditions suivantes : Dénaturation initiale : 30 s à 95 °C ; 30 cycles de : 20 s à 95 °C (dénaturation), 20 s à 55 °C (recuit), 15 s à 72 °C (extension) ; Allongement final : 2 min à 72 °C ; Maintenir à 4 °C.
  4. Utilisez le mélange réactionnel PCR dans d’autres réactions de transcription in vitro (IVT).
    1. Préparez le mélange maître IVT comme indiqué dans le tableau 2 et incubez pendant 1,5 h à 37 °C. Utilisez un thermocycleur pour un contrôle constant de la température.
    2. Ajoutez 2 μL de DNase I et incubez pendant 30 minutes supplémentaires à 37 °C pour retirer la matrice d’ADN.
    3. Inactiver la DNase I en incubant le mélange réactionnel à 75 °C pendant 5 min.
    4. Purifier l’ARN à l’aide du réactif TRIZOL selon le protocole du fabricant.
      REMARQUE : L’élimination du réactif TRIZOL et de l’ADNse1, de ses solutions ou de tout sous-produit doit être placée dans des conteneurs de déchets chimiques désignés.
    5. Mesurez la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre (le rendement typique d’une réaction est de 3 à 5 μg). Vérifiez les rapports A260/ A280 et A260/A230. A260/A280 doit être d’au moins 2,0, et le rapport A260/A230 doit également être d’au moins 2,0 (ce qui signifie qu’il n’y a pas de contamination par des protéines ou des solvants organiques). Conservez les ARNsg à -80 °C jusqu’à utilisation.
  5. Préparer le mélange RNP pour la transfection
    1. Le mélange de transfection se compose d’un complexe RNP, qui est un mélange de la protéine Cas9 et de l’ARNsg. Suivez ces étapes pour préparer le mélange RNP :
    2. Diluer 1 M de tampon Tris-HCl (pH 7,5) à 100 mM avec de l’eau sans nucléase et filtrer à l’aide d’un filtre à seringue avec des pores de 0,022 μM, aliquote en portions de 10 μL, et stocker à 4 °C jusqu’à utilisation.
    3. Dans un tube sans nucléase, préparer le mélange de transfection des composants suivants dans les concentrations finales : 500 ng/μL de nucléase spCas9, 80 ng/μL d’ARNsg, 10 mM de Tris-HCl dilué avec de l’eau traitée au DEPC.
      REMARQUE : Des concentrations élevées des composants du mélange RNP sont nécessaires pour assurer une bonne efficacité du protocole.
    4. Incuber le mélange de transfection à 37 °C pendant 10 min pour permettre la formation du complexe RNP.
    5. Aliquote du mélange en petits volumes (2 μL) adaptés à une seule séance d’I-GONAD.
    6. Maintenez les aliquotes à 4 °C pendant la session I-GONAD. Le mélange est préparé frais pour chaque séance d’électroporation I-GONAD afin de maintenir la stabilité.
      REMARQUE : Le mélange RNP doit être préparé frais pour chaque session I-GONAD afin d’assurer une activité et une efficacité optimales.

2. Préparation de souris femelles pour l’édition du génome via l’administration d’acides nucléiques oviductaux

  1. Accouplement et sélection des souris femelles : Accouplez des souris femelles CD1 avec des souris mâles CD1 logées pendant la nuit. Le matin, vérifiez la présence de bouchons de copulation chez les souris femelles. Sélectionnez les femelles avec des bouchons de copulation et transférez-les dans une nouvelle cage pour d’autres procédures.
    REMARQUE : Pour minimiser le mosaïcisme génétique, le moment optimal pour la livraison de la construction génétique est 0,7 jour après l’accouplement au stade10 de la cellule unique (zygote). Cela correspond approximativement à 16h00 le jour où le bouchon de copulation a été détecté. À ce stade, la dissection de l’oviducte révèle que les zygotes ont moins de cellules cumulus, bien qu’elles restent dans l’ampoule. Notamment, les cellules cumulus peuvent également absorber des acides nucléiques ou des protéines exogènes lors de l’électroporation. Si la procédure est effectuée plus tôt, par exemple 10 h après l’accouplement, les cellules du cumulus entourent toujours étroitement les zygotes, ce qui peut entraver l’administration électrophorétique efficace des acides nucléiques dans les zygotes. N’utilisez pas les souris stimulées par l’hormone, car elles pourraient donner un nombre excessif d’ovocytes, ce qui pourrait entraîner une fausse couche.
  2. Préparation des instruments chirurgicaux : Autoclave tous les instruments chirurgicaux en acier inoxydable pour garantir la stérilité.
  3. Anesthésie et préparation des souris : Peser les souris femelles sélectionnées et les anesthésier par injection intrapéritonéale à l’aide d’un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
    1. Surveillez les souris pour détecter la perte du réflexe de pincement de l’orteil afin de confirmer une anesthésie adéquate. Placez la souris anesthésiée sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle pendant la procédure. Protégez les yeux de la souris de la sécheresse pendant l’anesthésie en appliquant une pommade vétérinaire.

3. Intervention chirurgicale

  1. Désinfectez la zone dorsale (dos) de la souris avec de l’éthanol à 70 %.
  2. Faites une incision cutanée longitudinale de 0,7 cm dans la région du bas du dos.
  3. Essuyez le site de l’incision avec un coton imbibé d’éthanol à 70 % et retirez tous les poils autour de l’incision.
  4. Prolongez l’incision à 1,3 cm en poussant latéralement avec des pointes de ciseaux légèrement ouvertes.
  5. Faites soigneusement une petite incision (0,7 cm) dans le péritoine pour accéder à la cavité abdominale.
  6. Prolongez l’incision à 1,1 cm en poussant latéralement avec les pointes des ciseaux légèrement ouvertes.
  7. Localisez le coussinet adipeux attaché à l’ovaire et retirez-le doucement à l’aide d’une pince jusqu’à ce que l’ovaire, l’oviducte et l’utérus soient clairement visibles.
  8. Fixez le coussinet adipeux en place à l’aide d’une pince à récipient.
  9. Visualisez l’oviducte au microscope stéréoscopique pour une manipulation précise (Figure 1).
  10. Chargez 2 μL du mélange d’injection dans un capillaire en plastique à l’aide d’un pipeteur décapant.
    REMARQUE : Le pipette décapant avec capillaires en plastique, conçu à l’origine pour les manipulations avec des embryons dans les cliniques de FIV, peut prendre en charge de multiples applications, y compris le transfert d’embryons et l’administration de construction CRISPR/Cas9 dans les procédures I-GONAD. Le pipeteur fonctionne comme un distributeur de liquide de précision ; En combinaison avec des capillaires flexibles jetables, il permet la stérilité et empêche la contamination croisée. Les capillaires en plastique sont préférables au verre pour l’injection du mélange RNP pour la transfection dans l’oviducte, car ils sont moins traumatisants pour les tissus délicats. Contrairement aux capillaires en verre, les capillaires en plastique jetables ne nécessitent pas de polissage à la flamme pour lisser les arêtes vives avant l’insertion, ce qui réduit le temps de préparation et le risque d’endommagement.
  11. À l’aide de micro-ciseaux, faites une petite incision (0,2 cm) dans la paroi de l’oviducte à quelques millimètres en amont de l’ampoule.
  12. Insérez avec précaution la pipette décapante avec capillaire en plastique dans l’incision et expulsez le mélange d’injection dans l’oviducte.
    REMARQUE : Assurez-vous qu’aucun air ne pénètre dans l’oviducte, car cela pourrait affecter l’efficacité de l’électroporation.
    Pour éviter cela, remplissez le capillaire en plastique d’injection avec plus de mélange d’injection que nécessaire et évitez l’injection complète. Les capillaires en plastique conviennent à la fois au transfert de l’infundibulum et à la dissection directe de la paroi de l’oviducte entre l’infundibulum et l’ampoule. La méthode de dissection directe de la paroi de l’oviducte pourrait être moins traumatisante que le transfert de l’infundibulum, car ce dernier nécessite une incision initiale à travers la fine membrane de la bourse recouvrant l’oviducte et l’infundibulum. Chez les souris CD1, cette membrane est très vascularisée, et la couper peut provoquer des saignements mineurs, ce qui peut obstruer la visibilité et compliquer la micro-injection du mélange RNP.
  13. Retirez délicatement le capillaire en plastique de l’oviducte.

4. Électroporation et suture

  1. Allumez l’électroporateur en appuyant sur l’interrupteur situé sur le panneau avant.
  2. Régler les paramètres d’électroporation : Impulsion de poring : Tension : 50 V, Longueur d’impulsion : 5 m, Intervalle d’impulsion : 50 ms, Nombre d’impulsions : 3, Taux de décroissance - 10 %, Polarité : +/- ; Impulsion de transfert : Tension : 10 V, Durée de l’impulsion : 50 ms, Intervalle d’impulsion : 50 ms, Nombre d’impulsions : 3, Taux de décroissance - 40 %, Polarité : +/- ; Limite de courant : in vivo.
  3. À l’aide des électrodes de type pince à épiler, saisissez soigneusement l’oviducte et vérifiez la valeur de la résistance en appuyant sur le bouton kΩ de l’électroporateur. Assurez-vous que les électrodes sont suffisamment comprimées pour que la résistance reste dans la plage optimale de 350 à 400 Ω.
    REMARQUE : Cela peut être réalisé en ajustant la distance entre les deux électrodes lorsque l’oviducte intact est pris en sandwich entre elles.
    1. Immédiatement après avoir mesuré la résistance, appuyez sur le bouton Start pour lancer l’électroporation. Cette étape est essentielle pour assurer une livraison efficace des composants CRISPR-Cas dans les zygotes4. Attendez que le bouton Ω affiche un signal de fin. Notez les valeurs indiquées dans le cadre Mesures.
      REMARQUE : La valeur d’impédance doit être d’environ 250-400 Ω/150-250 mA de la valeur de tension pour assurer un équilibre optimal entre viabilité et efficacité de transfert. Pour maintenir cet équilibre, évitez de couvrir les régions de l’oviducte avec un morceau de papier humide imbibé de solution saline tamponnée au phosphate modifiée de Dulbecco (DPBS), recommandée dans certains protocoles, car cette étape peut réduire considérablement la résistance au-delà de la plage optimale. Une résistance réduite peut augmenter la tension à plus de 250 mA, entraînant la mort cellulaire.
  4. Après avoir terminé l’électroporation sur un oviducte, replacez soigneusement l’appareil reproducteur dans la cavité abdominale. Suturez l’incision à l’aide d’une suture chirurgicale à l’acide polyglycolique 4-0.
  5. Répétez l’opération et l’électroporation sur le deuxième oviducte. Une fois terminé, ramenez l’appareil reproducteur dans la cavité abdominale et suturez l’incision comme décrit ci-dessus.
  6. Surveillance post-procédure : Placez la souris dans un endroit chaud (37 °C), nettoyez la cage pour la récupération et surveillez-la jusqu’à ce qu’elle se remette complètement de l’anesthésie.
    REMARQUE : Après la chirurgie, logez les souris dans des cages contenant deux souris par cage. Si une seule souris a subi une intervention chirurgicale, donnez-lui une souris femelle de compagnie. Cette pratique aide à réduire le stress inutile pour la souris chirurgicale et favorise un environnement social plus naturel.

5. Génotypage

  1. Conception de l’apprêt
    1. Pour le génotypage, concevez des amorces pour amplifier un produit de PCR d’une longueur de 300 à 600 pb. Les amorces doivent avoir une longueur de 18 à 21 nucléotides avec une température de fusion (Tm) d’environ 60 °C.
    2. Évitez les séquences qui forment des structures secondaires ou des dimères d’amorces. Utilisez des outils logiciels tels que PerlPrimer 1.1.2111, In-Silico PCR V39x1 ou similaires pour garantir la qualité de l’amorce.
    3. Effectuez une recherche BLAST dans la base de données du génome de la souris pour confirmer la spécificité de l’amorce et éviter l’amplification non spécifique11.
      REMARQUE : Les amorces suivantes ont été conçues pour le génotypage de la séquence cible : Amorce directe : 5'-CTCTCCCAAAGTCGCTCTGA-3' ; Amorce inverse : - 5'-TCTGTGGGAAGTCTTGTCCC-3', longueur prévue du produit PCR : 320 pb et Tm 62°C. Pour le séquençage de Sanger, concevez une amorce de séquençage qui recuit à 150-200 pb du site de coupe Cas9.
  2. Effectuez l’extraction de l’ADN. Pour l’extraction rapide de l’ADN, le protocole d’isolementHotshot 12 est le plus simple.
    1. À l’aide d’un coup de poing d’oreille, prélevez un petit fragment de tissu (environ 2 mm) dans l’oreille de la souris.
    2. Ajouter 100 μL de tampon de lyse (25 mM de NaOH, 0,2 mM d’EDTA, pH = 12).
    3. Incuber à 95 °C pendant 60 min, en faisant tourbillonner le mélange toutes les 20 min.
    4. Ajouter 100 μL de tampon neutralisant (40 mM de Tris-HCl, pH = 5) et agiter abondamment.
    5. Utilisez 1 à 5 μL de la préparation finale pour la PCR.
  3. Amplification et séquençage par PCR. Préparez le mélange maître PCR comme indiqué dans le tableau 3. Utilisez une relecture d’ADN polymérase pour assurer une haute fidélité. Aliquote le mélange maître dans le nombre requis de tubes et ajoute de l’ADN génomique.
    REMARQUE : Incluez toujours un échantillon d’ADN de type sauvage comme contrôle pour l’analyse de séquençage.
  4. Exécutez la PCR pour le génotypage de ROSA26 . Les conditions suivantes ont été utilisées : Dénaturation initiale : 30 s à 95 °C ; 28 cycles de : 20 s à 95 °C (dénaturation), 20 s à 62 °C (recuit), 20 s à 72 °C (extension) ; Allongement final : 2 min à 72 °C ; Maintenir à 4 °C.
    REMARQUE : Le protocole fourni est précis pour l’amplification du fragment de locus ROSA26 (taille estimée à 320 pb) à l’aide des amorces de l’étape 1.1.2. Pour une amplification plus spécifique et précise, limitez le nombre de cycles d’amplification à 28-30.
  5. Séquençage et analyse
    1. Effectuer le séquençage de Sanger des fragments de PCR obtenus (étape 5.4).
    2. Analyse des résultats de séquençage
      REMARQUE : Une transfection réussie donnera des animaux en mosaïque, identifiables par l’émergence de séquences d’ADN supplémentaires près du site de coupe de la nucléase dans le chromatogramme de séquençage. Utilisez des outils informatiques tels que EditCo ICE Analysis ou TIDE13 pour identifier et quantifier les indels exacts du génome.
      1. Pour utiliser ICE Analysis, il suffit de télécharger les fichiers de séquençage Sanger obtenus (fichier de contrôle .ab1 pour la séquence de produit PCR de souris wt sans modification et fichier d’expérience .ab1 pour la séquence de produit PCR de souris expérimentale), d’entrer la séquence d’ARN guide et de sélectionner la nucléase utilisée dans l’expérience CRISPR.
        REMARQUE : L’outil d’analyse ICE calcule l’efficacité globale de l’édition et détermine les profils et les abondances relatives de tous les différents types de modifications présents dans l’échantillon.
      2. Pour utiliser TIDE, entrez la séquence d’ARN guide, téléchargez les fichiers de séquençage Sanger obtenus (fichier de contrôle .ab1 pour la séquence de produit PCR de souris wt sans modification et fichier d’expérience .ab1 pour la séquence de produit PCR de souris expérimentale), et vérifiez Paramètres (dans certains cas, les paramètres avancés peuvent aider à trouver des indels supérieurs à 10 pb).

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Résultats

Si l’électroporation a réussi, les souris expérimentales vont : (1) donner naissance à une poignée de petits, et (2) certains animaux auront des indels différents dans le génome. Si les amorces de génotypage sont bien conçues et que le programme de PCR est optimal, le produit de PCR sera présent sur le gel d’agarose sous la forme d’une bande transparente de la taille souhaitée. Si la nucléase réussit à couper l’ADN cible, les animaux obtenus seront probablement en mosaïque et auront une ...

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Discussion

L’efficacité de la génération de souris knock-out à l’aide de la méthode I-GONAD est comparable à celle des techniques de micro-injection traditionnelles. Cependant, les méthodes traditionnelles consistent à isoler les zygotes des femelles donneuses, à effectuer des micro-injections et à transplanter des embryons dans les oviductes de femelles pseudo-enceintes. En revanche, la méthode I-GONAD simplifie ce processus en délivrant des composants d’édition du génome directement dans les ovid...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs sont reconnaissants au Parc de recherche de l’Université de Saint-Pétersbourg, Centre des technologies moléculaires et cellulaires. Le séquençage a été réalisé à l’aide d’un analyseur génétique ABI 3500 xL (Thermo Fisher Scientific, États-Unis) au Centre de ressources en technologies moléculaires et cellulaires du parc scientifique de l’Université d’État de Saint-Pétersbourg. Les auteurs remercient Maria Rubel pour son aide dans l’édition et la soumission des documents. Cette recherche a été financée par l’Université d’État de Saint-Pétersbourg, projet de recherche ID : 129658320, et Luibov Shkodenko a été soutenu par la Fondation scientifique russe (projet 25-26-00247).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5&ndash ; 5 uL pipette   ;Thermo Scientific4642020
Tube de 1,5 mLAptaca1003/G
100-1000 uL pipette   ;Thermo Scientific4642090
Tube de 200 uLAxygènePCR-02-C
20-200 uL pipette   ;Thermo Scientific4642080
2-20 uL pipette   ;Thermo Scientific4642060
4x colorant de charge en gelBiolabmixD-3002
AgaroseAppliChemA8963,0500
DNase I, sans RNase (1 U/&mu ; L)Thermo FisherEN0521
Ensemble dNTP, solution 100 mMThermo ScientificR0181
Polymérase à ADN vert DreamTaq (5 U/&mu ; L)Thermo ScientificEP0713
Dulbecco » s sène sin tamponné phosphate modifiéSigma AldrichD8537
Analyse ICE d’EditCohttps://ice.editco.bio/#/consulté le 06.04.2025
Solution EDTA 0,5M, pH = 8AppliChemA4892,0500
Ensembl  ; https://www.ensembl.org/index.htmlconsulté le 09.06.2025
Bromure d’ethidiumBiolabmixEtBr-10
Gouttes de gel oculaire » Oftagel »URSAPHARM204604
Système de documentation en gel ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
In-Silico PCR V39x1 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr  ; consulté le 09.06.2025
Technologies ADN intégrées & nbsp ;https://eu.idtdna.comconsulté le 09.06.2025
Ciseaux microchirurgicauxMedin URALM124
Électroporateur NEPA21Gène NepaNEPA21Avec une électrode CUY652P2,5X4
NTP Set, 100 mM SolutionThermo ScientificR0481
OligonucléotidesEvrogenOrdre direct, purification standard par désalage
Médium sérique réduit Opti-MEM IThermo Fisher31985070
PerlPrimerhttps://perlprimer.sourceforge.netVersion 1.1.21.
Phusion ADN polymérase haute fidélité (2 U/&mu ; L)Thermo ScientificF530L
Pointes pipette 10 uLUlplastHT-10-960
Pointes de pipette 1000 uLUlplastHT-1000-576
Pointes pipette 200 uLUlplastHT-200-960
Alimentation électrique " Elf-4"Technologie ADNPS-400 NOUVEAU
Eau sans ARNSE/ADNaseInvitrogen10977049
Solution salinePanEcoP011n
Système d’électrophorèse horisontale SE-1HeliconSE-1
Hydroxyde de sodiumSigma-AldrichS5881-500G
Échelle ADN Step100BiolabmixS-8100
SMZ1000 stéréomicroscopeNikon5-363376
Micropipetteur décapantCooperSurgicalMXL3-STR
Embouts de strip-teaseuseORIGIOMXL3-125
Aiguille chirurgicale & nbsp ;KMIZ4A1- 0,6 et fois ; 20
Pinces de sutureMedin URALM302.2
Pinces de sutureMedin URALM303
Fil de suture POLYCON Nfigure-materials-10Tonzos 95234
Guide SYNTHEGO Knockout Design & nbsp ;https://design.synthego.com/#/consulté le 09.06.2025
Amplificateur T100BioRad10014822
T7 ARN polymérase   ;Thermo ScientificEP0111
Tampon TBE 10xBiolabmixTBE-500
Tide  ;https://tide.nki.nl/consulté le 06.04.2025  ;
Tris chlorhydrateSuzhou Yacoo ScienceSYS-S0005-0.5
Solution d’hydrochlorure de TrizmaSigma AldrichT2663
Réactif de TrizolInvitrogen15596026
Protéine Cas9 TrueCutInvitrogenA36499
Ciseaux universelsMedin URALM147
XylazineInterchemie Werken de AdelaarIX2
ZoletilLaboratoire Virbac2000443714739.00

Références

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Mots-clés

CRISPR Cas9Complexe ribonucl oprot iquelectroporation de zygotesS quen age de SangerConception d ARN guideG notypage par PCR

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