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Article de méthode

Transection du ligament croisé antérieur et lavage du liquide synovial dans un modèle de rongeur pour étudier l’inflammation articulaire et l’arthrose post-traumatique

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DOI :

10.3791/68713

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2 septembre 2025

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1Department of Orthopaedic Surgery, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Dans cet article, nous décrivons une méthode chirurgicale pour transecter le ligament croisé antérieur (LCA) en tant que modèle fiable pour induire l’arthrose du genou chez les rongeurs et des méthodologies pour prélever du liquide synovial du genou, mesurer l’œdème du genou et évaluer la gravité de l’arthrose.

Résumé

L’arthrose est une maladie articulaire caractérisée par des douleurs chroniques et n’existe actuellement aucun remède. Un sous-ensemble de l’arthrose, l’arthrose post-traumatique (APTO), peut survenir après une blessure articulaire. Le genou est l’une des articulations les plus touchées, et parmi les blessures au genou, les blessures au LCA sont parmi les plus courantes. L’arthrose symptomatique, qui s’accompagne de modifications de l’articulation telles que la dégradation du cartilage et la formation d’ostéophytes, peut se développer des années après la blessure initiale, mais des modifications articulaires précoces peuvent être détectées peu de temps après. L’inflammation est considérée comme l’un des facteurs contribuant au développement de la PTOA, et les médiateurs pro-inflammatoires produits en réponse à une blessure peuvent catalyser le développement de la PTOA. Dans les modèles animaux, la blessure chirurgicale des structures du genou est une méthode d’induction de l’arthrose largement utilisée, et une technique chirurgicale courante est la section d’un LCA (ACLT). Le but de cette étude est de décrire notre technique ACLT pour l’induction de l’arthrose, ainsi que les méthodes de surveillance de l’inflammation articulaire et de quantification de la gravité de l’arthrose. Pour évaluer l’inflammation post-opératoire, nous décrivons une technique de mesure de l’œdème du genou ainsi qu’une technique de prélèvement et d’analyse du liquide synovial du genou. Pour évaluer les changements articulaires à long terme associés à l’arthrose, nous présentons un système de notation semi-quantitatif que nous avons développé pour évaluer la gravité de l’arthrose via l’imagerie microCT.

Introduction

Le ligament croisé antérieur (LCA) est une structure critique de l’articulation du genou, assurant la stabilité et empêchant un mouvement excessif vers l’avant du tibia par rapport au fémur1. Les blessures au LCA sont parmi les blessures au genou les plus courantes, en particulier dans les sports qui impliquent des arrêts soudains, des sauts ou des changements de direction2. Ces blessures peuvent aller de déchirures partielles à des ruptures complètes et nécessitent souvent une intervention chirurgicale pour une récupération optimale3. Cependant, même après un traitement chirurgical, les lésions du LCA entraînent souvent des changements articulaires à long terme, notamment l’usure chondrale, la formation d’ostéophytes et des altérations structurelles de l’os sous-chondral. Ces changements contribuent collectivement à la dégénérescence articulaire, communément appelée arthrose post-traumatique (PTOA)4,5.

Alors que la progression de la lésion initiale du LCA à la PTOA symptomatique peut s’étendre de 2 ans à 20 ans après la blessure, les changements articulaires précoces peuvent être détectés en quelques semainesseulement. L’une des principales caractéristiques de ces changements précoces est la présence élevée de cytokines inflammatoires (par exemple, l’interleukine (IL)-1, l’IL-6, le facteur de nécrose tumorale (TNF)) et de marqueurs de dégradation de la matrice extracellulaire (par exemple, les métalloprotéinases (MMP) et CTX-II). L’évaluation de ces marqueurs d’inflammation et de dégradation par le liquide synovial fournit des informations cruciales sur les phases aiguës et chroniques de la pathologie articulaire. Par exemple, les niveaux d’IL-1 et d’IL-6 atteignent un pic dans le liquide synovial de l’articulation blessée au cours du premier mois suivant la blessure. Bien que ces niveaux diminuent avec le temps, ils reviennent rarement au niveau normal de base, même des années après le traitement 10,11,12. Cette réponse pro-inflammatoire initiale déclenche une cascade de lésions articulaires, notamment l’inflammation synoviale, la dégradation du cartilage et les altérations biomécaniques, perpétuant la dégradation des tissus et accélérant la dégénérescence articulaire13. De plus, l’inflammation aiguë suite à une lésion du LCA entraîne souvent un épanchement articulaire et un œdème du genou, illustré par l’enflure et l’accumulation de liquide dans l’articulation14.

Pour reproduire les lésions du LCA et étudier la progression de la PTOA, le modèle de transsection du LCA induite chirurgicalement (ACLT) chez la souris est largement utilisé15,16. Ce modèle consiste à couper le LCA pour simuler une blessure et à évaluer les conséquences biologiques et mécaniques qui en résultent. Le modèle ACLT est un outil précieux pour étudier la réponse inflammatoire, la dégradation du cartilage et les altérations biomécaniques après une blessure, permettant de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires à l’origine de la PTOA. De plus, il permet d’évaluer des stratégies thérapeutiques visant à atténuer la dégénérescence articulaire et à préserver la fonction. Chez l’homme, l’analyse du liquide synovial est largement utilisée pour surveiller l’inflammation et la dégradation du cartilage au fil du temps, car l’obtention de liquide synovial est relativement simple17,18. Cependant, chez la souris, il est difficile de collecter du liquide synovial après une blessure. Dans ce manuscrit, nous décrivons notre technique chirurgicale pour l’ACLT et une méthode de lavage du genou pour le prélèvement de liquide synovial afin d’évaluer les marqueurs inflammatoires et dégradants. Nous présentons également une méthode de mesure de la taille du genou afin de quantifier l’œdème suite à une blessure articulaire. De plus, nous décrivons notre méthode d’évaluation microCT pour évaluer la gravité de la PTOA post-ACLT. Ces approches fournissent des outils complémentaires pour évaluer les effets aigus et chroniques des lésions du LCA dans un cadre préclinique.

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Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été menées conformément aux Lignes directrices pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Brigham and Women’s Hospital.

1. Préparation des animaux

REMARQUE : Le choix du sexe de la souris doit s’aligner sur les objectifs de l’étude, car même si l’ACLT induit de manière fiable la PTOA chez les deux sexes, la gravité et la progression peuvent différer.

  1. Préparation de l’anesthésie : Préparez à l’avance la solution anesthésique de kétamine-xylazine (KX).
    REMARQUE : Une anesthésie par inhalation (2 % d’isoflurane) peut également être utilisée.
  2. Contrôles chirurgicaux : Utiliser un groupe distinct d’âge apparié et opéré par placebo comme contrôle chirurgical.
    REMARQUE : Le genou controlatéral ne doit pas servir de simulacre de contrôle, car cela pourrait soulever des préoccupations en matière de bien-être animal. Cependant, il peut être utilisé comme un contrôle sain et non blessé pour établir les conditions articulaires de base dans des analyses appariées.
  3. Sélection de l’âge de l’animal : Utilisez des souris de 8 semaines pour refléter l’âge typique auquel les déchirures du LCA se produisent le plus souvent. Cependant, toute souris squelettique mature peut subir cette procédure.

2. Soins préopératoires

REMARQUE : Si les souris sont transportées d’un autre établissement, laissez-leur au moins 1 semaine pour s’acclimater à leur nouvel environnement avant d’effectuer une intervention chirurgicale.

  1. S’assurer que la chirurgie est effectuée de manière aseptique, avec toutes les surfaces stérilisées (p. ex., en utilisant des champs stériles pour couvrir les zones chirurgicales), et s’assurer de l’utilisation d’instruments stériles et d’équipement de protection individuelle (EPI) chirurgical approprié.
  2. Induire l’anesthésie en administrant une injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg).
  3. Une fois anesthésié, appliquez un lubrifiant pour les yeux et rasez la fourrure sur le genou à opérer, en couvrant l’avant et les côtés latéraux du tibia à mi-cuisse à l’aide d’une petite tondeuse à cheveux.
    REMARQUE : Le choix du genou postérieur est à la discrétion du chercheur, en fonction de la facilité de la chirurgie
  4. Assurez-vous que la souris est complètement anesthésiée et qu’elle ne répond pas au réflexe de pincement des orteils.
  5. Désinfectez la peau exposée en appliquant un nettoyant antibactérien (par exemple, de la bétadine et de l’alcool à 70 %).
  6. Administrer un analgésique opioïde (p. ex. 0,05 mg/kg de buprénorphine) par voie sous-cutanée pour une analgésie préventive.
    REMARQUE : L’analgésique doit être soit une formule à libération prolongée pour fournir un effet analgésique pendant 72 heures après la chirurgie, soit être administré régulièrement pendant cette période pour atténuer la douleur pendant la récupération.
  7. Administrer un AINS (p. ex., 5 mg/kg de méloxicam) comme recommandé, à moins que l’administration d’AINS n’interfère avec le résultat d’intérêt.
  8. Placez la souris sur sa face dorsale sous un microscope à dissection. Assurez-vous que le genou à opérer est tourné vers le haut et dans le champ de vision du microscope.
  9. Couvrez la souris avec un rideau stérile, en laissant une petite ouverture en trou de serrure.
  10. Positionnez la jambe à opérer avec le genou fléchi à environ 90° avec la rotule vers le haut. Utilisez un ruban chirurgical pour maintenir le genou en position fléchie.

3. Transection du ligament croisé antérieur

  1. Ajustez le microscope pour faire la mise au point sur la rotule.
  2. À l’aide d’une pince, pincez la peau sur la rotule et faites une petite incision longitudinale médiane sur le genou à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Prolongez l’incision à environ 1 cm et rétractez la peau pour exposer le tendon rotulien (Figure 1A).
  3. Fléchissez le genou à environ 120°. Utilisez la main non dominante pour maintenir la flexion du genou et pour maintenir les bords de la peau rétractés, facilitant ainsi la visualisation du tendon rotulien (Figure 1B).
  4. Identifiez le bord médial du tendon rotulien et faites une incision avec une lame n° 11 le long de cette marge, s’étendant de son point médian au pôle supérieur de la rotule pour ouvrir la capsule articulaire (Figures 1C-E).
    REMARQUE : En cas de saignement, appliquez une légère pression avec un coton-tige stérile pendant 5 à 10 s pour contrôler l’hémostase.
  5. À l’aide d’une pince à bout émoussé, saisissez doucement le tendon rotulien, soulevez-le légèrement vers le haut et déplacez-le latéralement pour disloquer la rotule et exposer complètement l’articulation du genou (figure 1F).
  6. À ce stade, le coussinet adipeux infrapatellaire (PFP) sera visible (Figure 2A). À l’aide d’une pince à bout émoussé, déplacez doucement la partie médiale de l’IFP pour exposer le LCA tout en préservant l’intégrité de l’IFP (Figure 2B).
    REMARQUE : L’élimination complète de l’IFP est évitée, car elle joue un rôle dans la production de marqueurs inflammatoires. Étant donné que ce modèle se concentre sur l’étude de la réponse inflammatoire à la suite d’une lésion qui conduit à la PTOA, il est préférable de conserver l’IFP. En cas de saignement, appliquez une légère pression avec un coton-tige stérile pendant 5 à 10 secondes pour contrôler l’hémostase.
  7. Tout en maintenant le genou à une flexion de 120°, identifiez le LCA, qui s’étend de la surface interne du condyle fémoral latéral jusqu’au centre du plateau tibial (Figure 2C, D).
  8. À l’aide de ciseaux microchirurgicaux, transectez soigneusement le LCA sous visualisation au microscope, en vous assurant que le cartilage environnant, le ménisque et les autres ligaments restent intacts (Figure 2E). Le modèle ACLT est terminé à ce stade. Dans certains cas, les restes de l’ACL transecté peuvent être visualisés (Figure 2F).
  9. Confirmez la section du LCA en effectuant un test de tiroir antéro-postérieur. Fléchissez le genou à environ 90°, stabilisez le tibia proximal avec les doigts et utilisez une pince à pointe émoussée pour appliquer doucement une force postérieure sur le fémur distal. La traduction postérieure du fémur distal confirme l’efficacité de l’ACLT (Figure 3).
  10. Repositionnez la rotule et le tendon rotulien dans leur position anatomique en les soulevant légèrement et en les déplaçant médialement (Figure 4A, B). Fermez la capsule articulaire avec un seul point de suture à l’aide de sutures résorbables 6-0, en fixant le muscle entourant la rotule au tissu musculaire médial adjacent. Ensuite, fermez la peau avec 2-3 points de suture à l’aide de sutures résorbables 6-0 (Figure 4C).
  11. Pour une chirurgie simulée, effectuez la même procédure, mais sans transecter le LCA. Ouvrez la capsule articulaire et disloquez la rotule et l’IFP comme décrit. Visualisez le LCA sans le transecter, puis replacez la rotule et l’IFP, et fermez la capsule articulaire et la peau.

4. Soins postopératoires

  1. Après l’opération, placez la souris sur un coussin chauffant et laissez-la récupérer de l’anesthésie jusqu’à ce qu’elle soit complètement consciente.
  2. Une fois que la souris est complètement ambulatoire, transférez-la dans une cage propre avec une litière fraîche pour la récupération.
  3. Pendant les 72 premières heures suivant la chirurgie, surveillez étroitement la souris pour détecter des signes de douleur ou de détresse, y compris : des changements de poids corporel (généralement pas plus de 5 % de diminution), un toilettage réduit ou excessif autour du site d’incision, des signes de détérioration de l’état de santé général (comme une posture voûtée, une grimace faciale ou une respiration anormale) et une infection de la plaie (y compris un gonflement, écoulement ou déhiscence de la plaie). Si le méloxicam est utilisé, administrez-le toutes les 24 h pendant 48 h.
  4. Après les 72 premières heures suivant la chirurgie, maintenez la souris comme d’habitude jusqu’au point final d’intérêt en fonction de la conception de l’étude.

5. Évaluation de la taille du genou (œdème)

  1. Évaluez l’œdème du genou en mesurant la largeur médio-latérale du genou à l’aide d’un pied à coulisse Vernier (un pied à coulisse numérique avec une molette de réglage fin est recommandé pour des mesures précises et contrôlées). Mesurer un animal vivant ou post-mortem. Fermez progressivement l’étrier jusqu’à ce qu’il entre en contact avec les bords médial et latéral du genou.
    REMARQUE : Bien que l’étrier doive être bien ajusté, il faut veiller à éviter d’appliquer une pression excessive, car cela pourrait comprimer le genou et réduire artificiellement la largeur mesurée, entraînant des résultats inexacts. L’objectif est de maintenir l’étrier correctement ajusté sans comprimer visiblement le genou. Le serrage doit s’arrêter une fois que d’autres ajustements commencent à diminuer la mesure de la taille du genou (Figure 5).
  2. Placez l’animal anesthésié ou euthanasié dorsalement sur une surface plane, en vous assurant que le genou est tourné vers le haut. Fléchissez le genou à environ 90° et maintenez cette position. Pour maintenir le genou en flexion, fixez la jambe à l’aide d’un ruban chirurgical ou, si vous effectuez une post-euthanasie, d’une goupille de dissection. Mesurez la largeur du genou à l’aide de l’étrier comme décrit.
  3. Sinon, si l’anesthésie n’est pas préférée, prenez des mesures avec plusieurs personnes afin qu’une personne puisse retenir doucement l’animal pendant que l’autre obtient des mesures de la largeur du genou.
  4. Pour garantir la fiabilité, mesurez chaque genou au moins deux fois. Appliquez la même technique aux genoux blessés et aux genoux controlatéraux (non blessés). Rapportez les données sous forme de différence entre les deux genoux (taille delta du genou), et non sous forme de valeurs absolues, ce qui réduit la variabilité due à la technique de mesure et aux variations de la taille de la souris individuelle.

6. Prélèvement de liquide synovial (lavage de l’articulation du genou)

  1. Euthanasier l’animal à l’aide d’une méthode approuvée, conformément aux réglementations nationales en matière de licence, aux directives locales et aux protocoles expérimentaux. Dans cette étude, l’euthanasie a été réalisée par asphyxie au CO2 suivie d’une luxation cervicale.
  2. Exposez l’articulation du genou en faisant une incision longitudinale antérieure sur le genou, en disséquant la peau et les tissus sous-jacents pour exposer complètement le tendon rotulien et la rotule.
  3. À l’aide d’une lame n° 11, ouvrir la capsule articulaire le long de la face médiale du ligament rotulien qui s’étend de son point médian jusqu’au bord supérieur de la rotule (figures 6A, B).
  4. Déplacez la rotule en la déplaçant doucement latéralement pour accéder à l’espace articulaire, en prenant soin de ne pas endommager les structures environnantes.
  5. Fléchir le genou à environ 120° pour s’assurer que la cavité articulaire est bien positionnée pour le lavage afin de faciliter la collecte du liquide synovial (figure 6C).
  6. Préremplissez un tube avec 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à température ambiante.
  7. À l’aide d’une pipette P10, effectuer des lavages du genou en série avec 2,5 μL de PBS à température ambiante (Figure 6D-F) et ajouter au tube prérempli, pour un total de 8 répétitions. Le volume cumulé de liquide de lavage du genou doit atteindre 120 μL.
  8. Centrifuger le liquide de lavage du genou à 4 °C pendant 5 min à 240 g pour séparer les composants cellulaires du surnageant.
    REMARQUE : Les composants cellulaires peuvent être utilisés pour le comptage cellulaire, l’analyse CytoSpin ou la cytométrie en flux. Pour l’analyse par cytométrie en flux, il peut être nécessaire de regrouper des échantillons provenant de plusieurs animaux afin d’obtenir suffisamment de cellules pour une analyse précise.
  9. Stocker le surnageant à -80 °C pour une analyse ultérieure.
    REMARQUE : Dans cette étude, le surnageant a été utilisé pour l’analyse multiplex des cytokines pro-inflammatoires et des métalloprotéases matricielles (MMP).

7. Analyse MicroCT (gravité de la PTOA dans le fémur distal)

  1. Préparation de l’échantillon : Après avoir recueilli le liquide synovial, prélevez les articulations tibio-fémorales en disséquant soigneusement le fémur distal et le tibia proximal, en veillant à ce que l’intégrité de l’articulation soit préservée.
    REMARQUE : Retirez l’excès de tissu musculaire entourant le genou, mais prenez soin de préserver l’intégrité de la structure osseuse. Préserver le tissu synovial si la synovite est analysée par histologie ; récolter indépendamment si les marqueurs pro-inflammatoires sont évalués par qPCR.
  2. Fixer les échantillons dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) à 4 °C pendant 5 jours. Transférez-les dans de l’éthanol à 70 % et conservez-les à 4 °C.
  3. Effectuez des scintigraphies microCT haute résolution en utilisant les paramètres suivants : taille de voxel isotrope de 7 μm, tension du tube à rayons X de 55 kVp, courant de 0,145 mA, temps d’intégration de 600 ms par projection.
  4. Après la numérisation, exportez les données microCT sous forme de fichiers DICOM pour une analyse plus approfondie.
  5. Chargez des fichiers DICOM dans un logiciel de traitement d’images pour la visualisation, la reconstruction 3D et l’analyse.
  6. Utilisez l’outil de reconstruction 3D pour évaluer toutes les régions du genou et, dans la vue sagittale du fémur distal, identifier quatre régions d’intérêt (ROI) de la partie postérieure à la partie antérieure pour l’évaluation (Figure 9)19 La partie postérieure de la plaque de croissance, la face postérieure du pic de la plaque de croissance, la face antérieure du pic de la plaque de croissance, et auge antérieure de la plaque de croissance.
  7. Une fois qu’un retour sur investissement est identifié, sélectionnez une image correspondante dans la vue coronale. Répétez l’opération pour chaque retour d’intérêt pour un total de quatre images pour chaque articulation tibio-fémorale.
  8. Enregistrez les images sous forme de fichiers à l’aveugle pour une analyse impartiale.
  9. Grade de gravité de la PTOA sur les images microCT coronales comme indiqué précédemment19. En bref, ce système de notation semi-quantitatif évalue l’asymétrie fémorale, la présence et la taille des ostéophytes et l’aplatissement du condyle fémoral à quatre endroits anatomiques. Ensuite, notez chaque site sur une échelle de 0 à 6, 6 étant le plus grave, pour un score total possible de 24. Demandez à au moins deux examinateurs indépendants en aveugle de noter le site et de faire la moyenne des notes pour obtenir la note finale.
    REMARQUE : Deux examinateurs indépendants doivent évaluer les images microCT, et les examinateurs doivent être à l’insu des conditions expérimentales pour réduire le biais. Le score final de la PTOA est déterminé en faisant la moyenne des notes des deux examinateurs.

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Résultats

La procédure ACLT est une méthode chirurgicale efficace et reproductible pour induire l’arthrose dans le genou du rongeur. Après que la procédure ACLT ait été réalisée dans des conditions stériles, les souris n’ont montré aucun signe de détresse ou d’infection au site d’incision et se sont déplacées librement sans signes de boiterie dans le membre opéré.

La taille du genou a été mesurée pour surveiller l’œdème du genou après l’ACLT (Figure 7A). Pour contrôler la v...

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Discussion

Cette description de technique fournit une méthode chirurgicale détaillée pour induire des lésions du LCA chez la souris en transectant le LCA, offrant un modèle contrôlé pour l’étude du PTOA. Le modèle chirurgical ACLT est une approche préclinique largement utilisée pour induire l’APPA et reproduit efficacement les principales caractéristiques pathologiques observées dans les lésions du LCA humain, notamment l’altération de la biomécanique articulaire, l’inflammation synoviale et la dég...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS)CytivaSH30256.02
4 % de paraformaldéhydeFisher ScientificAAJ19943K2
70 % d’éthanolFisher ScientificBP82031GAL
Sutures résorbables 6-0Approvisionnement vétérinaire Patterson07-893-1916
Pince à bout émoussé  ;Outils scientifiques fins11051-10
Cotons-tigesFisher Scientific22-029-685
Microscope de dissectionMicrosystèmes LeicaM165 FC
RasoirBraintree Scientific  ;Référence CLP-9961
Lingettes à l’éthanolFisher Scientific22-246073
Ethiqa XR (Buprénorphine SR)Covertus721171,3 mg/mL
Lubrifiant pour les yeuxApprovisionnement vétérinaire PattersonNC1701236
Ciseaux finsOutils scientifiques fins14061-10
Coussin chauffantFisher ScientificNC1061604
HorosHoroshorosproject.org
L’isoflurane  ;Approvisionnement vétérinaire Patterson07-890-8115
KétamineApprovisionnement vétérinaire Patterson07-890-8598
MéloxicamApprovisionnement vétérinaire Patterson07-893-75655 mg/mL
Dosage multiplexMesoScaleDiscoveryK15069M-1
Porte-aiguilleCodman36-2000
Scalpel n° 11Outils scientifiques fins10011-00
Pipette P10GilsonF144055M
Pointes de pipette P10Fisher Scientific02-707-439
Écouvillon povidone-iodeMedlineMDS093901ZZ
Scanco Medical & micro ; Système CT-35Scancohttps://www.scanco.ch/systems-overview.html7&thinsp ; et micro ; m taille du voxel, 55 kVp, 0,145&thinsp ; mA, 600&thinsp ; ms
Champs stérilesMcKesson General MedicalNC2032042
Masque chirurgicalFisher Scientific18-048-010
Gants chirurgicauxEncore7823PF
Ruban chirurgicalApprovisionnement vétérinaire Patterson07-888-0614
SeringuesBD3096231 mL
Ciseaux à ressort VannasInstruments de précision mondiaux501778Lames de 3 mm
Vernier capilerNeiko  ;Référence 01407A
Xylazine  ;Approvisionnement vétérinaire Patterson07-893-8424

Références

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