Optimisation et évaluation du dessin à la main et du filage humide pour la production de fibres de soie d’araignée recombinante

Résumé

Le protocole présenté fournit un ensemble polyvalent de méthodes pour optimiser la solubilisation des protéines de soie recombinantes pour la filature ; tester la filature par dessin à la main ; produire des fibres longues et continues grâce à la filature humide automatisée ; et évaluer comparativement la morphologie, l’alignement moléculaire, le comportement mécanique et le contenu structurel secondaire des protéines de ou dans les fibres.

Résumé

Les soies d’araignée sont réputées pour leurs propriétés mécaniques, avec une résistance élevée, une extensibilité élevée ou une combinaison de ceux-ci conduisant à une ténacité élevée. Une araignée femelle typique qui tisse des orbes produit sept types différents de soie, chacun généralement filé à partir de protéines spécifiques à un type spécifique et conçu mécaniquement pour une fonction de survie distincte. La production de soie d’araignée recombinante offre une voie prometteuse pour obtenir ces matériaux, en contournant les défis liés à l’obtention de grandes quantités de soies naturelles et en offrant des avantages en permettant la personnalisation des protéines, par exemple, par mutagénèse dirigée vers le site ou construction de protéines de fusion.

Dans le protocole présenté, nous décrivons une méthodologie pour évaluer l’aptitude des protéines à la filature par des approches d’étirage à la main et de filage humide. À partir d’une poudre de protéine lyophilisée convenablement purifiée, des méthodes d’optimisation de l’état initial de la protéine solubilisée pour fournir un état de « spinning dope » à haute concentration sont détaillées. Ensuite, les approches de dessin à la main et de filage humide sont comparées, y compris une discussion sur les méthodes de modulation du comportement des fibres à l’aide d’un dessin post-spin dans le cadre du processus de filage. Un flux de travail typique pour caractériser les fibres de soie résultantes et prendre une décision sur les conditions de filage les plus susceptibles d’être fructueuses est ensuite détaillé, y compris la microscopie optique pour évaluer le diamètre de la fibre et son uniformité ; microscopie à lumière polarisée pour estimer le degré d’alignement (supra)moléculaire obtenu au sein de la fibre ; essais de traction pour évaluer la résistance, l’extensibilité, le module de Young et la ténacité ; et la spectromicroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) pour évaluer la structuration secondaire des protéines dans la fibre.

Ce protocole s’est avéré adapté à plusieurs protéines de soie d’araignée recombinante différentes basées sur des domaines répétitifs et non répétitifs de soie aciniforme (enveloppante) ; soie pyriforme ; et des protéines de fusion comprenant de la soie aciniforme, pyriforme et/ou de la soie à ampoule majeure (dragline). Une applicabilité plus large est fournie par plusieurs étapes mises en évidence au cours desquelles les conditions et les paramètres peuvent être modifiés pour s’adapter au comportement d’une protéine individuelle et pour obtenir des différences dans les résultats fonctionnels.

Introduction

Les araignées produisent des soies pour diverses tâches spécialisées, notamment la construction de toiles, la capture de proies et la protection des œufs¹. Les soies d’araignée présentent des propriétés mécaniques exceptionnelles qui dépassent celles de la plupart des matériaux naturels et synthétiques connus², ce qui a suscité des efforts considérables vers la production de matériaux en soie d’araignée conçus et améliorés pour diverses applications industrielles et biomédicales. La spirdroïne, la protéine qui forme la soie d’araignée, est composée d’un domaine répétitif relativement grand délimité par des domaines N-terminal et C-terminal non répétitifs³, les propriétés mécaniques uniques de certains types de soie ayant été liées à la répétition de motifs courts dans le domaine répétitif ^4,5,6. Contrairement au ver à soie du mûrier (Bombyx mori) cultivé commercialement, qui produit de grandes quantités de soie dans un format de cocon cohérent adapté à la récolte, les araignées sont des organismes intrinsèquement cannibales et territoriaux qui produisent de la soie en quantités limitées, posant ainsi un défi pour la production et la collecte agricoles⁷. Compte tenu de ces limitations, la production de soie d’araignée recombinante a été développée comme une alternative plus réalisable et durable pour obtenir de manière contrôlée des quantités suffisantes de soie d’araignée pour l’application.

La production de soie d’araignée recombinante nécessite la sélection d’un hôte approprié pour l’expression des protéines. La soie d’araignée a été exprimée dans divers systèmes hôtes, y compris les bactéries ^8,9, les levures^10,11, les cellules d’insectes¹², les plantes^13,14 et les cellules de mammifères^15,16, Escherichia coli étant le système hôte le plus couramment utilisé. Les poids moléculaires élevés des spidroïnes, qui peuvent atteindre jusqu’à 700 kDa⁷, présentent des défis importants pour l’expression de constructions pleine longueur. Pour produire de la soie d’araignée recombinante avec des propriétés comparables ou améliorées par rapport à celles des soies d’araignée naturelles, la principale stratégie employée est l’expression de variantes tronquées, telles que des constructions avec un nombre limité d’unités répétées (avec ou sans domaines non répétitifs), des chimères composées de combinaisons de différents types de soie et des soies hybrides fusionnées avec des protéines non liées à la soie. Par exemple, la spidroïne majeure recombinante (284,9 kDa) a été exprimée avec succès dans un E. coli métaboliquement modifié, et la soie résultante présentait des propriétés mécaniques comparables à celles de la soie naturelle de l’ampulaire majeure⁹. De plus, une fibre de soie technique composée de deux unités répétées de spidroïne pyriforme et de deux unités répétées de spidroïne aciniforme a démontré une extensibilité supérieure à l’une ou l’autre des soies pyriformes ou aciniformes constitutives, comparable à celle de la soie flagelliforme naturelle¹⁷.

La production de protéines recombinantes permet également d’incorporer facilement des peptides fonctionnels ou des segments de protéines dans des protéines de soie, ce qui permet de fabriquer des biomatériaux aux propriétés adaptées à des applications spécifiques. Par exemple, la fusion génétique et chimique des motifs de liaison cellulaire RGD avec une soie génétiquement modifiée dérivée de spidroïnes ampulaires majeures a donné lieu à des films qui ont considérablement amélioré l’adhésion et la prolifération des fibroblastes¹⁸. Dans une étude distincte, il a été démontré qu’une construction de soie hybride composée d’un motif de liaison au facteur de croissance nerveuse β (NGF) fusionné à une protéine chimérique comprenant deux unités répétées de spidroïne aciniforme et le domaine C-terminal d’une spidroïne ampulaire majeure favorise la croissance et la différenciation des cellules neuronales¹⁹.

Si l’expression et la purification d’une protéine de soie recombinante sont réussies, celle-ci peut ensuite être transformée sous diverses formes telles que des hydrogels, des films, des fibres, des nanoparticules, des mousses et des éponges, en fonction de l’application^prévue. Pour permettre la production de fibres de soie artificielles, des méthodes de filage qui imitent certains aspects du processus de filage des fibres naturelles des araignées, très complexe et étroitement réglementé, ont été développées. Dans la soie ampulaire majeure naturelle, les spidroïnes sont produites par les cellules épithéliales de la glande ampulaire majeure et stockées à l’état soluble dans la lumière à des concentrations élevées (jusqu’à 50 % (p/v)^)22, formant une dope aqueuse. Au fur et à mesure que la drogue en rotation se déplace dans le conduit de rotation, elle subit des changements de pH, de concentration d’ions, de teneur en eau et de forces de cisaillement dues à la fois au rétrécissement du conduit et au processus de pultrusion des fibres, ce qui induit la transformation des protéines de soie liquides en fibres solides^23,24. L’identification d’un solvant approprié capable de solubiliser ou de suspendre les protéines de soie recombinantes à haute concentration pour former une dope de filature est donc une première étape essentielle dans le processus de filage de fibres artificielles.

Une large gamme de solvants a été utilisée pour la formulation de dopes de filage de protéines de soie, et il a été démontré que le choix du solvant influence la formation des fibres et les propriétés mécaniques^25,26. Par conséquent, il est essentiel d’examiner attentivement la sélection du solvant pour optimiser les caractéristiques de la fibre résultante. Les dopes à filer peuvent être formulés à l’aide de solvants organiques ou aqueux, tels que le 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol (HFIP)²⁷, l’hexafluoroacétone (HFA)²⁸, des mélanges d’acide trifluoroacétique (TFA) et de 2,2,2-trifluoroéthanol (TFE)²⁶, d’acide formique²⁹ et de phosphate de sodium/tampon Tris³⁰. Étant donné que la solubilité des protéines est généralement influencée par des facteurs tels que le pH, la force ionique et la concentration, l’identification d’un solvant dotant approprié implique généralement une évaluation systématique de divers solvants, l’optimisation du pH et des concentrations de protéines et, dans certains cas, l’utilisation de mélanges solvant-eau pour déterminer les conditions optimales de dopage en rotation. De plus, la viscosité de la dope en filature est un paramètre important à évaluer avant le processus de filage, car une solution de dopage très visqueuse peut entraver l’écoulement du fluide pendant la filature, tandis qu’une dope insuffisamment visqueuse ne conviendra généralement pas à la formation de fibres^31,32. Il convient de noter que l’utilisation de conditions difficiles de dope par centrifugation peut altérer la structure des protéines lors d’une exposition prolongée ; Par conséquent, le développement de solvants de dopage respectueux de l’environnement reste un domaine de recherche actif.

L’étirage à la main et le filage humide sont deux méthodes courantes de filage de fibres de soie recombinantes. Les propriétés mécaniques des fibres produites à l’aide de chaque méthode dépendent fortement à la fois des conditions de filage elles-mêmes et du traitement post-filage. L’étirage à la main, également appelé filage d’étirage, est une méthode simple de production de fibres dans laquelle les fibres sont extraites de solutions de protéines purifiées, normalement à l’aide d’une pointe de pipette, d’une pince ou d’une pince à épiler, suivie d’un séchage à l’air et d’une caractérisation 33,34,35,36,37. Bien que le dessin à la main constitue une excellente approche pour cribler rapidement une variété de conditions de formation de fibres de soie et classer généralement le comportement mécanique des fibres résultant, cette technique n’est pas facilement adaptable aux fibres continues longues (c’est-à-dire de plusieurs mètres de longueur). Comme alternative, nous utilisons le filage humide, qui applique l’extrusion continue d’un produit en rotation à une vitesse constante dans un bain de coagulation, généralement un solvant aqueux ou organique composé d’un mélange d’eau et d’éthanol ou de méthanol 9,15,31,38,39,40 . L’immersion de la dope en rotation dans le bain de coagulation provoque une désolvatation rapide des protéines, entraînant la formation de fibres continues²⁴. Par la suite, les fibres sont tirées du bain de coagulation à une vitesse constante, soit adaptées à la vitesse d’extrusion pour fournir des fibres as-spun (AS), soit soumises à un tirage post-spin pour fournir des fibres post-filées (PS) qui ont généralement des propriétés mécaniques améliorées. Le tirage post-spin implique généralement l’étirement des fibres à un rapport de 2 à 8 fois leur longueur d’origine dans l’air, dans un solvant ou après immersion dans un solvant, chaque paramètre contribuant à des propriétés mécaniques spécifiques 15,17,31,38.

Bien que ce protocole se concentre sur les méthodes de dessin à la main et de filage humide, il est important de replacer ces méthodes dans leur contexte. Des méthodes d’électrofilage ont été signalées pour des soies d’araignée recombinantes dans des conditions aqueuses et organiques, permettant la production de tapis de fibres, de fibres alignées et de fils, les fibres étant généralement à l’échelle nanométrique en diamètre⁴¹. Cela offre l’avantage potentiel des fibres à l’échelle nanométrique, et le défi correspondant si des fibres à l’échelle du micron sont souhaitées, généralement avec la nécessité d’effectuer un traitement post-spin pour induire une transformation en structure à β feuille afin d’améliorer la mécanique et la compatibilité avec l’eau. Des rubans de soie d’araignée recombinante multimètres de largeur et d’épaisseur à l’échelle du micron ont été obtenus par filage à sec à partir de solvant organique⁴², avec la démonstration récente que l’incorporation d’ions métalliques au stade de dope de spin améliore la mécanique⁴³. Le filage⁴⁴ basé sur la microfluidique, y compris une combinaison récente de technologie d’impression 3D avec des filières à micro-aiguilles conçues pour imiter le filage naturel⁴⁵, convient à la filature de fibres de soie recombinantes hautement contrôlables. Nonobstant la grande variété de méthodes signalées comme convenant à la production de fibres de soie (ou de fibres similaires à la soie), le présent protocole détaille la production de fibres de soie recombinante par étirage à la main et filage humide, car ces méthodes se sont avérées transposables à plusieurs variantes différentes de soie recombinante entre nos mains et fournissent un point de départ facile pour le développement de biomatériaux et l’évaluation comparative.

Après le filage et la collecte des fibres, une combinaison de techniques optiques, mécaniques et spectroscopiques est couramment utilisée pour caractériser les propriétés après le filage. Chaque méthode fournit des informations clés sur le processus de formation des fibres et sa corrélation avec les performances des matériaux. Ici, nous nous concentrons sur un sous-ensemble de ces méthodes, en notant qu’il existe de nombreuses autres méthodologies qui fournissent des informations clés sur les propriétés et les performances de la fibre de soie. La microscopie optique est utilisée pour évaluer la morphologie des fibres, ce qui permet de comparer les diamètres des fibres filées dans des conditions identiques et variables 17,31,38,46. Cette technique est également importante pour identifier et éliminer les segments de fibres présentant des défauts ou des anomalies avant la caractérisation ultérieure. De plus, la microscopie à lumière polarisée peut être utilisée pour évaluer le degré d’alignement moléculaire au sein de la fibre, car des niveaux d’alignement plus élevés sont généralement associés à des propriétés mécaniques améliorées 17,26,47. La caractérisation mécanique est effectuée par le biais d’essais de traction, où les courbes de contrainte-déformation sont mesurées et utilisées pour quantifier des paramètres tels que la résistance à la traction, l’extensibilité, le module de Young et la ténacité, fournissant des informations essentielles pour évaluer l’adéquation des fibres dans des applications structurelles ou biomédicales 17,33,48. La dernière technique abordée ici, la spectromicroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR), est appliquée pour étudier la structure secondaire des protéines, en particulier le degré de formation de la nappe de β, car elle joue un rôle crucial dans la stabilité et la résistance mécanique des fibres 17,46,49. Ensemble, ces techniques fournissent une compréhension complète de la morphologie, de la structure et du comportement mécanique des fibres de soie produites par recombinaison.

Protocole

Dans ce protocole, nous supposons que le point de départ est une poudre de protéine de soie lyophilisée. Il s’agirait le plus souvent d’une protéine de soie d’araignée recombinante dans notre travail. La figure 1 donne un aperçu du protocole, avec chacune des cinq étapes suivantes détaillées ci-dessous : (1) préparation et optimisation du dopage en filature ; (2) l’étirage à la main ou la filature humide de la fibre de soie ; (3) le diamètre de la fibre et l’évaluation morphologique par microscopie optique ; (4) évaluation mécanique par essais de traction ; et (5) l’évaluation de la structure secondaire par spectromicroscopie FTIR.

Figure 1 : Vue d’ensemble schématique des étapes clés du protocole de production, de collecte et de caractérisation de la fibre de protéine de soie d’araignée recombinante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Préparation et optimisation de la dope en spinning

REMARQUE : Pour optimiser la solution de filage de fibres, essayez de solubiliser des concentrations variables de protéines de soie d’araignée recombinante dans différents solvants pour préparer des solutions de dope (Tableau 1). Seuls les solvants qui dissolvent la protéine, donnant une solution de dope claire et sans précipité, doivent être utilisés pour les tentatives de filage des fibres.

1. Préparation des solvants
   1. Pour produire 8:1:1 TFA/TFE/H₂O, mesurez 800 μL de TFA, 100 μL de TFE et 100 μL d’eau ultrapure de type 1 dans un tube de verre à l’intérieur d’une hotte. Mélangez soigneusement tous les composants. Fermez le tube de verre et couvrez-le d’un parafilm pour éviter l’évaporation des composants volatils.
      REMARQUE : Préparez toujours une solution fraîche pour le filage des fibres.
      ATTENTION : Manipulez TFA et TFE avec précaution, TFA est très corrosif et volatil, tandis que TFE est inflammable et toxique. Portez un EPI approprié, y compris des gants, des blouses de laboratoire et des lunettes de sécurité, pour éviter tout contact avec la peau et le risque d’inhalation.
   2. Pour fabriquer 3:1:1 TFA/TFE/H₂O, à l’intérieur d’une hotte, transférez 300 μL de TFA, 100 μL de TFE et 100 μL d’eau ultrapure de type 1 dans un tube en verre et mélangez les composants. Fermez le tube de verre et couvrez-le de parafilm pour minimiser l’évaporation des composants volatils.
      REMARQUE : Préparez toujours une solution fraîche pour le filage des fibres.
   3. Pour produire du HFIP 7:3/H₂O, mélanger 700 μL de 1,1,1,3,3,3-hexafluroro-2-propanol (HFIP) avec 300 μL d’eau ultrapure de type 1 pour obtenir une solution de 1 mL. Préparez la solution fraîchement si nécessaire.
      ATTENTION : Manipulez HFIP à l’intérieur d’une hotte et évitez l’inhalation ou le contact avec la peau.
   4. Pour fabriquer un tampon de phosphate de potassium de 50 mM (pH 7,5), prélever 800 mL d’eau désionisée dans un bécher et dissoudre 1,199 g de dihydrogénophosphate de potassium (KH₂PO₄- MW. 136. 09 g/mol) et 7,173 g de phosphate dibasique de potassium (K₂HPO₄- MW. 174,18 g/mol) qu’il contient. Mélangez soigneusement tous les composants et ajustez le pH de la solution à l’aide de NaOH ou de HCl. Complétez le volume à 1 L avec de l’eau désionisée et conservez-le à température ambiante.
   5. Pour fabriquer 10 mM de tampon Tris-Cl (pH 8,0), dissoudre 1,21 g de chlorhydrate de Tris (MW. 157,60 g/mol) dans 800 mL d’eau déminéralisée. Ajustez le pH à l’aide de NaOH et complétez le volume final à 1 L avec de l’eau désionisée. Conservez la solution à température ambiante.
   6. Pour fabriquer un tampon de 20 mM d’acétate de na (pH 5,0), dans 450 mL d’eau désionisée, dissoudre 0,55 g d’acétate de sodium (82,03 g/mol) et 0,02 M (6 mL) d’acide acétique. Complétez le volume à 500 ml avec de l’eau déminéralisée et conservez-le à température ambiante.
   7. Pour fabriquer 1 tampon de phosphate de citrate M (pH 7,0), dissoudre 11,69 g d’hydrogénophosphate disodique (Na₂HPO₄- MW. 141,96 g/mol) et 1,85 g d’acide citrique (MW. 192,12 g/mol) dans 400 mL d’eau désionisée. Ajustez le pH de la solution à l’aide de HCl ou de NaOH et ajustez le volume final à 500 mL à l’aide d’eau désionisée.
   8. Pour préparer la solution d’acide formique à 98 % et de CaCl₂ , diluez l’acide formique à 98 % en mélangeant 98 ml d’acide formique avec 2 ml d’eau désionisée, pour un total de 100 ml de solution. Maintenant, ajoutez 4 g de CaCl₂ à 100 ml de solution d’acide formique à 98 % pour préparer une solution d’acide formique à 4 % p/v de CaCl₂ . Conservez la solution à température ambiante.
      REMARQUE : Voir le tableau 1. Seuls les solvants qui dissolvent la protéine, donnant une solution de dope claire et sans précipité, doivent être utilisés pour les tentatives de filage des fibres.
2. Préparation de la solution de filature de fibres
   1. Peser la protéine de soie d’araignée lyophilisée selon la concentration désirée (p. ex., 10 mg pour une solution à 10 % (p/v) dans 100 μL de solvant) et mélanger avec le volume approprié de solvant (p. ex., 100 μL pour une concentration de 10 % (p/v)).
   2. Agitez le mélange jusqu’à ce que la poudre de protéine soit complètement dissoute dans le solvant.
   3. Comme la solubilité de la protéine de soie d’araignée varie en fonction du solvant et du type de protéine, commencez par une faible concentration en protéines (10 % p/v) et augmentez progressivement la concentration (25-30 % p/v) au besoin.
   4. Après la dissolution complète de la protéine, évaluez qualitativement la viscosité de la solution de dope. Si la solution de dope semble insuffisamment visqueuse, augmentez progressivement la concentration en protéines jusqu’à l’obtention d’une solution claire et visqueuse. Utilisez l’eau comme étalon de référence.

Solvant	Concentration en protéines ( % - p/v)	Référence
8:1:1 TFA/TFE/H2O	10 – 25	19
3:1:1 TFA/TFE/H2O	10 – 30	26
7:3 HFIP/H2O	15 – 30	31
50 mM de tampon de phosphate de potassium (pH 7,5)	10 – 25	50
10 mM de tampon Tris-Cl (pH 8,0)	10 – 20	34
20 mM de tampon d’acétate de na (pH 5,0)	10 – 25	49
1 M de tampon phosphate de citrate (pH 7,0)	10 – 25	51
Acide formique à 98 % – CaCl2	20 – 25	52

Tableau 1 : Solvants et concentrations de protéines recommandés pour la préparation de dopes de filage de fibres.

2. Filage et collecte des fibres

REMARQUE : Reportez-vous à la figure 2 pour une représentation schématique du dessin à la main et à la figure 3 pour les différentes configurations de dispositif de filage humide détaillées ci-dessous.

Figure 2 : Dessin à la main de fibres de soie d’araignée. (A) Un cadre en papier en forme de C est préparé et fixé à une lame de verre avec du ruban adhésif transparent à gauche et du ruban adhésif double face à droite pour permettre le dessin des fibres de gauche à droite. (B) Une goutte de dope en essorage est placée sur le ruban transparent, et une seule fibre est étirée à la main sur le ruban double face à travers l’ouverture du cadre en forme de C à l’aide d’une pointe de pipette en plastique. (C) La fibre est fixée au cadre en papier sur la lame de verre à l’aide de ruban adhésif sur les côtés gauche et droit. (D, E) Démonstration d’un procédé représentatif (D) d’étirage à la main d’une soie d’araignée recombinante efficacement solubilisée dans une dope de spin et (E) la fibre résultante avant d’être fixée avec du ruban adhésif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Filage humide de fibres de soie d’araignée. Dans tous les cas, la drogue en essorage est placée dans une seringue hermétique en verre et extrudée à un débit constant à l’aide d’un pousse-seringue à travers une aiguille métallique à bout émoussé (c.-à-d. la filière) dans un bain de coagulation (p. ex., éthanol à 95 %). (A) Les fibres telles que filées sont collectées sur le rouleau 1, tournant sous contrôle informatique à une vitesse correspondant au taux d’extrusion. (B) L’étirement post-essorage dans l’air est réalisé en guidant les fibres à travers le rouleau 1 et en les recueillant sur le rouleau 2, qui tourne à un multiple de la vitesse du rouleau 1 (par exemple, le double de la vitesse pour un rapport d’étirage de 2x). De même, des fibres peuvent être produites (C) après l’immersion dans un solvant (par exemple, de l’éthanol à 40 %, de l’eau, etc., selon ce qui convient à une soie donnée) en guidant les fibres du rouleau 1 au rouleau 3 (immergées dans un bain de solvant et tournant à la même vitesse que le rouleau 1) avant de les guider sur le rouleau 2 (tournant à un multiple de la vitesse des rouleaux 1 et 3) ; ou (D) dans le solvant en guidant les fibres du rouleau 1 au rouleau 3 (immergé dans un bain de solvant et tournant à la même vitesse que le rouleau 1) puis au rouleau 4 (également immergé dans le solvant et tournant à un multiple de la vitesse des rouleaux 1 et 3) avant le prélèvement sur le rouleau 2 (vitesse adaptée à celle du rouleau 4). La configuration modulaire signifie que diverses permutations dans des conditions de filature de fibre peuvent être facilement testées, certainement pas limitées aux quatre schématiquement montrées ici. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Dessin à la main
   1. Préparez un cadre en papier en forme de C avec une fenêtre de 1 cm x 0,5 cm (L x l) et placez-le sur une lame de verre (Figure 2). Fixez la partie supérieure du cadre en papier à la lame de verre à l’aide de ruban adhésif. Fixez du ruban adhésif transparent sur un bras du cadre en papier pour créer une surface hydrophobe pour le dépôt de solution de drogue, et fixez du ruban adhésif double face sur le bras opposé pour la sécurisation des fibres.
   2. Déposer 10 à 20 μL de solution de dope en essorage sur le ruban transparent à température ambiante (22 ± 2 °C).
   3. Immergez une pointe de pipette en plastique de 200 μL dans la gouttelette de solution de dope et retirez-la verticalement de la solution à une vitesse constante (~6 mm/s), ce qui permet de retirer les fibres de la solution.
   4. Guidez la fibre tirée à la main sur la fenêtre du cadre et fixez-la sur le ruban adhésif double face. Faites sécher la fibre à l’air libre à température ambiante, puis fixez les deux extrémités des fibres avec du ruban adhésif supplémentaire.
   5. Concentrez-vous sur la partie de la fibre qui enjambe le cadre en papier pour une caractérisation ultérieure.
2. Filature humide
   1. Construisez un appareil à rotation humide, l’appareil détaillé ici ayant des capacités de contrôle moteur améliorées par rapport aux itérations précédentes^31,38.
      1. Fabriquez une plaque de montage métallique rigide maintenue verticalement et usinée avec une configuration appropriée pour fixer un ensemble de moteurs pas à pas (voir Figure 3). Chaque support de moteur nécessite des trous percés pour permettre un boulonnage sécurisé des moteurs pas à pas à l’arrière de la plaque de montage (c’est-à-dire quatre trous correctement espacés et dimensionnés) et un cinquième trou pour permettre au passage de l’arbre du moteur.
      2. Choisissez des moteurs pas à pas bipolaires avec un pas de 1,8°, un couple de maintien de 45 N∙cm, une longueur de 24 mm et un arbre de 5 mm de diamètre avec une coupe en « D » de 15 mm de long, un corps de 39 mm, un courant nominal de 1,50 A, une résistance de phase de 2,3.
      3. Développer un système pour contrôler la vitesse et le sens de rotation de chaque moteur, tel que celui utilisé précédemment pour une variété de types de fibres de soie^{17, 53, 54}, qui utilise une interface utilisateur graphique (GUI) codée en Python pour un Raspberry Pi connecté à plusieurs contrôleurs de moteur pas à pas, comme détaillé au https://github.com/raineylab/MotorController.git.
      4. Pour la filature, fixer chaque moteur utilisé dans une configuration de rotation donnée à un cylindre métallique usiné (diamètre 6 cm, longueur 8 cm pour ceux en positions 1 et 2 sur la figure 3, rouleaux rainurés de 9 cm de diamètre à chaque extrémité se rétrécissant à un diamètre de 6 cm au centre du rouleau, longueur de 7 cm dans les positions 3 et 4 de la figure 3 ; voir, par exemple, la figure 4 pour un exemple de configuration).
      5. Pour la spinnerette (figure 3), utilisez une seringue en verre de 0,25 mL avec une aiguille métallique fixée en permanence avec une extrémité émoussée (diamètre intérieur de 0,127 mm) montée dans une pompe à seringue qui extrude la dope de spin à un débit contrôlé dans un bain de coagulation.
   2. Centrifugez la solution de dope à 20 000-21 000 × g pendant 30 minutes à température ambiante et récupérez le surnageant pour le filage des fibres.
      REMARQUE : Éliminez les particules résiduelles pour éviter le colmatage de l’aiguille d’extrusion pendant l’essorage humide.
   3. Chargez 50 à 80 μL de solution de dopation dans la seringue qui sert de filière.
   4. Fixez la seringue dans un pousse-seringue et réglez l’extrusion à un débit de 600 μL/h.
      REMARQUE : Ajustez et optimisez le taux d’extrusion pour permettre la formation de fibres pour une condition de dope de filage de protéines donnée.
   5. Préparer le bain de coagulation (95 % d’éthanol / 5 % d’eau déminéralisée, v/v).
   6. Positionnez le pousse-seringue de manière à ce que l’aiguille de la seringue contenant la solution de dope soit immergée dans le bain de coagulation.
   7. Fixez le(s) rouleau(x) à l’appareil de rotation, ajustez la vitesse du rouleau à l’aide d’un logiciel de commande de moteur et allumez le(s) moteur(s) requis(s) pour une configuration de rotation donnée.
      REMARQUE : Adaptez la vitesse de rotation du rouleau 1 à la vitesse d’extrusion. Les vitesses d’extrusion de 400 μL/h ou 600 μL/h correspondent à 6 tr/min ou 9 tr/min pour le rouleau 1. Si un tirage post-rotation est donné, un ou plusieurs des rouleaux 2 à 4 doivent être réglés pour tourner en conséquence plus rapidement.
   8. Démarrez le pousse-seringue et utilisez une pince à épiler pour guider la fibre qui se forme dans le bain de coagulation de l’une des manières suivantes.
      1. Pour collecter les fibres AS, guidez la fibre formée dans le bain de coagulation sur le premier rouleau (vitesse égale à la vitesse d’extrusion) pour la collecte.
      2. Pour effectuer un étirement post-essorage dans l’air, réglez la vitesse de rotation du rouleau 2 sur un multiple de celle du rouleau 1. Guidez la fibre de la coagulation sur le rouleau 1 sans faire une boucle autour du rouleau 1 et collectez-la sur le rouleau 2.
         REMARQUE : Un rapport de tirage post-rotation de 2x nécessite que la vitesse de rotation du rouleau 2 soit le double de celle du rouleau 1 ; 3x, triple ; et ainsi de suite.
      3. Pour effectuer un étirement post-essorage après immersion dans le solvant, remplissez le bain de solvant avec le solvant souhaité (par exemple, eau désionisée ; éthanol 2:3 v/v/H/H₂O ; etc.) et guidez la fibre du bain de coagulation autour du rouleau 1 (vitesse de rotation adaptée à la vitesse d’extrusion), autour du rouleau 3 (vitesse de rotation égale au rouleau 1) dans le bain de solvant, et collecter la fibre sur le rouleau 2 dans l’air (tournant à un rythme plus rapide que les rouleaux 1 et 3).
         REMARQUE : La vitesse de rotation du rouleau 2 par rapport aux rouleaux 1 et 3 déterminera le rapport de tirage post-essorage comme à l’étape 2.2.8.2.
      4. Pour effectuer l’étirement post-essorage dans le solvant, remplissez le bain de solvant avec le solvant souhaité (par exemple, eau désionisée ; éthanol 2:3 v/v_/H2O ; etc.) et guidez la fibre du bain de coagulation autour du rouleau 1 (vitesse de rotation adaptée à la vitesse d’extrusion), autour du rouleau 3 (vitesse de rotation égale au rouleau 1) dans le bain de solvant, autour du rouleau 4 dans le bain de solvant (vitesse de rotation un multiple de celle des rouleaux 1 et 3) et collectez La fibre sur le rouleau 2 dans l’air (vitesse de rotation adaptée au rouleau 2).
         REMARQUE : La vitesse de rotation des rouleaux 2 et 4 par rapport à celle des rouleaux 1 et 3 déterminera le rapport de tirage post-rotation comme à l’étape 2.2.8.2.
         Collectez les fibres dans des conditions environnementales contrôlées pour éviter l’influence de l’humidité et de la température sur le comportement des fibres. Nous visons une humidité relative ~ 28,2 ± 2,4 % et une température ~ 28,0 ± 2,2 °C.

Figure 4 : Étapes clés de la filature humide des fibres de soie d’araignée. (A) Essorage de l’extrusion de la drogue dans un bain de coagulation suivi de la collecte de la fibre (le rectangle rouge à gauche met en évidence l’aiguille utilisée pour l’extrusion de la drogue ; le rectangle rouge à droite est le chemin de la fibre de soie filée par voie humide. (B) Illustration de la fibre soumise à un étirement post-spin dans l’air (rectangle rouge pour guider l’œil). (C) Illustration de l’étirement post-spin de la fibre après immersion dans l’eau (rectangle rouge pour guider l’œil). (D) Fibre de soie recombinante continue recueillie sur un rouleau (par exemple, fibre enroulée à la flèche rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Évaluation microscopique optique des fibres

1. Montage en fibre optique
   1. Créez un porte-papier en forme de C en découpant un carré de 1 x 1 cm dans une feuille de papier rectangulaire de 3 x 2 cm (Figure 5).
   2. Fixez le support en forme de C à une lame de microscope en verre à l’aide de ruban adhésif.
   3. Fixez deux morceaux de ruban adhésif double face de chaque côté de l’espace de 1 cm du porte-papier en forme de C.
   4. Retirez une fibre du rouleau sur lequel elle a été recueillie et coupez un segment d’environ 2 cm de long.
      REMARQUE : Évitez d’utiliser une force excessive lors de la manipulation des fibres pour éviter la déformation du matériau ou toute autre altération des propriétés.
   5. Placez le segment de fibre sur le dessus du ruban adhésif double face, en vous assurant que l’axe long de la fibre est aligné parallèlement au bord inférieur du support (Figure 5).
   6. Fixez la fibre avec du ruban adhésif de masquage sur du ruban adhésif double face des deux côtés.
   7. Fixez un morceau supplémentaire de ruban adhésif pour fixer fermement le bas du porte-papier à la lame de verre afin d’empêcher le mouvement de la fibre jusqu’à l’utilisation.
   8. Stockez les fibres montées dans une boîte de stockage de lames jusqu’à ce qu’elles soient utilisées pour l’imagerie et les essais de traction.
2. Détermination du diamètre et évaluation des défauts
   1. Examinez les fibres montées à l’aide de la microscopie optique. Tout d’abord, passez au crible toute la longueur de la fibre pour détecter les imperfections visibles, telles que le rétrécissement, la torsion, le renflement ou les fibres doubles. Si des défauts sont observés, excluez ces fibres des tests mécaniques.
   2. Pour les fibres qui semblent exemptes de défauts, prenez trois micrographies à un grossissement de 10x le long de l’axe long de la fibre, une au milieu et une près de chaque extrémité de la fibre.
   3. Mesurez le diamètre de la fibre à l’aide du logiciel ImageJ⁵⁵ :
      1. Dans ImageJ, allez dans le menu Analyser et sélectionnez Définir l’échelle (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S1). Ajustez l’échelle en fonction des paramètres d’étalonnage du microscope et réglez l’unité de mesure sur micromètres (μm) (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S2).
      2. À l’aide de l’outil ligne, tracez une ligne droite perpendiculaire au grand axe de la fibre qui s’étend d’un bord à l’autre de la fibre.
      3. Pour chaque micrographie, mesurez le diamètre de la fibre à six régions différentes le long de la fibre.
      4. Après avoir tracé chaque ligne, cliquez sur Mesurer dans le menu Analyser pour afficher le diamètre de la fibre (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S3).
3. Évaluation qualitative de l’alignement moléculaire par microscopie à lumière polarisée
   1. Utilisez la microscopie à lumière polarisée pour évaluer l’alignement moléculaire au sein de la fibre après l’évaluation du diamètre et des défauts par microscopie optique.
      1. Examinez la fibre à l’aide d’un microscope optique inversé équipé d’une platine rotative, d’un curseur d’analyseur fixe et d’un polariseur rotatif à 90°.
      2. Placez la fibre à environ 45° par rapport à la lumière incidente polarisée dans le plan pour maximiser la luminosité due à la biréfringence, améliorant ainsi la visibilité de la structure moléculaire.
      3. Prenez une image de la fibre dans ces conditions pour évaluer sa biréfringence.
         REMARQUE : Une biréfringence élevée suggère une structure moléculaire bien alignée, tandis qu’une biréfringence faible ou nulle suggère une structure plus amorphe ou orientée de manière aléatoire.

Figure 5 : Montage de la fibre de soie d’araignée sur une lame de verre permettant une analyse en aval à l’aide d’un support de papier en forme de C et d’une série de couches de ruban adhésif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Essai de traction

REMARQUE : Un dispositif d’essai de traction adapté à l’évaluation précise des fibres de soie peut être facilement produit à un coût relativement faible^25,56. Brièvement, fabriquez une paire de pinces en acier inoxydable pour permettre une prise ferme de chaque extrémité de chaque fibre dans un cadre en forme de C qui est testé (par exemple, Figure 6). Fixez l’une de ces pinces à un poids placé sur une balance analytique et l’autre à un pousse-seringue. Le pousse-seringue doit être configuré pour permettre une traction constante à un taux de déformation défini. La balance analytique doit être interfacée avec un ordinateur pour la collecte des données de poids/masse enregistrées en fonction du temps.

Figure 6 : Schéma de principe montrant les étapes préparatoires pour les essais de traction. (A) Le porte-papier avec fibre (voir la figure 5 pour la configuration) est détaché de la lame de verre et monté verticalement à l’aide d’un clip fixé à un poids. (B) Cette pince lestée est placée sur la balance analytique, et la partie supérieure du porte-papier est fixée à une pince fixée à une tige solidement fixée dans un pousse-seringue. Le porte-papier est coupé horizontalement au milieu avant de commencer les essais de traction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Acquisition de données de courbe contrainte-déformation
   1. Après avoir mesuré le diamètre de la fibre, effectuez un essai de traction sur la même fibre avec un appareil de fabrication artisanale (Figure 6).
      1. Détachez le cadre en papier en forme de C qui maintient la fibre de la lame de verre et fixez-le à une pince fixée à un poids (Figure 6A).
      2. Connectez la balance analytique au logiciel d’enregistrement/contrôle des données et accédez à l’atelier (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S4).
      3. Configurez l’expérience dans le logiciel de contrôle de la balance en cliquant sur le bouton Démarrer . Entrez le nom de l’expérience lorsque vous y êtes invité (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S5).
      4. Assurez-vous que la balance analytique est vide et placez la pince lestée avec la fibre dessus.
      5. Fixez le haut du cadre en papier à une pince reliée au pousse-seringue et coupez un côté du porte-papier pour permettre à la fibre de se déplacer librement (Figure 6B).
         REMARQUE : Assurez-vous que les deux pinces sont parallèles l’une à l’autre et que la fibre est centrée à l’intérieur de la pince à une longueur de jauge de 10 mm.
      6. Térez la balance pour mettre à zéro la masse du poids et de la pince, appuyez sur le bouton Run de la pompe à seringue et cliquez sur OK dans le logiciel de contrôle de la balance (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S6).
      7. Lorsque la fibre se rompt , appuyez sur Stop sur le pousse-seringue et sur le bouton Oui dans le logiciel de contrôle de la balance (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S7) pour enregistrer le poids mesuré en fonction du temps.
      8. Transférez les données vers un tableur ou un autre logiciel de traitement de données approprié pour le traitement. Copiez le journal des données de poids en fonction du temps dans le presse-papiers et collez-le dans la feuille de calcul d’essai mécanique fournie (fichier supplémentaire 2) ou en exportant les données sous forme de fichier texte et en les important avec l’analyse appropriée.
2. Traitement des données de la courbe contrainte-déformation
   REMARQUE : Le protocole suivant est basé sur la feuille de calcul des essais mécaniques formatée pour être utilisée dans Microsoft Excel (fichier supplémentaire 2).
   1. S’assurer que les paramètres expérimentaux sont corrects (colonne C).
   2. Ajoutez les enregistrements de masse en fonction du temps à la feuille de calcul (la « masse nette » dans la colonne F). S’il y a des valeurs de masse enregistrées avant le début de l’étirement, supprimez ces valeurs en supprimant les cellules correspondantes avec un décalage des données vers le haut. Si des valeurs de masse sont enregistrées après la rupture de la fibre, supprimez ces cellules de données.
   3. Remplissez automatiquement les valeurs d’index dans la colonne E en ajoutant des incréments de 1 afin que le nombre total d’indices corresponde au nombre total de valeurs de masse mesurées dans la colonne F.
   4. Redimensionnez la masse nette de sorte qu’elle commence à 0 g et augmente au cours de l’expérience d’étirement en soustrayant la masse nette initiale de chaque valeur de masse nette et en multipliant cette différence par -1 (colonne G).
   5. Calculez la variation de la longueur de la fibre à chaque mesure en multipliant l’indice de mesure par le taux de traction du pousse-seringue et le décalage entre les mesures de masse enregistrées (colonne H).
   6. Calculez la déformation technique en divisant la variation de la longueur de la fibre par la longueur d’origine (colonne I).
      REMARQUE : Ce calcul donne la déformation technique en mm/mm. Pour convertir les valeurs de déformation technique en %, multipliez les valeurs de la colonne I par 100 %.
   7. Enregistrez l’extensibilité en tant que valeur maximale de déformation technique (cellule T3).
   8. Calculer la force (en N) nécessaire pour réaliser chaque changement de longueur enregistré en convertissant la masse de g en kg et en la multipliant par la gravité standard (9,81 m/s² ; Colonne J).
   9. Calculez la contrainte d’ingénierie (en Pa) en divisant la force déterminée à un degré d’extension donné par la section transversale de la fibre et ^{multipliez-la par 10-6} pour la convertir en MPa (colonne K).
   10. Enregistrez la contrainte maximale observée comme contrainte ultime (cellule U3) et la contrainte à la rupture comme valeur de contrainte finale enregistrée avant la rupture de la fibre (cellule V3).
   11. Calculer l’aire sous la courbe contrainte-déformation pour obtenir la ténacité à l’aide de la règle trapézoïdale pour calculer l’aire sous la courbe après chaque mesure (colonne L). Additionnez ces aires pour trouver la ténacité (Cellule W3).
   12. Calculez le module de Young (en MPa) en déterminant la pente de la région linéaire initiale de la courbe contrainte-déformation à l’aide de la fonction LINET. Convertissez en GPa en multipliant par 10³ (cellule X3).

5. Spectromicroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)

1. Préparez un échantillon pour la IRTF en collant une deuxième lame de verre au bas d’une lame préparée pour la microscopie optique.
2. Collecte spectrale d’images optiques et FTIR
   1. Remplissez le détecteur dewar avec de l’azote liquide pour refroidir le détecteur.
   2. Ouvrez le logiciel de contrôle de l’instrument FTIR.
   3. Dans la fenêtre Afficher et collecter (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S8), ouvrez l’onglet Collecte , réglez le Mode de collecte sur ATR et Détecteur sur Refroidi (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S9).
   4. Placez la glissière dans le support de diapositive et placez le support sur la scène.
   5. Réglez l’éclairage supérieur sur 100 et l’ouverture et l’éclairage inférieur sur 0.
   6. Focalisez le centre du champ de vision pour l’image du microscope optique de l’échantillon sur la fibre à l’aide du joystick physique ou du joystick numérique du logiciel pour contrôler la position du centre du champ de vision et du plan focal.
   7. Réglez le mode de collecte sur Carte (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S8).
   8. Sélectionnez la région à imager et à mesurer à l’aide de l’outil Vue Carte - Zone. Cliquez et faites glisser le curseur pour spécifier la région pour laquelle les spectres doivent être acquis dans l’aperçu de la micrographie (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S8). Chaque cercle sur l’image représente un spectre acquis à cette position. Si nécessaire, modifiez les bords de cette zone en plaçant le curseur au-dessus d’un bord de boîte donné, puis en cliquant et en faisant glisser jusqu’à l’emplacement souhaité. Traduisez toute la boîte en cliquant et en faisant glisser à l’intérieur du rectangle. Modifiez la zone de la boîte et le nombre de points de données sous Scène, Ouverture et Affichage (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S10).
   9. Faites un clic droit sur l’aperçu de la micrographie et sélectionnez Capturer la mosaïque pour enregistrer l’image (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S8).
   10. Réglez la pression ATR en cliquant sur le menu déroulant Profil de pression actuel . Pour les fibres protéiques, utilisez une pression de 2 % (c’est-à-dire la pression ATR la plus basse possible) pour minimiser les dommages à la fibre (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S8).
   11. Insérez l’embout FTIR de l’ATR.
   12. Cliquez sur le bouton Collecter (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S8) pour acquérir un spectre d’arrière-plan, puis le spectre à chacun des points sélectionnés. Une fois la collecte terminée, les données s’afficheront dans une nouvelle fenêtre.
3. Préparation des données pour l’analyse en aval
   1. Faites un clic gauche sur la carte thermique ou la micrographie pour voir le spectre qui a été acquis à la position correspondante (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S11).
   2. Faites un clic droit sur un spectre à analyser et sélectionnez Copier (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S11).
   3. Cliquez avec le bouton droit de la souris dans la barre Windows en haut de l’écran et sélectionnez Nouvelle fenêtre (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S11).
   4. Cliquez sur le bouton Coller en haut de l’écran lorsque la nouvelle fenêtre s’ouvre (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S11).
   5. Utilisez la même approche pour copier et coller tout autre spectre souhaité pour l’analyse dans cette fenêtre.
   6. Mettez en surbrillance un ou plusieurs spectres en appuyant sur Ctrl tout en cliquant sur chaque spectre souhaité ou en mettant en surbrillance les spectres souhaités dans le menu déroulant.
   7. Cliquez sur Enregistrer sous... et enregistrez les fichiers en tant que fichiers .spa pour analyser les données dans le logiciel de contrôle du spectromètre ou en tant que .csv pour analyser les données dans un autre progiciel (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S12).
4. Analyse de la dérivée seconde à l’aide d’un logiciel spécifique à l’instrument
   1. Ouvrez les spectres à analyser dans le progiciel de traitement et d’analyse spectrale spécifique à l’instrument.
   2. Pour convertir entre les modes % de transmission et d’absorbance, utilisez Ctrl+A ( % de transmission à l’absorbance) ou Ctrl+T (Absorbance à % de transmittance).
   3. Sélectionnez la région qui vous intéresse en cliquant sur Afficher | Limites d’affichage (ou, Ctrl+D) (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S13A). Pour afficher les bandes Amide I (1 700 à 1 600 ^cm-1) et Amide II (1 600 à 1 500 ^cm-1), définissez les limites de l’axe X de début et de fin sur les numéros d’onde appropriés. Si vous analysez plusieurs spectres, sélectionnez Appliquer à tous les spectres. Cliquez sur OK (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S13B).
   4. Pour tracer la dérivée seconde, cliquez sur Traiter | Dérivé... et choisissez Deuxième dans le menu déroulant (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S14A). Sélectionnez la dérivée de Norris avec une longueur de segment de 5 et un écart entre les segments de 5 (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S14B). Les minima du spectre de la dérivée seconde coïncident avec les pics des composantes dans le spectre d’absorbance d’origine.
      1. Si le spectre est trop bruyant pour évaluer les minimums, lissez-le en cliquant sur Traiter>Lissage automatique (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S15). Ensuite, calculez la dérivée seconde et trouvez les minima.
   5. Reliez les numéros d’onde aux minima de la dérivée seconde aux positions de bande caractéristiques des structures secondaires à l’aide d’un tableau de référence (par exemple, le tableau 2) pour obtenir des informations sur la structure secondaire de la protéine.
5. Déconvolution des pics à l’aide d’un logiciel d’analyse spécifique à l’instrument
   1. Réglez la zone d’affichage sur la zone à déconvoluer comme à l’étape 5.4.3. Seule cette région sera déconvoluée.
   2. Corrigez la ligne de base de la région spectrale sélectionnée à l’aide de l’une des méthodes suivantes :
      1. Cliquez sur Traiter | Correction automatique de la ligne de base (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S16) ; ou
      2. Cliquez sur Traiter | Correction de la ligne de base (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S17A), puis sélectionnez Linéaire dans le menu déroulant et spécifiez la région spectrale à corriger par ligne de base sur le spectre de position en cliquant et en faisant glisser les deux points qui spécifient les limites inférieure et supérieure de la région à corriger à des fins de déconvolution. Ensuite, sélectionnez Ajouter à la fenêtre dans le deuxième menu déroulant et cliquez sur le bouton Ajouter (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S17B).
   3. Une fois le spectre corrigé de la ligne de base sélectionné, cliquez sur Analyser | Résolution maximale... pour ouvrir la fenêtre Résolution de crête (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S18).
   4. Sélectionnez les spectres et les courbes à analyser à l’aide de la barre de sélection située sur le côté gauche de l’écran.
   5. Choisissez Gaussien/Lorentzien avec un réglage de sensibilité faible et un réglage FWHH de 2 dans l’onglet Trouver des pics , puis cliquez sur le bouton Rechercher des pics (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S19).
   6. Cliquez sur le bouton Pics pour ouvrir un tableau décrivant les pics.
      1. Si vous avez sélectionné plus de pics qu’il n’est physiquement raisonnable, cliquez sur Supprimer le pic jusqu’à ce que le nombre correct de pics soit obtenu pour l’analyse (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S20). Par exemple, pour la région de l’amide I, 5 à 11 pics sont généralement signalés dans la littérature (tableau 2).
      2. Pour vous assurer que tous les pics sont positifs après l’ajustement, cliquez sur Modifier le pic et réglez la hauteur minimale sur 0. Ensuite, cliquez sur Suivant et répétez l’opération pour chaque pic suivi de OK pour fermer la fenêtre d’édition (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S21).
      3. S’il y a des numéros d’onde spécifiques qui doivent être présents dans la déconvolution finale, cliquez sur Modifier le pic et fixez le centre du pic au numéro d’onde spécifié dans la zone Valeur en sélectionnant Fixe ou fournissez une plage à l’aide des zones Limite basse et Limite haute . Cliquez sur OK pour appliquer ces paramètres au pic donné.
         REMARQUE : Dans cette étape, il est optimal d’utiliser les positions de pic trouvées lors de l’analyse de la dérivée seconde ou les pics d’une table de référence de structures secondaires FTIR, idéalement annotées pour un type d’échantillon de soie similaire (par exemple, tableau 2).
   7. Cliquez sur le bouton Ajuster les pics (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S22).
      1. Si l’algorithme d’ajustement des pics ne parvient pas à converger, cliquez à nouveau sur Ajuster les pics pour continuer itérativement à ajuster les pics.
   8. Cliquez sur le bouton Pics... pour obtenir des informations sur la position, la hauteur, le FWHH et la surface de tous les sommets qui ont été ajustés.
      1. Ces pics peuvent être copiés dans le presse-papiers en cliquant sur Presse-papiers pour permettre de les coller dans une autre fenêtre ou un autre fichier (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S23).
      2. Copiez les pics et les spectres dans une autre fenêtre en sélectionnant la destination dans le menu déroulant de sélection de fenêtre à côté du bouton Ajouter (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S24).
      3. Cliquez sur le bouton Sélectionner tout et utilisez Fichier | Enregistrer sous pour enregistrer les pics et les spectres sous forme de fichiers .spa et/ou .csv (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S25).
   9. Associez chaque pic de composant à une structure secondaire à l’aide d’une table de référence. L’aire relative du ou des pics correspondant à une structure secondaire donnée par rapport à l’aire totale de tous les pics attribués fournit la proportion de la protéine qui a cette structure secondaire.
6. Préparation des données pour l’analyse en aval à l’aide d’un logiciel tiers
   1. Ouvrez un classeur et chargez les données spectrales dans le logiciel tiers de traitement et d’analyse spectraux en sélectionnant l’icône Données | Se connecter au fichier | Élément de menu Texte/CSV (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S26). Sélectionnez le fichier souhaité dans l’Explorateur de fichiers et cliquez sur Ouvrir.
   2. Tracez le spectre en mettant en surbrillance les colonnes à tracer et en sélectionnant l’icône Tracer | 2D de base | Élément de menu linéaire (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S27).
   3. Double-cliquez sur l’axe des x et utilisez l’onglet Échelle pour ajuster la plage afin de l’adapter au pic Amide I (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S28).
   4. Si les données sont très bruitées, lissez la courbe en choisissant l’option Analyse | Traitement du signal>Boîte de dialogue fluide>ouverte... (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S29A).
      1. Définissez l’option Recalculer sur Auto, la méthode sur Savitzky-Golay, les points de fenêtre sur 5, la condition aux limites sur aucune et l’ordre polynomial sur 2 (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S29B).
      2. Cliquez sur OK pour traiter.
7. Analyse de dérivées secondes à l’aide d’un logiciel tiers
   1. Sélectionnez l’analyse | Mathématiques | Différencier | Ouvrir la boîte de dialogue... (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S30).
   2. Définissez l’option Recalculer sur Auto, définissez l’ordre des dérivées sur 2, sélectionnez l’option Tracer la courbe dérivée, puis cliquez sur OK (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S31).
   3. Si la courbe de dérivée seconde résultante est très bruyante, suivez les étapes 5.7.1. et 5.7.2, en sélectionnant Savitzky-Golay Lisse dans l’onglet Lisse de la boîte de dialogue Différencier .
   4. Comme en 5.4.5, reliez les nombres d’onde aux minima de la dérivée seconde aux structures secondaires.
8. Déconvolution de pointe à l’aide d’un logiciel tiers
   1. Après avoir cliqué sur le graphique du spectre d’absorbance de l’amide I, sélectionnez l’icône Analyse | Pics et ligne de base | Analyseur de pics | Ouvrir la boîte de dialogue... (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S32).
   2. Dans la boîte de dialogue Objectif - Ajuster les pics (Pro), définissez l’option Recalculer sur Auto, sélectionnez Ajuster les pics, puis cliquez sur Suivant. (Dossier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S33A).
   3. Dans la boîte de dialogue Mode de ligne de base , définissez le paramètre Mode de ligne de base sur Ligne droite et cliquez sur Suivant (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S33B).
   4. Dans la boîte de dialogue Traitement de la ligne de base , sélectionnez Soustraire automatiquement la ligne de base, cliquez sur le bouton Soustraire maintenant , puis cliquez sur Suivant (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S33C).
   5. Dans la boîte de dialogue Rechercher des pics , désactivez l’option Activer la recherche automatique et cliquez sur Ajouter.
      1. Double-cliquez sur la fenêtre contenant le tracé d’un spectre avec les pics à ajuster.
      2. Sélectionner les pics en fonction des minima observés dans la dérivée seconde (étape 5.7.4) ou dans les tableaux de référence (p. ex., tableau 2).
      3. Cliquez sur OK, puis sur Suivant (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S33D).
   6. Dans la boîte de dialogue Ajuster les pics (Pro), sélectionnez Générer un rapport à partir du résultat de l’ajustement actuel et cliquez sur Ajuster. suivi de Terminer (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S33E).
   7. Évaluez l’onglet PeakProperties1 du classeur pour voir le centre, la zone intégrée et le FWHM de chaque pic (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S34). Comme à l’étape 5.5.9, reliez chaque pic de composant à un type de structure secondaire et évaluez le pourcentage de la structure protéique avec cette structure secondaire.

Gamme de numéros d’onde (cm-1)	Mission
1605−1615	Chaînes latérales Tyr/β-brins agrégés
1616−1621	Brins β agrégés/feuillets β intramoléculaires [faible]
De 1622 à 1627	Feuillets β intermoléculaires [fort]
De 1628 à 1637	Feuilles de β intramoléculaires [fortes]
1638−1646	Bobine aléatoire/Chaînes étendues
De 1647 à 1655	Bobine aléatoire
1656−1662	α-hélices
De 1663 à 1696	Tourne
1697-1703	Nappes β intermoléculaires [faible]

Tableau 2 : Attributions de bandes vibratoires de la région Amide I pour la soie de Bombyx mori sur la base d’une évaluation comparative de plusieurs études de Hu et ^al.57.

Résultats

Une solution de dope idéale est une solution claire, sans précipité et visqueuse, indiquant une dissolution complète des protéines (Figure 7A). À l’inverse, une dissolution incomplète aboutit soit à une suspension laiteuse, soit à des précipités visibles (figures 7B et C). Le temps nécessaire à la dissolution complète des protéines varie en fonction du solvant, certains solvants, tels que les mélanges TFA/TFE/H₂O, dissolvant généralement complètement les protéines dans un intervalle de temps de 30 minutes, tandis que d’autres, tels que le HFIP, peuvent nécessiter une agitation nocturne accompagnée d’un vortex occasionnel.

Figure 7 : Optimisation de la solution de dopation en rotation. (A) Un solvant capable de dissoudre complètement la protéine donne une solution de dope filable claire et visqueuse. La dissolution partielle ou la suspension de la protéine par un choix de solvant non optimal peut entraîner (B) un état trop visqueux, généralement avec un précipité visible ou (C) une suspension laiteuse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 2E montre une fibre représentative dessinée à la main, tandis que la figure 4D montre une fibre filée à l’eau. Avant toute analyse en aval, la microscopie optique est essentielle pour évaluer la qualité de la fibre. La figure 8 montre des micrographies optiques représentatives de fibres de soie recombinantes filées par voie humide adaptées à l’analyse en aval et filées dans deux conditions différentes (voir la figure 3 pour des exemples de configurations de filage humide). La microscopie optique (Figure 8A) montre clairement que ces fibres présentent un diamètre uniforme, avec un diamètre diminué apparent lors de l’application d’un tirage post-spin (c’est-à-dire as-spun (AS) par rapport à post-filé étiré à un rapport de 4x dans 40 % d’éthanol (4x-EtOH)). Le degré plus élevé de biréfringence entraînant un contraste plus important en microscopie à lumière polarisée (Figure 8B) est compatible avec un meilleur alignement moléculaire dans la fibre à la suite du processus d’étirage post-spin. Enfin, il convient de noter que des défauts seront très probablement observés dans une fraction des fibres évaluées, ce qui rendra un segment donné de fibre impropre à l’analyse en aval. Deux exemples de ce type sont illustrés à la figure 9.

Figure 8 : Micrographies optiques représentatives de fibres de soie d’araignée recombinante filées à l’eau. Des fibres à l’état AS et suivant un étirement post-spin 4x dans l’éthanol (EtOH) sont illustrées pour une construction chimérique en soie pyriforme-aciniforme (Py₂W₂) observée par microscopie optique (colonne de gauche) et microscopie à lumière polarisée (colonne de droite). Les images sont reproduites avec la permission de Ghimire et ^al.17. Barres d’échelle = 30 μm. Abréviations : AS = as-spuned ; EtOH = éthanol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Exemple de défauts potentiels de fibre observables à l’aide de la microscopie optique. (A) Exemple de défaut de « bombement ». (B) Un exemple de défaut de « rétrécissement ». Barres d’échelle = 20 μm Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Après s’être assuré qu’il n’y a pas de défauts dans un segment de fibre donné et après avoir déterminé le diamètre (section 3.2 du protocole), des essais de traction peuvent être effectués (p. ex., figure 6). La figure 10 montre des courbes de contrainte-déformation représentatives obtenues pour une soie d’araignée recombinante chimérique filée dans différentes conditions. Selon les conditions de filage, les fibres résultantes vont de cassantes (état AS) à hautement extensibles avec une résistance similaire à celle de l’état AS (état 2x-air) à des fibres beaucoup plus résistantes et moins extensibles (état 4x-EtOH). Il convient de noter que plusieurs segments de fibres et lots de fibres filées doivent être évalués pour évaluer sans ambiguïté et rigoureusement le comportement mécanique.

Figure 10 : Courbe représentative de contrainte-déformation de fibres filées à partir de diverses conditions. Les fibres ont été analysées soit à l’état brut (AS), soit en production à l’aide d’un étirement post-essorage automatisé (rapport d’étirage et condition d’étirement (air vs solvant) indiqués). Figure adaptée avec la permission de Ghimire et al.(2024)¹⁷. Abréviation : AS = as-spun. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Enfin, la structure secondaire de l’état de la fibre peut être évaluée à l’aide de la spectromicroscopie ATR-FTIR. Les spectres typiques de fibres de soie acquis par cette méthodologie (Figure 11A,B) auraient des bandes protéiques caractéristiques, y compris un large pic d’amide A (centré autour de ~3 300 ^cm-1), un pic d’amide I (~1 600-1 700 ^cm-1) et un pic d’amide II (~1 500-1 600 ^cm-1). Ici, nous nous concentrons sur l’évaluation de la région de l’amide I (par exemple, Figure 11C, D). L’analyse de la dérivée seconde est utile comme moyen d’identifier les composants clés du pic d’amide I (Figure 11E, F), fournissant de la crédibilité à la déconvolution quantitative du pic (Figure 11G-J) qui permet d’évaluer et de comparer les proportions du type de structure secondaire observées dans une fibre de soie filée dans une condition donnée.

Figure 11 : Spectres FTIR et analyse de la structure secondaire. (A,B) Spectres FTIR des fibres Py₂W₂ produites par filage humide dans l’état (A) as-spun (AS) et (B) incorporant un étirement 4 post-spin dans l’éthanol. (C, D) Régions Amide I des spectres FTIR montrées en A et B, respectivement. (E-F) Dérivée seconde des régions de l’amide I indiquées respectivement en C et D, calculée à l’aide du progiciel indiqué. (G-J) Déconvolution de crête Amide I réalisée à l’aide des progiciels OMNIC (G et I) ou OriginPro (H et J), les panneaux G et I étant la déconvolution correspondant à C et H et J à D. Abréviations : FTIR = Transformée de Fourier infrarouge ; AS = as-strick. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Au-delà des techniques individuelles, la corrélation des données de structuration secondaire, de performance mécanique et d’orientation (supra)moléculaire est généralement essentielle à la fois pour comprendre les influences des différents paramètres de filage sur le matériau résultant et pour l’optimisation rationnelle du processus de filage. Dans les déconvolutions FTIR illustrées à la figure 11, par exemple, en comparant les conditions AS aux conditions 4×-EtOH pour une soie chimérique, les contributions substantielles de la feuille β à la bande amide I sont claires pour les deux conditions, mais comprennent une plus grande proportion de la structure secondaire totale pour l’état étiré post-filé par rapport à l’état AS, quelle que soit la méthode de déconvolution (par exemple, Figure 11G,H vs. Figure 11I,J). Cela est cohérent avec la résistance considérablement plus élevée observée pour la condition 4×-EtOH que pour l’état AS (Figure 10) et l’amélioration de l’alignement moléculaire dans la condition 4×-EtOH par rapport à l’état AS (Figure 9). Une caractérisation et une analyse détaillées, couvrant la gamme de conditions illustrées à la figure 10, ont été signalées précédemment¹⁷. Nous n’avons donc pas récapitulé l’ensemble de l’analyse ici, mais nous avons plutôt utilisé cette comparaison par paires comme une démonstration de la manière dont ces trois classes de données sont complémentaires les unes des autres et permettent de développer une compréhension beaucoup plus complète du comportement des fibres que n’importe quelle technique isolée.

Fichier supplémentaire 1 : Un fichier contenant les figures supplémentaires S1-S34 illustrant la mesure du diamètre de la fibre, le traitement mécanique des données et l’acquisition et le traitement des données FTIR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Une feuille de calcul permettant de déterminer les principales propriétés mécaniques (c’est-à-dire la contrainte, la déformation, le module de Young et la ténacité) à partir de données de masse en fonction du temps. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La production de protéines recombinantes permet de fabriquer des matériaux dans une grande variété de formats, les progrès récents impliquant que ces matériaux à base de protéines sont sur le point d’être utilisés industriellement plus largement⁵⁸. Ici, nous nous sommes concentrés sur la production de fibres à partir de soie recombinante, car il s’agit du format de soie recombinante directement lié aux soies d’araignées fibreuses indigènes. Les fibres de soie ont été présentées comme ayant de nombreuses applications potentielles en raison des propriétés mécaniques renommées des soies d’araignée naturelles et en raison du potentiel de production durable de fibres haute performance³². Les applications proposées vont des textiles haute performance aux matériaux absorbant l’énergie, en passant par les produits de soins personnels et les soins de santé^58,59. Les dispositifs et matériaux à base de soie d’araignée dans des formats portables ou dans d’autres contextes où la conductivité électrique est améliorée font également l’objet d’une exploration active pour des applications biomédicales et plus larges⁶⁰. Il existe donc un large intérêt pour le développement, l’optimisation et la personnalisation des matériaux à base de soie d’araignée. Dans ce protocole, nous décrivons une série de procédures visant à produire rapidement des fibres, soit après la préparation d’une nouvelle protéine de soie recombinante, soit pour moduler les propriétés des matériaux d’une soie recombinante dont il a déjà été établi qu’elle peut être filée.

Quelle que soit la méthode de filature utilisée, il est essentiel de déterminer les conditions qui permettent la production de dope de spin par le criblage des conditions de solvant/tampon et de la concentration en protéines, comme détaillé ici. L’objectif ultime est la solubilisation de la protéine à une concentration suffisamment élevée pour permettre une conversion rapide en une fibre sans auto-assemblage hors voie en agrégats ou autres espèces insolubles qui empêcheront la filature « productive ». Il s’agit généralement d’une solution transparente, relativement visqueuse, comprenant plus que probablement des espèces auto-assemblées telles que les micelles/nanoparticules^26,61 et/ou la séparation de phase liquide-liquide⁶². Ce protocole ne détaille pas les méthodes permettant d’évaluer de manière exhaustive l’état de dope de spin, car un filage réussi de la fibre peut être obtenu par l’évaluation itérative de diverses dopes de spin et configurations de filage. Des techniques telles que la viscosimétrie, la diffusion de la lumière, la spectroscopie de dichroïsme circulaire dans l’UV lointain, la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire et/ou la microscopie électronique²⁶ permettent d’obtenir un aperçu moléculaire et supramoléculaire détaillé. Il convient également de noter que la protéine recombinante elle-même peut être modifiée pour améliorer son comportement pour la rotation, l’inclusion des domaines globulaires non répétitifs N- et C-terminaux étant un exemple de méthode pour augmenter la spidroïne^{solubilité 32}. En bref, sans une identification appropriée du spindope, il n’est pas possible de procéder à des tests comparatifs des conditions de spinning.

Une fois qu’une ou plusieurs conditions de spin dope ont été identifiées, le dessin à la main fournit un moyen rapide d’évaluer les propriétés de la fibre de soie. Étant donné que des volumes nettement plus faibles de dope sont nécessaires pour un dessin à la main productif, des masses beaucoup plus faibles de protéines pures sont nécessaires, ce qui en fait un excellent précurseur des approches automatisées de filage humide. Cela fournit également une méthode très simple et très simple pour comparer directement les propriétés des fibres de différents spidroïnes^33, encore une fois avec l’avantage que la production de fibres est relativement simple avec de petites quantités de protéines. Cela signifierait que l’optimisation de l’expression des protéines et des protocoles de purification pour obtenir les rendements plus élevés nécessaires à la filature humide peut être concentrée sur les spidroïnes les plus prometteuses. L’inconvénient, bien sûr, est que l’étirage à la main ne se prête pas à la production de longues fibres continues ou de quantités substantielles de fibres de manière rationalisée.

Avec suffisamment de protéines, la filature humide offre alors des avantages pour une production rationalisée de fibres longues et continues³². Non seulement cela, mais les propriétés des fibres peuvent être facilement modulées par le processus de filage. Le choix des conditions de dope en filature, par exemple, fournit une voie claire pour améliorer la mécanique des fibres. Dans le cas d’une protéine de soie aciniforme recombinante de ~60 kDa, par exemple, le passage d’une dope de spin à une autre avec tous les autres paramètres de filage restant constants a conduit à des changements spectaculaires de l’extensibilité des fibres²⁶. Cela était, à son tour, lié à la manière dont la spidroïne aciniforme s’est assemblée dans la dope de spin avant la filature, l’homogénéité améliorée des nanoparticules auto-assemblées dans la dope de spin étant corrélée à l’amélioration de la mécanique des fibres. L’incorporation d’un tirage post-spin, notant que le rapport d’étirement doit être optimisé pour un type de fibre donné, améliore également généralement la mécanique des fibres de soie grâce à une combinaison d’un alignement moléculaire amélioré et d’une conversion améliorée, par exemple, en cristallites à feuilles de β qui renforcent les fibres³². Enfin, l’utilisation de différentes conditions pendant l’étape de post-tréfilage fournit un moyen de moduler les propriétés de la fibre. L’exposition au solvant immédiatement avant ou pendant le tirage peut modifier considérablement les propriétés mécaniques et structurelles des fibres^17,38, en notant que différentes spidroïnes auront des préférences et des tolérances différentes en matière de solvant (par exemple, les fibres aciniformes recombinantes étant hautement compatibles avec l’eau^26,31 par rapport aux fibres pyriformes recombinantes subissant une contraction dans l’eau³⁸ par rapport aux fibres de la spidroïne chimérique pyriforme-aciniforme présentant la compatibilité avec l’eau de la spidroïne aciniforme bien qu’elle représente moins de la moitié de la protéine en masse¹⁷).

Le protocole décrit fournit une approche hautement personnalisable et polyvalente pour évaluer et optimiser la filabilité et les propriétés des fibres des soies d’araignée recombinantes. Dans tous les cas, les propriétés de la fibre résultante doivent être analysées et comparées de manière cohérente et robuste. Ici, nous proposons l’utilisation de la microscopie optique, y compris la microscopie à lumière polarisée, les essais de traction et la spectromicroscopie FTIR comme une « boîte à outils standard » de techniques à cet effet. Des techniques supplémentaires de caractérisation biophysique et des matériaux peuvent être appliquées pour élargir la compréhension des fibres résultantes, mais cet ensemble de techniques offre une couverture exceptionnelle des propriétés clés de la morphologie, de l’alignement/anisotropie intrafibrillaire, des performances mécaniques et de la structuration secondaire des protéines. En particulier, bien que la spectromicroscopie FTIR offre un moyen relativement simple d’évaluer la structuration secondaire des fibres de soie et que la microscopie à lumière polarisée permette des inférences sur le degré d’alignement moléculaire amélioré qui a été atteint, d’autres méthodologies telles que la spectroscopie RMN à l’état solide^63,64, la diffraction des rayons X⁶⁴, la spectromicroscopie Raman polarisée⁶⁵ et/ou la microscopie optique non linéaire⁵⁴ devrait être pris en compte afin d’évaluer de manière plus complète la cristallinité, l’alignement et la structuration dans les fibres de soie pour une élucidation complète de la relation structure-mécanique. Étant donné que la filature humide convient à d’autres types de protéines⁶⁶, nous prévoyons que ce protocole sera généralement applicable au-delà des soies recombinantes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1,1,1,3,3,3-hexafluroropropanol (HFIP)	Thermo Fisher Scientific	445820500	Utilisé pour la préparation de dope
1725LTSN seringue avec aiguille cimentée Luer Tip  ;	Hamilton	81100	Utilisé pour la filature humide
2,2,2-trifluoroéthanol (TFE)	Sigma-Aldrich	T63002-500G	Utilisé pour la préparation de dope
Éthanol absolu	Fisher Scientific	BP28184	Utilisé pour le bain de coagulation  ;
Acide acétique	Fisher Scientific	A38-212	Utilisé pour la préparation de dopage
Balance analytique	Mettler Toledo  ;	XS105 Dispositif	d’essai à la traction
Chlorure de calcium (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C-3881	Utilisé pour la préparation du dopage
Acide citrique  ;	Millipore Sigma	77-92-9	Utilisé pour la préparation du dopage
Ordinateur	Raspberry Pi	Raspberry Pi 4 Modèle B  ;	Capteur de filature humide - permet d’utiliser l’interface utilisateur graphique pour contrôler les moteurs pas à pas
Hydrogénophosphate disodique (Na2HPO4)	Millipore Sigma	7558-79-4	Utilisé pour la préparation de dopage
Acide formique  ;	Fisher Scientific	A118-500	Utilisé pour la préparation de dopant
Lames de verre  ;	Millipore Sigma	S8902-1PAK	Utilisé pour le montage de fibres
Acide chlorhydrique (HCl)	EM Science	HX0603-53	Utilisé pour la préparation de dope
MCT-A Détecteur refroidi  ;	Thermo Fisher Scientific	840-199300	Évaluation FTIR de la structure secondaire de la fibre
Plaque de montage	Fabriqué en interne		Dispositif de filage humide
NEMA 17 Moteur pas à pas biopolaire	STEPPERONLINE	17HS15-1504S-X1	Dispositif de filage humide - remarque : plusieurs moteurs nécessaires pour effectuer l’étirement post-spin
Spectromicroscope FTIR Nicolet iN10	Thermo Fisher Scientific	912A0604	Évaluation FTIR de la structure secondaire de la fibre
Nicolet iN10 Mapping Stage	Thermo Fisher Scientific	840-198800	Évaluation FTIR de la structure secondaire de la fibre
Nicolet iN10 Joystick de platine motorisée  ;	Thermo Fisher Scientific	840-199800	Évaluation FTIR de la structure secondaire de la fibre
Nicolet Slide-On Ge Micro Tip ATR 350	Thermo Fisher Scientific	840-194800  ;	Évaluation FTIR de la structure secondaire de la fibre
OMNIC Picta ver. 1.7.224	Thermo Fisher Scientific	INQSOF018	Logiciel de contrôle d’instrument FTIR
OMNIC ver. 9.11.745	Thermo Fisher Scientific	INQSOF018	Logiciel de traitement et d’analyse de données spécifiques à l’instrument FTIR
Microscope optique/polarisé	Zeiss Canada	Axio Observer A1	Microscope optique inversé
OriginPro 2025 10.2 SR1	OriginLab Corporation	OriginPro 10.200196	Logiciel tiers de traitement et d’analyse de données FTIR
Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4)	Fisher Scientific	P285-10	Utilisé pour la préparation
dope Phosphate de potassium dibasique (K2HPO4)	Fisher Scientific	BP363-500	Utilisé pour la préparation de dope
Alimentation	ALITOVE	ALT-1205	Appareil de filage humide - Adaptateur d’alimentation 12V 5A Convertisseur AC 100-240V Entrée avec sortie DC 5.5x2.5mm Jack - remarque : pour des performances optimales, peut nécessiter une alimentation séparée pour chaque moteur
Acétate de sodium  ;	Sigma-Aldrich	S2889-1KG	Utilisé pour la préparation de dope
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Millipore Sigma	1310-73-2	Utilisé pour la préparation de dope
Rouleaux tournants  ;	Fabriqué en interne		Utilisé pour la filature humide
Câbles de moteur pas à pas	XMSJSIY	B0BD5FV3R2	Dispositif de filature humide - fournit une connexion des contrôleurs de moteur pas à pas aux moteurs pas à pas
Contrôleur de moteur pas à pas (Pi HAT)	Adafruit	DC & Moteur pas à pas HAT pour Raspberry Pi	Permutation du contrôleur de moteur du dispositif de rotation humide 1 - notez que la vitesse de rotation du moteur est limitée à ~46 tr/min
Contrôleur de moteur pas à pas (USB)	Polulu	Tic T249	Permutation du contrôleur de moteur du dispositif de rotation humide 2 - à utiliser lorsqu’une rotation supérieure à 46 tr/min peut être nécessaire
Pompe à seringue	Modèle scientifique KD	Scientific 100	Dispositif d’essai de traction et dispositif de filage humide
Acide trifluoroacétique (TFA)	Millipore Sigma	TX1276-7	Utilisé pour la préparation de dope
Tris-chlorhydrate  ;	EMD Millipore	9310-500GM	Utilisé pour la préparation du dope
Hub USB	Acasis	B07Q3TYF15  ;	Appareil à rotation humide - Hub USB alimenté 48W - ACASIS 10 ports Hub de données USB 3.0 - avec interrupteurs On/Off individuels et adaptateur secteur 12V/4A Répartiteur USB - interface entre les contrôleurs de moteur pas à pas Raspberry Pi et Tic T249