Procédure de transection/resuture du nerf sciatique de la souris pour étudier la réparation nerveuse et la récupération fonctionnelle

Summary

Ce protocole décrit un modèle de transection et de resuture du nerf sciatique chez la souris pour étudier la régénération nerveuse périphérique à l’aide de neurones ganglionnaires dorsaux adultes. Il permet une analyse in vivo de la repousse axonale, de la réinnervation musculaire et de la récupération fonctionnelle après une lésion nerveuse.

Abstract

La réparation nerveuse est cruciale pour restaurer la fonction après une lésion axonale. Cependant, les neurones matures du système nerveux central (SNC) ont une capacité limitée à régénérer leurs axones après une blessure en raison d’une capacité de croissance intrinsèque diminuée et d’un environnement hostile. En revanche, les neurones du système nerveux périphérique (SNP) présentent un potentiel régénératif robuste. Parmi eux, les neurones adultes du ganglion de la racine dorsale (DRG) sont particulièrement connus pour leur capacité à se régénérer efficacement après des lésions nerveuses périphériques, ce qui en fait un modèle idéal pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la réparation nerveuse. Ici, une technique de microsuture modifiée, appelée « boucle avant transection », est décrite pour générer un modèle de transection et de resuture du nerf sciatique chez la souris, suivi d’une analyse de la régénération axonale. Des évaluations comportementales et des réinnervations musculaires sont également démontrées pour évaluer la récupération fonctionnelle. Après la transection et la resurrection du nerf sciatique, les animaux présentent initialement des déficits comportementaux, mais la guérison complète est généralement observée 30 jours après la blessure. L’application de médicaments favorisant la fusion axonale au site de la blessure accélère considérablement la récupération fonctionnelle. Ce système modèle offre un outil puissant pour étudier les mécanismes régissant la réparation nerveuse des mammifères in vivo.

Introduction

La lésion axonale est une conséquence fréquente et grave des lésions cérébrales et de la moelle épinière, souvent causée par des traumatismes, des neurotoxines ou des troubles neurologiques qui perturbent la connectivité neuronale et altèrent la régénération^{axonale 1,2}. Tous les neurones ne possèdent pas une capacité intrinsèque de régénération, cruciale pour la réparation des axones sectionnés. Le taux de régénération axonale est influencé par plusieurs facteurs, notamment le potentiel de croissance intrinsèque du neurone, l’efficacité de synthèse des protéines, la dynamique du cytosquelette, l’élimination des débris de myéline et la disponibilité des facteurs^{de croissance 3,4}.

Dans le système nerveux central (SNC) adulte des mammifères, les lésions axonales entraînent une diminution de la capacité régénérative, principalement en raison de l’absence de facteurs intrinsèques favorisant la croissance et de la présence d’indices extrinsèques^{inhibiteurs 1,5}. En revanche, les axones du système nerveux périphérique (SNP) possèdent une capacité robuste à se régénérer après une blessure, grâce aux mécanismes intrinsèques d’auto-réparation des neurones périphériques et à la réactivation rapide des programmes de croissance pro-régénérative. Lors de la blessure, le segment distal de l’axone se détache du soma neuronal et subit une dégénérescence wallérienne, caractérisée par une désintégration et une fragmentation^{axonales 6,7}. L’élimination efficace des débris axonaux et de myéline par les cellules gliales est essentielle à une régénération réussie, car elle empêche la formation de cicatrices susceptibles de freiner la croissance^{axonale 3,8}. Ce processus, combiné au remodelage du cytosquelette des axones blessés, soutient la repousse du moignon proximal et facilite la réinnervation de la cible. Ces événements se produisent en phases partiellement chevauchées, durant lesquelles l’activation induite par une blessure de facteurs de transcription tels que ATF3 et c-Jun favorise des programmes d’expression génique^{pro-régénérative 4,9,10}.

La fusion axonale régénérative représente un mécanisme efficace pour restaurer la connectivité neuronale après une lésion^{axonale 11}. Ce processus a été décrit pour la première fois chez l’écrevisse Procambarus clarkii en 1967-12 et a depuis été documenté chez plusieurs espèces^{13, 14, 15, 16}, dont Caenorhabditis elegans¹⁷. Bien que les preuves directes de fusion axonale chez les mammifères restent limitées, des stratégies d’induction de fusion ont été utilisées avec succès pour améliorer la réparation^{nerveuse 11}. Notamment, le composé chimique fusogène polyéthylène glycol (PEG) favorise le rebouchement membranaire et a démontré qu’il facilite la récupération fonctionnelle après des lésions nerveuses et de la moelle épinière dans les modèles^mammifères 18,19,20,21,22,23,24. Des découvertes récentes indiquent que la déplétion de la glutathion peroxydase (GPX) est suffisante pour favoriser la fusion axonale chez C. elegans²⁵. De même, les souris knockout conditionnelles de Gpx4 ou celles traitées avec l’inhibiteur de GPX ML162 ont montré une récupération fonctionnelle accélérée après la transection du nerf sciatique, potentiellement par une fusion axonale^{accrue 25}.

Le nerf sciatique est un nerf mixte composé d’axones sensoriels, somatiques moteurs et^{autonomes moteurs 26}. Elle provient des segments spinaux L4 et L5 chez les^{rats 27}, et des segments L3 et L4 chez les^{souris 28}. En raison de son accessibilité et de sa cohérence anatomique, la lésion du nerf sciatique est devenue l’un des modèles les plus largement utilisés pour étudier la régénération nerveuse^{périphérique 29,30}. Ces modèles permettent d’étudier à la fois les mécanismes neuronaux intrinsèques et les facteurs environnementaux extrinsèques qui influencent la croissance axonale et la récupération ^{fonctionnelle 3,4,9}. L’utilisation de l’écrasement du nerf sciatique comme paradigme expérimental en neurosciences remonte à la fin du XIXe siècle²⁹. En plus des modèles de compression nerveuse, la transection nerveuse est largement utilisée pour étudier la régénération axonale et la récupération fonctionnelle. Cependant, la transection classique du nerf sciatique suivie de suture chez la souris est souvent moins reproductible et fiable que chez les rats, en raison de la petite taille du nerf et de sa texture^{fragile 31}.

En utilisant un modèle modifié de transection et de resuture du nerf sciatique, appelé « boucle avant transection », des modèles reproductibles de transection et de resuture du nerf sciatique ont été^{générés avec succès 25}. Cette approche élimine le besoin de manipuler le nerf après la transection en pré-insérant la suture avant la coupe, réduisant ainsi le stress mécanique et minimisant la variabilité due à la technique chirurgicale. Des niveaux modérés de modulation GPX ont contribué à la récupération fonctionnelle après une transection complète du nerf^{sciatique de la souris 25}. Le co-traitement des faibles concentrations ML162 (0,25 μM⁾³², de l’inhibiteur du GPX et du polyéthylène glycol (PEG, 500 mM)18,19,20,21,22,23,24 sur la lésion de resuture du nerf sciatique (SNT) a réussi à améliorer le score de comportement évalué par le pinc, l’asymétrie de la faille du pied et le test d’étalement des ^{orteils 25,33.34}. Les fragments d’axones distaux amputés des neurones du ganglion dorsal des mammifères (DRG) dégénèrent en moins de 3 jours, entraînant une perturbation des jonctions neuromusculaires (NMJ^)6,35, et les neurones DRG régénératifs réinnervent les muscles pour récupérer leurs fonctions. Le groupe de co-traitement SNT/ressuture ML162/PEG a montré des NMJ innervées et des scores de comportement améliorés au début (3 jours après l’opération), indiquant une récupération précoce de la fonction^{neuromusculaire 25}.

Ici, la méthode de microsuture « boucle avant transection » et l’administration du médicament qui ont permis les observations ci-dessus chez la souris sont décrites. Un protocole de fusion PEG-Fusion déjà établi, qui permet une réparation rapide des nerfs de rat sectionnés, a été modifié¹⁸. Le polyéthylène glycol (PEG) a d’abord été rapporté comme favorisant la reconnexion exogène des axones géants médiaux (MGA) des écrevisses coupées in^{vitro 36}. Les protocoles de fusion PEG ont amélioré les résultats comportementaux dans 25 % à 30 % des essais impliquant des lésions par écrasement du nerf sciatique du rat, bien que la récupération fonctionnelle n’ait pas été observée aux premiers^{points 34}. Les affinements ultérieurs ont intégré le concept de scellement endogène par^{membrane 37}. Après une lésion nerveuse, la réparation rapide du plasmalémme est neuroprotectrice et prévient la neurodégénérescence. L’accumulation induite par Ca²+ de vésicules liées à la membrane facilite ce processus de^{scellement 38}. La transection nerveuse complète perturbe l’axolemme ainsi que les gaines endonévriales, périnébrales et épinéuriales au site de la lésion. La microsuture de la gaine épinéuriale aligne les moignons nerveux proximal et distal. Lors de l’étape de suture, l’utilisation d’une solution physiologique hypotonique Ca²⁺ libre réduit la formation de vésicules enfermées par la membrane, maintenant les gaines endonébrales et périnébrales ouvertes et permettant de les approcher étroitement par les sutures épinéuriales. Par la suite, l’application de solution saline contenant Ca²⁺ induit l’accumulation de vésicules pour sceller la perturbation plasmalémale^{restante 18}.

Dans ce protocole, des souris adultes FVB (8-10 semaines) et des souris C57BL/6 ont été utilisées, sans différence spécifique à la souche observée. Le nerf sciatique chez la souris se situe à environ 1 à 2 mm sous le muscle glutéen au niveau du milieu des cuisses et est notablement plus fin et plus fragile que chez les rats, nécessitant une plus grande précision chirurgicale lors de la dissection et de la suture. Il faut veiller à éviter un étirement excessif des nerfs ou une manipulation excessive qui pourrait compromettre la récupération fonctionnelle. Cette approche consiste à sectionner complètement le nerf, créant un espace physique entre les moignons proximal et distal. Parce que cet écart inhibe la régénération axonale directe, la récupération réussie nécessite généralement une intervention microchirurgicale ou une greffe nerveuse.

Étant donné que le nerf sciatique de la souris est plus fin et plus délicat que celui du rat, une plus grande précision chirurgicale est requise. Bien que la microsuture soit couramment utilisée, elle peut involontairement provoquer des traumatismes supplémentaires dus à une manipulation excessive ou à des passages répétés de^{l’aiguille 39}. Ces limitations peuvent introduire une variabilité et potentiellement perturber l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques. Par conséquent, obtenir des résultats chirurgicaux constants tout en minimisant les lésions nerveuses induites par la suture est essentiel pour évaluer de manière fiable la récupération fonctionnelle dans les modèles de transection nerveuse. En utilisant cette méthode « boucle avant transection », des modèles reproductibles de transection et de resuture du nerf sciatique ont été générés, et les effets du double traitement avec PEG et ML162 sur la récupération fonctionnelle ont été évalués. Dans l’ensemble, malgré son usage généralisé, le modèle de transection du nerf sciatique chez la souris pose des défis techniques en raison de la petite taille et de la fragilité du nerf. Cette méthode de resuture modifiée décrite ici répond à un besoin critique d’un protocole microchirurgical standardisé et reproductible qui minimise les dommages mécaniques.

Protocol

Toutes les procédures animales ont été menées conformément aux directives du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centre des sciences de la santé de l’Université du Texas à San Antonio (Numéro de protocole : 20200082AR). Des souris adultes mâles et femelles FVB (8-10 semaines, 20-25 g) ont été utilisées pour les procédures expérimentales JoVE décrites ici. C57BL/6 souris (8-10 semaines, 20-25 g) n’ont été utilisées que lors de chirurgies préliminaires menées avant les expériences formelles pour optimiser la manipulation et la précision des sutures. Ces séances d’entraînement ont confirmé que la procédure « boucle avant transection » produisait des résultats comparables dans les deux souches ; par conséquent, toutes les données formelles présentées dans ce manuscrit ont été obtenues à partir de souris FVB. Au total, dix souris FVB (cinq mâles et cinq femelles) ont initialement été incluses pour la transection du nerf sciatique suivie d’un traitement ML162 + PEG. Un animal présentait une variation anatomique congénitale où le nerf sciatique se divisait en deux branches principales avant le site de transection, ce qui entraînait une chirurgie incomplète et une exclusion de l’analyse. Par conséquent, des analyses comportementales et histologiques ont été réalisées sur neuf animaux (n = 9). Les deux sexes ont montré une récupération régénérative et comportementale comparable, et aucune différence spécifique au sexe n’a été observée. Une souris supplémentaire a subi une double pénétration de suture sans transection nerveuse (contrôle simulé) afin d’évaluer l’impact potentiel de la procédure elle-même sur les résultats comportementaux. Aucune différence notable dans la réponse régénérative n’a été observée entre les sexes. Les animaux étaient hébergés dans des conditions standard avec un cycle clair/obscur de 12 heures, à 75 °F et une humidité relative de 40 % à 60 %, avec un accès improvisé à la nourriture et à l’eau. Des souris mâles et femelles ont été utilisées, et aucune différence notable n’a été observée entre les animaux mâles et femelles. Les interventions chirurgicales ont été réalisées sous anesthésie isoflurane du système d’anesthésie à faible débit SomnoSuite. Des tests comportementaux ont été réalisés à partir du deuxième jour post-opératoire, puis répétés les jours 4, 7, 10, 14, 18, 22 et 27, comme indiqué dans les chiffres correspondants. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Transection/resuture du nerf sciatique et traitement médicamenteux

1. Placez l’animal sur un coussin chauffant où le nerf sciatique pouvait être observé sous un microscope stéréoscopique (Figure 1A).
2. Anesthésiez la souris à l’aide du système d’anesthésie à faible débit SomnoSuite.
   REMARQUE : Confirmez la profondeur de l’anesthésie en l’absence de réflexes, comme une réaction à une pincée de l’orteil, avant d’initier la chirurgie. Appliquez une pommade ophtalmique vétérinaire sur les yeux pour éviter la sécheresse cornéenne.
3. Rase les poils sur la cuisse et autour.
   REMARQUE : Enlevez les poils rasés et tombés aussi proprement que possible. Sinon, les poils colleront à la suture en nylon 10-0 et contamineront le nerf sciatique. Les poils résiduels peuvent être délicatement retirés à l’aide de ruban adhésif de laboratoire ou de ruban adhésif après le rasage afin d’assurer un champ chirurgical propre. Désinfectez le site chirurgical en essuyant séquentiellement la zone rasée avec 70 % d’éthanol, de bétadine, puis en essuyant finalement à 70 % d’éthanol à l’aide de boules de coton autoclavées.
4. Localiser l’os fémur et réaliser une petite incision cutanée d’environ 1,0 cm (plage 0,8-1,2 cm) au niveau moyen de la cuisse, environ ~1 mm postérieur et parallèlement à l’os du fémur à l’aide de ciseaux chirurgicaux fins.
   1. Rétractez doucement le grand fessier pour exposer le biceps fémoral sous-jacent. Ensuite, utilisez les extrémités des ciseaux pour séparer doucement les têtes antérieure et postérieure du biceps fémoral, sans couper, afin d’exposer le nerf sciatique sous l’encoche sciatique. Ces étapes sont réalisées sous observation visuelle directe, et non au microscope.
5. Extraire le nerf sciatique du corps à l’aide de pinces micro-disséquatrices pour faciliter la chirurgie du nerf sciatique (Figure 1A).
   REMARQUE : Sécurisez les pinces avec du ruban adhésif pour éviter qu’elles ne dépassent un certain niveau et minimiser les dommages au nerf sciatique. Placez la pointe de la pince sous le nerf sciatique et soulevez le nerf sciatique vers le haut en utilisant la cuisse de la souris comme point d’appui. Veillez à soulever le nerf seulement autant que nécessaire pour faciliter la suture, et évitez d’appliquer de la tension ou de le tirer vers l’extérieur, car un étirement excessif peut endommager les axones ou les structures environnantes.
6. Concentrez le microscope sur le nerf sciatique exposé. À partir de cette étape, passez à l’étape 15 à l’aide d’un microscope (Figure 1A).
7. Pénétrez deux fois le nerf sciatique avec une suture en nylon 10-0 (Figure 1B,C). Passe aux étapes 1 à 8 pour le contrôle non circonci. Passez à l’étape 1 à 11 pour la transection nerveuse.
   REMARQUE : Deux pénétrations ont été effectuées à environ une largeur nerveuse l’une de l’autre (~0,7 mm), positionnées symétriquement de chaque côté du site de transection prévu. Cet espacement assurait un alignement correct des moignons proximal et distal tout en minimisant les contraintes mécaniques sur la lésion. Effectuez une pénétration par le centre du nerf sciatique avec la suture, en veillant à ce que les deux pénétrations effectuées par la suture soient précisément parallèles. Les points de suture 10-0 sont petits et doivent être contrôlés avec une pince très fine. Le nylon 10-0 non absorbable a été utilisé car il offre une excellente stabilité à la traction et une réactivité tissulaire minimale pendant la période d’observation de 30 jours. Ce matériau est largement utilisé dans les modèles microchirurgicaux de réparation nerveuse chez la souris et le rat^18,31. Les points de suture absorbables n’ont pas été utilisés car une dégradation progressive pourrait compromettre l’alignement des moignons nerveux tranchés avant la récupération fonctionnelle complète. Pour minimiser la variabilité dépendante de l’opérateur, toutes les interventions chirurgicales étaient réalisées par un seul chirurgien formé après une pratique microscopique approfondie sous stéréomicroscope. La méthode « boucle avant transection » réduit encore davantage la variabilité en éliminant le besoin de manipulation nerveuse après transsection, assurant ainsi un alignement et une tension constants entre les animaux. Cela demande beaucoup de pratique et un haut niveau de contrôle. Avant de pratiquer des chirurgies animales, les débutants peuvent trouver utile de pratiquer le mouvement de suture en utilisant de fins fils synthétiques comme le fil dentaire pour développer la dextérité et le contrôle sous un stéréomicroscope.
8. Faites soigneusement un nœud avec la suture en nylon.
9. Placez le nerf sciatique exposé sous la couche musculaire et refermez la peau à l’aide de points de suture en nylon 4-0.
10. Déterminez que la double pénétration du nerf sciatique avec une suture en nylon 10-0 n’affecte pas le comportement de la souris.
    REMARQUE : Pour confirmer cela, les souris ayant subi une double pénétration sans transection ont été soumises aux mêmes tests comportementaux que dans les groupes expérimentaux, notamment la piqûre, l’asymétrie de faille du pied et l’étalement des orteils. Ces souris ont constamment obtenu des scores complets équivalents à ceux des témoins sauvages non opérés, ce qui indique que la procédure de suture seule n’a pas altéré la fonction du nerf sciatique.
11. Coupez le nerf sciatique à mi-chemin entre les deux points de suture en nylon 10-0 à l’aide d’un scalpel (Figure 1D).
    REMARQUE : Pour minimiser la variabilité, toutes les interventions ont été réalisées par le même expérimentateur formé selon une procédure standardisée. De plus, le design « boucle avant transection » minimise intrinsèquement la variabilité en évitant la manipulation nerveuse après la transsection, assurant ainsi un placement et une tension cohérents des sutures sur tous les animaux. La position des points de suture a été vérifiée au microscope disséquant afin d’assurer l’uniformité entre les animaux.
12. Range les pinces.
13. Lavez le nerf coupé avec du sérum tampon phosphate sans Ca²+ (PBS ; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM_{Na 2}HPO₄/NaH₂PO₄, pH 7,4), préparé sans chlorure de calcium.
    REMARQUE : Rincez le moignon nerveux sectionné avec du PBS sans calcium pendant environ 10 à 20 secondes pour purifier le sang et éviter un scellement prématuré. La resuture doit être effectuée rapidement dans 1 à 2 minutes pour maintenir l’alignement et la viabilité des tissus.
14. Retirez le PBS libre de Ca²⁺ en l’absorbant avec un mouchoir.
15. Nouez soigneusement un nœud avec la suture en nylon (Figure 1E). Passez à l’étape 20 si le traitement médicamenteux n’est pas prévu ou nécessaire.
    REMARQUE : Un nœud carré standard était utilisé pour la microsuture, composé de deux coups opposés légèrement serrés avec une pince fine sous un stéréomicroscope. Les deux axones sectionnés, reliés par la suture, reprennent une forme proche de leur forme d’origine. La reconnexion d’un vaisseau sanguin sectionné peut être un indicateur visuel que les moignons nerveux proximal et distal sont correctement alignés. Pendant la procédure, les tissus doivent paraître frais et humides, sans pâleur ni compression. Évitez de nouer la suture trop fort, car cela pourrait effondrer les vaisseaux sanguins ou déformer le nerf. Avant de nouer le nœud final, assurez-vous que les extrémités nerveuses sont approximatives sans tension. Si nécessaire, repositionnez doucement le membre pour faciliter un alignement naturel plutôt que de tirer sur le nerf, car une tension excessive peut augmenter le risque de névrome ou de fibrose.
16. Placez 0,25 μM de ML162 dans du DMSO dilué en PBS sur le nerf sciatique suturé à l’aide d’une seringue. Laissez le nerf sciatique suturé être immergé dans le médicament pendant 1 minute.
17. Retirez le ML162 en l’absorbant avec un coton-tige stérile.
18. Placez 500 mM de PEG dans de l’eau distillée, pré-chauffés à 37 °C, sur le nerf sciatique suturé à l’aide d’une seringue. Laissez le nerf sciatique suturé être immergé dans le médicament pendant 1 minute.
    REMARQUE : 500 mM de PEG est une solution dense qui peut devenir solide à température de salle de fonctionnement. Placez la seringue sur une bouillotte chauffante pendant l’opération pour garantir que le PEG reste liquide. On pense que le PEG favorise la fusion membranaire en retirant les molécules d’eau entre les bicouches lipidiques adjacentes, permettant ainsi un contact étroit entre les membranes et une fusion spontanée. Bien que le mécanisme moléculaire précis reste encore à l’étude, cette approche a démontré faciliter la continuité axonale et améliorer la récupération fonctionnelle dans les modèles de lésions nerveuses périphériques.
19. Retirez le PEG en l’absorbant avec un mouchoir.
20. Laver le nerf suturé avec un PBS contenant du Ca²⁺ (PBS complété par 1 mM de_{CaCl 2} ; 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de tampon phosphate, pH7,4).
21. Retirez le PBS contenant du Ca²⁺ en l’absorbant avec un tissu.
22. Placez le nerf sciatique exposé sous la couche musculaire et refermez la peau à l’aide de points de suture en nylon 4-0.
23. Une fois l’animal remis de l’anesthésie, ramenez-le dans sa cage.
    REMARQUE : Après la fermeture de la peau, le site chirurgical a été traité avec une pommade antibiotique topique contenant un analgésique. Chaque animal était surveillé sur une bouillotte jusqu’à ce qu’il retrouve suffisamment de conscience pour maintenir la couchée sternale. Les animaux étaient ensuite hébergés individuellement et retournés à leur groupe seulement après une récupération complète de la fonction motrice. Bien que l’environnement chirurgical n’ait pas été maintenu sous une hotte à flux laminaire, tous les instruments chirurgicaux étaient stérilisés et les procédures étaient réalisées selon une technique aseptique avec des mains gantées et des outils stériles.

2. Test de comportement - Piqûre

REMARQUE : Pour évaluer la réponse à sensibilité mécanique à haut seuil après une^{blessure 33}.

1. Placez la souris dans une grille métallique et laissez-la se déplacer librement pendant 30 minutes pour s’habituer au nouvel environnement.
2. La partie la plus latérale de la surface plantaire de la patte postérieure était divisée en 5 zones (de A à E). Appliquez doucement l’Austerlitz (taille 000) sur la surface plantaire de la patte ipsilatérale. La piqûre a été appliquée deux fois, de l’orteil le plus latéral (zone A) jusqu’au talon (zone E).
   REMARQUE : Ne pénétrez pas la peau.
   REMARQUE : Une réponse a été considérée comme positive lorsque l’animal a rapidement retiré sa patte des deux stimuli à piqûres. La souris a reçu la note 1 pour cette zone puis a été testée pour la suivante (maximum 5). Si aucune des candidatures ne suscitait de réponse positive, la note globale était de 0. Utilisez le territoire saphène du même côté ipsilatéral comme contrôle positif. Cela suscitera toujours une réponse positive.

3. Test de comportement - Asymétrie de faute du pied (FF)

REMARQUE : Pour mesurer la capacité des axones sciatiques à innerver les muscles plus proximaux³⁴.

1. Laissez les animaux se déplacer librement sur une grille métallique surélevée sur la cage pour s’habituer à l’environnement. Un essai comprend un total de 50 pas par membre postérieur.
2. Marque quand les animaux font un faux pas. Les critères de notation sont les suivants.
   Score 1 : C’est partiellement responsable. Tiré en arrière avant que la jambe ne tombe complètement jusqu’à la cuisse.
   Score 2 : Totalement faute. Je suis complètement tombé jusqu’à l’entrejambe.
3. Calculez le score composite de faute du pied à partir de tous les membres postérieurs blessés et non blessés des animaux à chaque moment post-opératoire.
   Score composite des fautes au pied = (# fautes partielles x 1) + (# fautes complètes x 2)
4. Divisez le score composite de faute du pied par 50 (nombre total de pas par membre) pour obtenir le pourcentage de faute pour chaque membre postérieur.
   % de faute du pied = Score composite de faute du pied/50 (nombre total de pas) x 100 %
5. On soustrait les failles du pied dans le membre postérieur blessé de la proportion de failles du pied dans le membre postérieur intact pour obtenir un score d’asymétrie pour chaque animal à un moment post-opératoire donné.
   Score d’asymétrie de faute du pied (FF ) = %FF (membre intact) - %FF (membre blessé)

4. Test de comportement - Propagation des orteils

REMARQUE : Pour évaluer la récupération motrice après une lésion nerveuse. Selon une étude antérieure, le test moteur de dispersion des orteils est plus sensible que l’analyse de la marche pour détecter la récupération de la fonction motrice après une lésion du nerf^{sciatique 30}.

1. Couvrez doucement l’animal avec un morceau de tissu et soulevez la queue pour une observation claire des pattes arrière.
   REMARQUE : Alternative : Attrapez doucement la nuque de la souris, ajustez la queue, retournez-la et faites-la se tortiller pour observer le mouvement de l’orteil.
2. Attribue le score d’écartement des orteils comme suit :
   Score 2 : En pleine expansion. Définissez comme un écartement complet, large et soutenu de tous les orteils pendant au moins 2 secondes.
   Score 1 : Propagation intermédiaire. Tout mouvement qui n’atteint pas un score complet d’étalement. Trembler légèrement, ou bouger partiellement.
   Score 0 : Pas de spreading. Aucun mouvement du tout.
   REMARQUE : Toutes les évaluations comportementales (piqûre de l’épingle, faute du pied et propagation des orteils) ont été revérifiées par un expérimentateur aveugle aux groupes de traitement. Les animaux ont été assignés au hasard aux groupes de traitement au moment de l’opération conformément au plan utilisé dans notre étude précédente (Ko et ^al.25), qui comprenait quatre conditions expérimentales (Resuture uniquement, PEG, ML162, ML162 + PEG). L’article actuel présente des données du groupe ML162 + PEG, analysées indépendamment tout en conservant la rigueur expérimentale initiale.

5. Perfusion et traitement des tissus pour l’histologie

1. Anesthésiez profondément l’animal et effectuez une perfusion transcardiale avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) via le ventricule gauche.
2. Incisez l’oreillette droite pour permettre un drainage sanguin complet.
3. Immergez les tissus collectés dans du paraformoldéhyde à 4 % (PFA) à 4 °C toute la nuit pour fixation.
4. Lavez les tissus fixes trois fois avec du PBS, puis incubez-les dans du PBS à 4 °C pendant la nuit.
5. Cryoprotégez les tissus en les immergeant dans 30 % de saccharose à 4 °C pendant la nuit.
6. Incorporez les tissus dans un composé OCT, congelez-les, puis coupez à 12 μm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat.
7. Conservez les blocs de tissu à -80 °C et les cryosections à -20 °C jusqu’à utilisation.
8. Pour la seule collecte du nerf sciatique, il faut omettre la perfusion, car la teneur en sang n’affecte pas significativement la qualité de l’immunocoloration dans ces tissus périphériques.

Results

Le précédent protocole de fusion^{PEG 18} a été modifié afin de maintenir des résultats chirurgicaux cohérents et de minimiser les dommages nerveux causés par la suture²⁵. En plaçant la suture pour pénétrer à travers le nerf avant la transection, les dommages causés par le pincement à la pince ou la piqûre à l’aiguille après la transection étaient minimisés. Pour tester l’effet du lien d’une suture pénétrant un nerf sur sa fonction, la suture ...

Discussion

Des études de régénération nerveuse utilisant des modèles de transection nerveuse sont largement réalisées sur le nerf sciatique^{de la souris 31,39}. Cependant, en raison de sa petite taille et de sa texture douce, le nerf sciatique de la souris est difficile à manipuler en douceur avec des instruments chirurgicaux, et le tissu est sujet à la déchirure lors des sutures. Le processus de microsuture, souvent impliquant une manipulati...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pinces #55	Dumostar-Biologie	11295-51	Un dans chaque main. Il vous en faudra deux pour saisir une suture en nylon 10-0.
Suture en nylon 10-0	DemeTECH	NL761000,4F0P
Suture nylon 4-0	Sorcier de la Matrice	0197
Anti-bêta-tubuline	R& Systèmes D	MAB1195
Anti-NF-200	Millipore Sigma	N4142
Austerlitz taille 000			Pour le test de piqûre
CF488 alpha-bungarotoxine conjuguée	Biotium	00005
Ciseaux à disséquer	Kent Scientific & nbsp ;
Ciseaux fins à suture	Kent Scientific & nbsp ;
Pinces iris	Kent Scientific & nbsp ;
K& Coussin chauffant pour petits animaux H	K& Produits pour animaux H
ML162	Millipore Sigma	SML2561
Kit chirurgical pour souris	Kent Scientific & nbsp ;
Porte-aiguille	Kent Scientific & nbsp ;
Polyéthylène glycol (PEG)	Millipore Sigma	P5413
SCG10	Novus Biologicals	NBP1-49461
SomnoSuite	Kent Scientific & nbsp ;		Pour l’anesthésie à l’isoflurane
Pince à séparateur			Utilisé pour exposer le nerf sciatique.