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Article de méthode

La sénescence induite par un médicament dans les cellules hépatiques favorise la polarisation des macrophages M2 : implications pour l’hépatotoxicité associée aux inhibiteurs de la tyrosine kinase

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DOI :

10.3791/68725

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17 octobre 2025

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1Department of Life Sciences, Shiv Nadar Institution of Eminence, 2Independent Researcher, 3Servier Institute of Translational Medicine

Dans cet article

Résumé

Ici, nous étudions l’hépatotoxicité causée par le lapatinib et le nératinib par la polarisation des macrophages induite par SASP, ce qui offre une compréhension mécaniste plus profonde au-delà des tests de toxicité traditionnels. Cette approche démontre comment les hépatocytes sénescents influencent les réponses immunitaires. Ceci est particulièrement précieux pour évaluer les effets à long terme des médicaments et découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques pour gérer l’hépatotoxicité induite par les médicaments.

Résumé

Le lapatinib et le nératinib sont des inhibiteurs de la tyrosine kinase (ITK) approuvés pour le traitement du cancer du sein métastatique HER2-positif, mais leur utilisation clinique est limitée par l’hépatotoxicité. Dans les hépatocytes, les enzymes du cytochrome P450 produisent des métabolites réactifs de ces médicaments, provoquant des dommages à l’ADN, un dysfonctionnement mitochondrial et un stress oxydatif, qui entraînent des lésions hépatocytaires. Ce stress cellulaire déclenche la sénescence des hépatocytes, un état d’arrêt de la croissance accompagné de la sécrétion de facteurs pro-inflammatoires et de remodelage tissulaire appelé phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP). SASP modifie considérablement le microenvironnement hépatique, influence le comportement des cellules immunitaires et aggrave les lésions tissulaires. Nous montrons que le lapatinib et le nératinib induisent la sénescence et la SASP dans la lignée cellulaire hépatique HepG2. De plus, SASP de ces cellules sénescentes favorise la polarisation de type M2 des macrophages RAW264.7. Bien que les macrophages M2 soient associés à des réponses anti-inflammatoires et à la réparation des tissus, leur activité excessive ou prolongée peut entraîner des lésions tissulaires et une fibrose. Nos résultats mettent en évidence un mécanisme par lequel la sénescence hépatocytaire induite par les ITK et le SASP modulent la réponse immunitaire et peuvent contribuer à la toxicité hépatique chez les patientes atteintes d’un cancer du sein. Cela souligne l’importance de cibler les cellules sénescentes ou les facteurs SASP pour réduire la toxicité hépatique et améliorer les résultats du traitement, ce qui fait de l’identification de senotherapeutics efficaces un axe de recherche essentiel. Il n’y a pas eu de rapport de littérature démontrant l’effet du sécrétome des cellules hépatiques induit par les ITK sur la polarisation des macrophages.

Introduction

Le lapatinib et le nératinib, deux inhibiteurs de la tyrosine kinase (ITK) à petites molécules, ont reçu l’approbation de la FDA en 2007 et 2017 pour le traitement du cancer du sein métastatique1. Ces médicaments sont connus pour inhiber le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain, HER22, un récepteur tyrosine kinase surexprimé dans certains cancers du sein3. Malgré leur succès clinique, le lapatinib et le nératinib sont également associés à des effets indésirables, en particulier à l’hépatotoxicité 4,5. Des lésions hépatiques aiguës, se manifestant par des taux élevés d’aminotransférase, surviennent chez environ 14 % des patients traités par le lapatinib ou le nératinib6. L’hépatotoxicité est largement attribuée au métabolisme hépatique de ces médicaments, qui implique les enzymes du cytochrome P450 (CYP), principalement CYP3A4/5 7,8. Ces enzymes catalysent la formation d’intermédiaires quinone-imine, qui sont électrophiles et très réactifs 9,10. Ces métabolites réactifs, y compris le lapatinib O-désalkylé, le lapatinib N-désalkylé et le N-hydroxy lapatinib, le nératinib O-désalkylé et le N-déméthylé nératinib, peuvent former des adduits covalents avec les macromolécules cellulaires, perturbant ainsi les fonctions cellulaires normales et entraînant finalement des lésions hépatiques11.

Les métabolites réactifs du lapatinib et du nératinib peuvent également induire un stress oxydatif, un déclencheur clé de la sénescence cellulaire12. La sénescence cellulaire est un état d’arrêt de la croissance mais métaboliquement actif, caractérisé par la sécrétion de diverses cytokines pro-inflammatoires, de facteurs de croissance et de protéases. Ce phénotype sécrétoire est connu sous le nom de phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP)13,14,15. Le SASP peut affecter profondément le microenvironnement environnant, favorisant souvent l’inflammation et le remodelage des tissus. Dans le cadre de la thérapie anticancéreuse, le SASP peut enrichir la population de cellules souches cancéreuses et modifier la réponse immunitaire pour favoriser la survie tumorale16. De plus, les cytokines inflammatoires peuvent exacerber les lésions tissulaires. Nous avons émis l’hypothèse que chez les patients traités par le lapatinib et le nératinib, les lésions hépatiques sont en partie dues à la sénescence induite par les ITK et à la production de SASP pro-inflammatoires.

Nos expériences ont démontré que le lapatinib et le nératinib induisent la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules hépatiques, entraînant des dommages à l’ADN et un dysfonctionnement mitochondrial, qui à son tour déclenche la sénescence cellulaire. Cette sénescence peut contribuer à l’hépatotoxicité induite par le lapatinib/nératinib en libérant des facteurs SASP, qui peuvent influencer la polarisation des macrophages.

Les macrophages jouent un rôle essentiel dans la réponse immunitaire, et leur phénotype fonctionnel peut changer en réponse à divers stimuli 17,18. Le phénotype classique du macrophage M1 est généralement associé à des réponses pro-inflammatoires, y compris la production de cytokines telles que le TNF-α et l’IL-1β, et est généralement considéré comme un marqueur de l’inflammation aiguë19,20. En revanche, le phénotype du macrophage M2 est associé à la fibrose, à la réparation tissulaire21, à l’immunosuppression et à une réponse à l’inflammation chronique22,23. Les cytokines inflammatoires du SASP peuvent influencer la polarisation des macrophages, favorisant la conversion des macrophages M1 en un phénotype23 de type M2. Ce changement de polarisation peut avoir des implications importantes pour le microenvironnement immunitaire, conduisant potentiellement à l’immunosuppression, à la progression tumorale et au remodelage de l’architecture tissulaire.

Pour étudier la polarisation des macrophages induite par le lapatinib et le nératinib, nous avons utilisé la lignée cellulaire RAW264.7, une lignée cellulaire murine de type macrophage couramment utilisée dans la recherche immunologique24,25. Les cellules RAW264.7 sont dérivées de souris BALB/c et sont largement utilisées pour étudier l’inflammation, la phagocytose et les réponses immunitaires25. Ils répondent à divers stimuli, y compris les lipopolysaccharides (LPS), et sont particulièrement précieux pour l’étude de la fonction des macrophages, de la production de cytokines et de la biologie du cancer26. Dans cette étude, HepG2, une lignée cellulaire d’hépatome humain, a été traitée avec du lapatinib et du nératinib pour imiter les effets hépatotoxiques observés chez les patients. La lignée cellulaire HepG2 est souvent utilisée comme modèle d’étude du métabolisme des médicaments et de l’hépatotoxicité en raison de son origine humaine et de sa lignée de carcinome hépatocellulaire27. Après avoir traité les cellules HepG2 avec les ITK, les milieux conditionnés ont été prélevés et ajoutés aux cellules RAW264.7. Les modifications phénotypiques subséquentes des macrophages ont été surveillées, en se concentrant sur la question de savoir si le traitement induit un passage du phénotype pro-inflammatoire M1 au phénotype immunosuppresseur M2.

L’hépatotoxicité induite par les médicaments est généralement étudiée à l’aide d’essais de cytotoxicité, de l’évaluation de marqueurs inflammatoires et de l’utilisation de modèles animaux. Par rapport à ceux-ci, notre méthode d’examen de l’hépatotoxicité induite par le lapatinib et le nératinib par le biais de facteurs de phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP) et de leur influence sur la polarisation des macrophages présente plusieurs avantages. Tout d’abord, notre méthode établit un lien entre les facteurs SASP produits par les cellules hépatiques sénescentes induites par les médicaments et l’immunité innée, qui peut être liée au remodelage tissulaire, à l’inflammation chronique et à la cancérogenèse 28,29,30,31. Les dépistages de toxicité conventionnels ne peuvent pas nous aider à saisir les interactions à court terme entre le foie et les cellules immunitaires, ni révéler l’impact à long terme des ITK sur l’inflammation et la fibrose hépatiques, en particulier dans le contexte de l’exposition chronique aux médicaments. Lorsqu’elle est associée à une approche protéomique appropriée pour identifier les constituants des SASP, cette technique peut aider à identifier des biomarqueurs prédictifs de l’hépatotoxicité induite par les ITK et éclairer la conception d’interventions thérapeutiques pour l’atténuer 29,30,31.

Pour la mise en œuvre, les chercheurs devraient utiliser des systèmes de co-culture ou de milieux conditionnés avec des lignées cellulaires hépatiques et immunitaires, comme décrit, et évaluer les biomarqueurs de sénescence ainsi que les macrophages M1 et M2. Cette méthode est la plus efficace pour l’évaluation des lésions hépatiques aiguës ou chroniques induites par les médicaments, ou pour explorer des stratégies visant à minimiser les effets hors cible des thérapies anticancéreuses 29,30,31.

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Protocole

1. Culture cellulaire

  1. Cultivez des cellules HepG2 dans un milieu Eagle modifié (MEM) à haute teneur en glucose avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et des cellules RAW264.7 dans le milieu Eagle modifié (DMEM) à haute teneur en glucose avec 10 % de FBS à 37 °C avec 5 % de CO 2 et actualisez-les tous les 3 jours.
    REMARQUE : L’utilisation d’antibiotiques n’est pas recommandée à moins qu’il n’y ait une contamination fongique ou bactérienne. Les cellules RAW264.7 ont une croissance très rapide et doivent être éliminées après 2 jours.

2. Dosage MTT

  1. Comptage et placage de cellules
    1. Cultivez des cellules HepG2 dans une boîte de culture de 60 mm dans un incubateur de culture cellulaire dans un milieu de croissance complet (MEM + 10 % FBS).
    2. Lorsque les cellules étaient confluentes à environ 80 %, retirez le milieu de croissance, rincez rapidement avec 1 ml de 1x PBS et ajoutez 600 μL de 0,5x trypsine. Incuber pendant 5-6 min.
      REMARQUE : Toutes les étapes doivent être effectuées dans une armoire de culture cellulaire BSL 2.
    3. Neutralisez la trypsine en ajoutant 1,2 mL de milieu de croissance complet à l’intérieur du BSL 2.
      REMARQUE : Pour éviter une sur-trypsinisation, un milieu complet, soit deux fois le volume de trypsine ajouté, doit être ajouté.
    4. Prenez la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation (MCT) de 5 mL et granulez-la en la centrifugeant à 180 g (1000 tr/min) pendant 3-4 min à température ambiante (RT).
    5. Jeter le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu, pipeter pour mélanger en suspension unicellulaire et compter à l’aide d’un hémocytomètre au microscope.
    6. Ensuite, placez les cellules HepG2 dans une plaque de 96 puits à raison de 5000 à 7000 cellules par puits, dans un milieu de croissance complet, en trois exemplaires pour chaque dose de médicament, et conservez-les dans l’incubateur pendant 12 à 16 h.
      REMARQUE : La confluence cellulaire doit être de 50 à 60 % pour le traitement médicamenteux, et cette étape doit être effectuée à l’intérieur de la capuche.
  2. Traitement médicamenteux
    1. Préparer des concentrations de travail progressivement croissantes de lapatinib et de nératinib dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) à partir de la concentration de base (30 mM et 3,5 mM, respectivement) à l’intérieur de la hotte. Les concentrations finales sont de 1, 2,5, 5, 10, 15, 25, 50 μM pour le lapatinib et 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10 μM pour le nératinib dans les milieux de croissance (MEM + 5 % FBS). Gardez un témoin sans traitement pour les deux médicaments.
    2. Jetez le milieu précédent de la plaque à 96 puits contenant les cellules, ajoutez 100 μL de milieu avec le médicament et incubez pendant 48 h à l’intérieur de l’incubateur.
  3. Coloration et quantification
    1. Après 48 h, ajouter 10 μL de colorant bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT ; 5 mg/mL), dissoudre dans 1 tampon salin phosphate (PBS) dans chaque puits et incuber pendant au moins 2 h à l’intérieur de l’incubateur jusqu’à ce que des cristaux de couleur violette apparaissent.
      REMARQUE : Ajouter le colorant directement dans le milieu contenant du médicament et ne pas incuber les cellules avec le colorant pendant plus de 4 h.
    2. Après l’incubation, retirer le colorant, dissoudre les cristaux dans 100 μL de DMSO dans chaque puits et incuber pendant 15 min, puis prendre la densité optique (DO) à 595 nm.
      REMARQUE : Cette étape peut être effectuée à l’extérieur de la hotte.

3. Dosage de la galactosidase SA-β

  1. Traitement médicamenteux
    1. Plaque de cellules HepG2 dans des boîtes de 35 mm à une densité de 40 x 104 cellules par plaque en trois séries, une pour le lapatinib, une pour le nératinib et une pour le témoin non traité.
      REMARQUE : Les étapes de comptage et de placage des cellules sont décrites à l’étape 2.1.
    2. Ajouter 1 μL de lapatinib à partir de la substance de travail de 5 mM et 1,43 μL de nératinib de la matière principale de 3,5 mM dans 2 mL de milieu pour obtenir une concentration finale de 2,5 μM (dose sublétale) de lapatinib et de nératinib.
      REMARQUE : La dose sublétale du médicament est sélectionnée à la suite du graphique de survie cellulaire dans le test MTT.
    3. Retirez le milieu précédent de la vaisselle et lavez-le une fois avec 500 μL de 1x PBS, puis ajoutez un milieu contenant du médicament (à l’intérieur de la hotte) et conservez-le pendant 48 h à l’intérieur de l’incubateur.
  2. Fixation et coloration
    1. Après 48 h, retirer le médicament, laver rapidement avec 500 μL de 1x PBS une fois, et fixer avec 1,5 mL de formaldéhyde à 2 % et 0,2 % de glutaraldéhyde dans 1x PBS pendant 10 min à RT.
    2. Après la fixation, lavez deux fois les plaques avec 1 mL de 1x PBS et assurez-vous que la solution fixatrice est correctement retirée. Ajouter 1,5 mL de solution de coloration (40 mM de tampon d’acide citrique/Na-phosphate, 5 mM de K4[Fe(CN)6], 5 mM de K3[Fe(CN)6], 150 mM de NaCl, 2 mM de MgCl 2, 1 mg/mL de X-gal dans de l’eau autoclave) et incuber pendant 8 h à 37 °C sans CO2.
      REMARQUE : La période d’incubation peut varier selon le type de cellule ; pour l’hépatite G2, la période d’incubation ne doit pas excéder 8 h.
    3. Après la coloration, laver rapidement les plaques dans 1 mL de PBS 1x deux fois et capturer des images en fond clair à des grossissements de 20x et 40x avec un microscope à épifluorescence. Capturer un minimum de quatre à cinq champs pour chaque groupe de traitement.
      REMARQUE : Le volume de solution fixatrice et de coloration variera avec la taille de la plaque, et toutes les étapes peuvent être effectuées à l’extérieur de la hotte.
  3. Quantification d’images
    1. Prenez une photo à partir d’un champ, comptez le nombre total de cellules ainsi que les cellules affichant un signal bleu. Calculez manuellement le pourcentage de cellules avec un signal bleu. Calculez au moins quatre images, prenez la moyenne, tracez dans un graphique de feuille de calcul et effectuez un test t.

4. Détection ROS

  1. Placage cellulaire et traitement médicamenteux
    1. Plaques de cellules HepG2 dans des boîtes à fond de verre de 35 mm à une densité de 40 x 104 cellules par plaque en trois séries : une pour le lapatinib, une pour le nératinib et une pour le témoin non traité.
      REMARQUE : Les étapes de comptage et de placage des cellules sont décrites à l’étape 2.1.
    2. Suivez la même stratégie de traitement que celle décrite à l’étape 3.1.
  2. Coloration et imagerie
    1. Après 48 h de traitement, ajouter 2 μM de réactif ROX rouge foncé (5 mM de stock), 1 μM de Mito Tracker Green (1 mM de stock) pendant 30 min et contre-colorer avec un colorant nucléaire de 500 nM Hoechst (500 μM de stock).
      REMARQUE : La teinture doit être ajoutée à l’intérieur de la capuche et l’exposition directe à la lumière doit être évitée. La contre-coloration se fait par l’ajout d’un colorant nucléaire Hoechst lors de l’administration d’autres colorants.
    2. Après 30 min, retirez le colorant et lavez avec 1x PBS pour éliminer l’excès de colorant et imagez avec un microscope confocal à un grossissement de 100x (immersion de l’huile, longueur d’onde d’excitation de 640 nm, 488 nm et 405 nm, respectivement).
  3. Quantification d’images
    1. Quantifiez le signal de la cellule ROX rouge à l’aide du logiciel Fiji ImageJ et comparez-le au signal du témoin non traité. Utilisez MitoTracker vert pour indiquer que le signal provient des mitochondries. Après avoir tracé les graphiques à barres avec des valeurs moyennes, effectuez un test t.

5. Collecte des milieux conditionnés (CM)

  1. Traiter les cellules HepG2 avec 2,5 μM de lapatinib ou de nératinib pendant 48 h (stratégie de traitement similaire à l’étape 3.1, sauf pour cette expérience, plaque 70 x104 cellules dans une boîte de 60 mm).
  2. Après 48 h, retirez le médicament et lavez-le une fois avec 500 μL de 1x PBS.
  3. Le jour maximum de la sénescence (après 48 h de traitement médicamenteux), ajoutez 4 ml de milieu MEM sans sérum (sans FBS ou tout autre supplément) aux cellules traitées par le médicament ainsi qu’au témoin non traité pendant 48 h.
    REMARQUE : Le volume de milieu sans sérum dépendra de la taille de la plaque.
  4. Ensuite, prélevez le milieu sans sérum contenant tout le sécrétome, appelé milieu conditionné, et conservez-le à -80 °C pour une utilisation future.
    REMARQUE : Après avoir collecté le CM, il doit être centrifugé pendant 5 min à 2800 g (4000 tr/min) pour éliminer les cellules mortes et autres débris cellulaires. Les cellules RAW264.7 sont généralement cultivées dans le DMEM, mais le CM est collecté dans le MEM selon les conditions de culture de l’hépatite G2. Pour maintenir la compatibilité, les milieux conditionnés doivent être mélangés avec du DMEM sans sérum dans un rapport de 1:1 avant l’incubation du RAW264.7.

6. Polarisation M1/M2 dans RAW264.7

  1. Placage cellulaire
    1. Suivre le comptage et le placage des cellules comme décrit à l’étape 2.1, à l’exception de l’étape de trypsinisation. Pendant que vous essayez les cellules RAW264.7, ajoutez 600 à 700 μL de trypsine 0,5x, incubez pendant 15 à 20 minutes dans l’incubateur, et pour neutraliser la trypsine, ajoutez 2 ml de milieu de croissance (DMEM + 10 % FBS) et plaquez 70 x104 cellules dans une boîte de 60 mm en trois séries : lapatinib, nératinib et un témoin non traité.
  2. RAW264.7 à induction
    1. Retirer le milieu de culture régulier, laver une fois avec 1 mL de 1x PBS et ajouter le CM correspondant pendant 48 h.
      REMARQUE : Avant d’ajouter le CM, assurez-vous de le conditionner avec du DMEM sans sérum dans un rapport de 1 : 1, car les cellules RAW264.7 se développent dans le DMEM, donc garder les cellules dans MEM causera du stress, ce qui peut entraver le résultat. La culture de RAW264.7 dans un milieu sans sérum pendant 48 h peut également causer du stress ; Dans ce cas, une incubation de 24 à 30 heures peut être effectuée avant de collecter les données.
    2. Après l’incubation, jeter le CM, laver avec 1 mL de 1x PBS, ajouter 600 μL de trypsine dans chaque plaque, incuber pendant 10 min, puis réduire en granulés à 180 g (1000 tr/min) pendant 3 min à RT. Utilisez le granulé pour la purification des protéines ou stockez-le à -80 °C pour une utilisation future.
      REMARQUE : Le temps de trypsinisation varie selon le type de cellule et la centrifugation n’est pas recommandée au-dessus de 180 g.
  3. Isolement des protéines et western blot
    1. Préparez le tampon de lyse en mélangeant le tampon de lyse du test de radioimmunoprécipitation (RIPA) et le cocktail d’inhibiteurs de protéase dans un rapport de 100:1. Ajouter le tampon de lyse à la pastille cellulaire, remettre en suspension et incuber sur de la glace pendant 30 min.
      REMARQUE : Le volume du tampon de lyse variera avec la taille de la palette de cellules, et la lyse peut être effectuée à l’extérieur du capot. Si le granulé est stocké à -80 °C, décongelez-le d’abord sur de la glace, essorez-le brièvement et retirez tout support résiduel.
    2. Après l’incubation, faites tourner le lysat cellulaire à 20 000 g pendant 30 min à 4 °C. Prélever le surnageant et procéder au transfert Western, ou l’entreposer à -20 °C pour une utilisation future.
    3. Préparez l’échantillon de protéines en prélevant 35 à 40 g de protéines, ajoutez 1 colorant de chargement, chauffez pendant 5 à 6 minutes à 95 °C, exécutez SDS-PAGE (gel d’acrylamide à 10 % et 12 %) à 90 V et transférez-le sur une membrane de nitrocellulose.
    4. REMARQUE : Pour de plus amples renseignements sur le transfert Western, voir Joubert et al.32.
    5. Vérifier l’expression des marqueurs de polarisation M1 et M2, en développant le transfert à l’aide d’un révélateur de peroxydase de raifort (HRP), d’iNOS (M1) et d’arginase1 (M2), respectivement, en utilisant des anticorps anti-NOS2 et anti-ARG1.
      REMARQUE : La concentration des anticorps primaires, anti-NOS2 et anti-ARG1, est de 1:1000, et celle des anticorps secondaires anti-lapin est de 1:10 000.
  4. Polarisation des macrophages à l’aide du LPS et de l’IFN-γ
    1. Plaque 70 x 104 cellules RAW264.7 dans deux paraboles de 60 mm.
      REMARQUE : La procédure de placage est similaire à l’étape 6.1.
    2. Après 12 à 16 h, mélanger 4 μL de lipopolysaccharide (LPS, concentration mère est de 1 mg/mL) et 1,33 μL d’interféron-γ (IFN-γ, concentration mère est de 100 μg/mL) dans 4 mL de milieu de croissance (DMEM + 10 % FBS) et ajouter au RAW264.7 pré-plaqué, en gardant un témoin non induit.
    3. Après 48 h, prélever la pastille cellulaire par trypsinisation, isoler la protéine, effectuer un western blot et vérifier l’expression d’iNOS (M1) et d’ARG1 (M2), respectivement, en utilisant des anticorps anti-iNOS et anti-ARG1.
      REMARQUE : Tous les déchets de culture cellulaire et les déchets biochimiques doivent être jetés dans un bac à risque biologique, correctement autoclavés, puis éliminés.

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Résultats

Une série d’essais a été menée pour évaluer l’impact du lapatinib et du nératinib TKI sur les cellules de carcinome hépatocellulaire (HepG2) et leurs effets paracrines en aval sur les macrophages. Les cellules HepG2 ont été traitées avec des concentrations variables de lapatinib ou de nératinib, et la viabilité cellulaire a été mesurée à 48 h à l’aide du test MTT (figures 1A et B). Sur la base des courbes de survie, une d...

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Discussion

La présente étude explore les effets indirects du traitement au lapatinib ou au nératinib sur la polarisation des macrophages à travers des milieux conditionnés prélevés sur des cellules hépatiques HepG2 traitées par ITK. En utilisant les macrophages RAW264.7, nous observons un phénotype M2 lors de l’exposition aux milieux conditionnés, comme l’indique la régulation positive d’ARG1. Morphologiquement, les macrophages traités présentaient une forme élargie et allongée caractéristique, ce ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs remercient l’Institution Shiv Nadar pour le soutien apporté à l’infrastructure. Cette étude est financée par la subvention du ministère des Sciences et de la Technologie CRG/2022/003242.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lignée cellulaire de l’HepG2NCCSLignée cellulaire adhérente
Lignée cellulaire RAW264.7NCCSLignée cellulaire adhérente
DMEM (Eagle Medium modifié de Dulbacco)HimediaAT066Glycémie élevée, poudre
MEM (Eagle Medium ModifiéGibco611100-053Poudre
PBS (Solution tampon phosphate)HimediaTS1101Poudre
Solution Trypsine-EDTAHimediaTCL007Solution
FBS (Sérum fœtal bovin)HimediaRM1112Liquide
Colorant MTTHimediaTC191Poudre
LapatinibSelleckchemS2111Poudre
NeratinibSociété Chimique Caïman18404Poudre
DMSO (Diméthyl Sulfoxyde)  ;HimediaTC185Solution
Formaldéhyde  ;RankemF0080Solution
GlutaraldéhydeSigma-aldrich340855Solution
Acide citrique monohydraté, purHimediaGRM229Poudre
Phosphate de sodium dibase anhydre   ;HimediaMB024Poudre
Ferrocyanure de potassium, K4[Fe(CN)6]Fisher Scientific & nbsp ;P-236-500
Ferricyanure de potassium, K3[Fe(CN)6]Fisher Scientific & nbsp ;P-232-500
NaClSRL41721Poudre
MgCl2 hexahydrateHimediaGRM-1068Poudre
X-GalSRL45904Poudre
LipopolysaccharideSigma-aldrichL6529
Interféron recombinant humain & gamma ;HimediaCF040-20MCG
Réactif rouge profond Cell ROXThermo fisher scientifiqueC10422
HoechstInvitrogen, Thermo Fisher ScientificH3570Poudre
MitoTRACKER VertInvitrogen, Thermo Fisher Scientific1842298Poudre
Anticorps anti-ARG1AffinitéDF6657Solution, MW calculé - 35kDa, MW observé - 65kDa
Anticorps anti-NOS2Cloudo Clone Corp.PAA837Hu01Solution, MW calculé - 130kDa, MW observé - 65kDa
Anticorps anti-iNOSAffinitéSolution, MW calculé - 130kDa, MW observé - 120kDa
Anticorps anti-GAPDHBiobharati LifeScience Pvt.LtdBB-AB0060Solution
Anticorps anti-lapinSociété Chimique Caïman10004301Solution
Membrane nitrocellulose & nbsp ;Merck Millipore Ltd.  ;HATF00010 (Numéro de produit)
femtoLUCENTTMPLUS HRPG Biosciences  ;786-003
Antennes 60mmNUCK150462
Plaque à 96 puits   ;NUCK165306
Incubateur de culture cellulaire   ;Thermo Fisher Scientific371
Microscope  ;1. Microscope inversé LEICA   ;   ; 2. Microscope confocal Nikon & nbsp ;1. LED DMIL & nbsp ;   ;   ;   ; 2. Ti2E, A1R  ; Les deux sont numérotés de modèle
Système d’imagerie iBrightInvitrogen, Thermo Fisher ScientificCL1500 (numéro de modèle)
Lecteur de plaquesBio-RADLecteur de microplaques iMark
Centrifuge  ;Thermo Fisher ScientificSorvall ST 8R (numéro de modèle)

Références

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