Article de méthode

Utilisation de listes de gènes humains exprimés de manière différentielle pour effectuer une analyse d’enrichissement des voies en aval et la hiérarchisation des cibles

DOI :

10.3791/68732

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3 octobre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Molecular Biology, Brigham Young University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les travaux actuels décrivent un protocole d’exécution de l’algorithme Pathway2Targets, un script R qui prédit et hiérarchise les cibles thérapeutiques en fonction du profil des voies de signalisation intracellulaires générées en comparant des échantillons de cas et de contrôle d’une expérience de séquençage d’ARN en vrac.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit un pipeline de calcul en plusieurs étapes pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles à partir des données de séquençage de l’ARN, y compris l’installation d’un logiciel pertinent, la vérification de la configuration et l’analyse de l’expression différentielle à l’aide d’edgeR. Nous montrons ensuite comment utiliser l’algorithme d’analyse d’impact des voies de signalisation (SPIA) pour prédire des voies statistiquement significatives. Pour garantir la confiance dans les résultats, nous nous concentrons sur les trajectoires significatives (p < 0,05) afin de réduire les résultats faussement positifs. Contrairement aux ensembles de gènes traditionnels, ces voies reflètent des réseaux d’interaction protéine-protéine, offrant des informations mécanistes sur les processus cellulaires tels que le cycle cellulaire, la réponse immunitaire et le métabolisme. Ces trajectoires sont ensuite analysées à l’aide de l’algorithme Pathway2Targets, qui s’interface avec la base de données OpenTargets.org via une interface de programmation d’application (API). Cet algorithme intègre une nouvelle approche de pondération qui évalue les cibles médicamenteuses connues dans les voies identifiées, tout en fournissant des progrès en temps réel. Le temps d’exécution dépend de la complexité du chemin et de la densité cible. La sortie se compose de deux fichiers classés. Le premier fichier contient une liste de cibles médicamenteuses prédites et leurs scores pondérés, tandis que le second comprend divers détails pour les thérapies associées. L’ensemble de ce pipeline facilite la hiérarchisation des cibles médicamenteuses et des traitements dans le contexte des profils d’expression génique spécifiques à la maladie.

Introduction

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Le séquençage de l’ARN en vrac permet de comparer les niveaux d’expression de milliers de gènes dans une population de cellules de cas par rapport à une population de cellules témoins. Les expériences sont généralement conçues pour inclure au moins trois échantillons en trois exemplaires, idéalement des répétitions biologiques, bien que des répétitions techniques puissent suffire. Cette conception tient compte de la variabilité biologique et réduit l’impact des échantillons aberrants. L’analyse de ces modèles d’expression fournit un aperçu détaillé de l’effet de la maladie d’intérêt sur les processus cellulaires normaux et peut potentiellement permettre de prédire des traitements pertinents.

Le prétraitement des données de séquençage d’ARN en vrac comprend généralement : le contrôle de la qualité des lectures de séquençage (pour les répétitions, les adaptateurs de séquençage, le pourcentage de GC, etc.), le découpage et la suppression de l’adaptateur, le mappage/quantification de lecture 1,2,3 et l’analyse d’expression différentielle 4,5,6. Heureusement, une variété de processus analytiques ont été automatisés pour réduire le travail manuel associé à ces étapes 7,8,9. Une fois le prétraitement terminé, les analyses en aval couramment effectuées comprennent l’analyse de surreprésentation fonctionnelle avec des ontologies génétiques, l’enrichissement des voies de signalisation et la variation de l’épissage. Ces analyses en aval résument et facilitent l’interprétation des résultats d’expression différentielle à un niveau de granularité plus élevé que les listes de gènes seules.

Divers outils ont été mis au point dans le but de réorienter les traitements existants pour un type ou un sous-type de maladie bien défini. Ceci est réalisé en entraînant l’algorithme sur plusieurs types de données omiques pour la maladie visée. Malheureusement, de tels efforts pour améliorer la spécificité et la sensibilité dans une maladie intentionnelle rendent souvent l’utilisation des outils dans des contextes plus généraux sous-optimale10,11. Un autre ensemble d’outils est plus largement applicable aux cas où les profils d’expression génique sont appariés soit aux signatures existantes de l’expression génique12,13, soit aux effets quantifiés des traitements actuels14,15. Cependant, ces outils d’application plus large atteignent souvent une spécificité et une sensibilité réduites pour un large éventail de maladies et/ou ont été entraînés avec des données obsolètes.

En revanche, l’algorithme Pathway2Targets a déjà été appliqué pour prédire des cibles thérapeutiques potentielles dans le lymphome à cellules B, la parodontite, le cancer du sein à œstrogènes positifs, le cancer du sein triple négatif et le virus chikungunya 16,17,18,19,20,21. Les résultats de ces études démontrent que cet outil est capable de prédire des cibles robustes et biologiquement pertinentes. De manière impressionnante, Pathway2Targets a prédit 392 cibles médicamenteuses potentielles pour le cancer du sein triple négatif, dont 60 ont été testées dans des essais cliniques ; ainsi que 828 médicaments individuels pour le TBNC, dont 37 ont été testés,dont 17. Dans l’étude sur le lymphome, cet algorithme a prédit 915 médicaments, dont 461sont approuvés par la FDA.

L’objectif du travail actuel est de décrire un protocole de calcul qui permettra à un plus grand nombre de chercheurs, qui pourraient bénéficier d’un accès à des instructions plus descriptives sur l’exécution de programmes en ligne de commande, d’utiliser efficacement l’algorithme Pathway2Targets récemment développé (Figure 1). Pathway2Targets prédit les cibles d’une maladie donnée en combinant des données d’expression différentielle, des associations gène-maladie, des informations sur les essais cliniques, des données cibles publiques22, des informations sur les voies et d’autres paramètres. Il est important de noter que cet algorithme intègre un schéma de pondération unique et personnalisable, qui permet aux utilisateurs de déterminer les ~20 paramètres liés à la cible qu’ils préfèrent mettre en avant dans leur analyse, tels que le nombre d’associations de maladies, le nombre de voies de signalisation, le nombre de médicaments uniques, le nombre de traitements dans chaque phase des essais cliniques, etc.23. À titre d’exemple d’utilisation de ce protocole, nous allons réanalyser un ensemble de données existant sur le cancer colorectal24.

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Protocole

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Les données de séquençage de l’ARN en vrac analysées dans cette étude ont été acquises à partir de bases de données accessibles au public (NCBI Gene Expression Omnibus et Sequence Read Archive)25,26. Ainsi, les collecteurs de données initiaux ont veillé à ce que ces échantillons soient collectés de manière éthique et appropriée auprès de sujets humains informés et consentants.

1. Téléchargez et installez le logiciel R

  1. Installez R (version 4.0 ou ultérieure) en cliquant sur un lien approprié dans le https://cran.r-project.org/mirrors.html Comprehensive R Archive Network (CRAN) et utilisez l’option 0-Cloud, puis suivez les instructions appropriées pour le système d’exploitation de l’ordinateur. Ce processus prend généralement 5 à 10 min.
  2. Installez R Studio (version 2024 ou ultérieure) à partir de https://posit.co/download/rstudio-desktop/, puis suivez les instructions sur la page de téléchargement. L’installation de RStudio prend généralement ~10 min.
    REMARQUE : L’installation de RStudio est facultative (mais fortement recommandée), car elle fournit un environnement de développement intégré qui simplifie l’exécution du code, offre une coloration syntaxique, facilite la gestion des packages et aide les utilisateurs à visualiser les sorties, ce qui est particulièrement bénéfique pour les utilisateurs moins familiers avec R.

2. Téléchargez et installez des scripts R pour les outils pertinents

  1. Téléchargez les scripts R nécessaires suivants à partir du référentiel GitHub https://github.com/bpickett/Pathway2Targets. Cette URL est fournie à titre indicatif uniquement.
  2. Téléchargez les scripts à l’aide des liens ci-dessous : SPIA version 1.0 (télécharger en cliquant sur Télécharger le fichier brut) : https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/SPIA_Code.Rmd (ID de commit : 60fcd46) ; Pathway2Targetsversion 3.1 (télécharger en cliquant sur Télécharger le fichier brut) : https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/Pathway2Targets.R (ID de commit : 8e4c7c8)

3. Téléchargez les bibliothèques R pour obtenir des outils pertinents

  1. Lors de l’exécution de R (soit dans RStudio, soit dans une fenêtre de terminal), entrez les commandes suivantes pour télécharger et installer les bibliothèques R supplémentaires requises pour exécuter le logiciel.
    1. Démarrez le programme RStudio. Par défaut, le panneau de console est situé dans le coin inférieur gauche de RStudio. Cliquez n’importe où dans la fenêtre du panneau de console et un curseur de frappe doit apparaître en bas après le symbole de la flèche « > ».
    2. Copiez et collez la commande suivante dans la zone de la console et appuyez sur la touche Entrée :
      install.packages(c("RCurl", "stringr", "jsonlite", "httr")). 
      Une fois l’installation réussie, un message d’état apparaîtra indiquant « Les paquets binaires téléchargés sont dans .... ».
    3. Copiez et collez la commande suivante dans la zone du panneau de console et appuyez sur la touche Entrée .
      BiocManager::install(c("SummarizedExperiment", "EnrichmentBrowser", "biomaRt", "org.Hs.eg.db")).
      Une fois l’installation réussie, un message similaire apparaîtra indiquant « Les paquets binaires téléchargés sont dans .... ».
      REMARQUE : Le premier ensemble de bibliothèques (étape 3.1.1) est constitué de banques R typiques, tandis que le second (2.1.2) est constitué de bibliothèques BioConductor. En tant que tels, les commandes doivent être saisies séparément. Les versions appropriées de ces bibliothèques doivent être téléchargées automatiquement en fonction de la version R installée sur l’ordinateur. Chacune de ces commandes devrait prendre ~5 min.

4. Traitement des fichiers

  1. Téléchargez le fichier de sortie d’expression différentielle précédemment généré par edgeR (au format RDS), généré par le logiciel ARMOR (ou similaire), sur l’ordinateur local. Le nom de ce fichier est généralement edgeR_dge.rds.
  2. Examinez manuellement les résultats d’edgeR (ou d’une expression différentielle similaire) pour commencer une interprétation biologiquement pertinente des résultats. Pour ce faire, filtrez au moins par une valeur p corrigée < 0,05 et potentiellement par la valeur absolue de la valeur de changement de multiplication par2 logarithme > 1,5. Si vous testez le logiciel, un exemple de fichier edgeR_dge.rds peut être trouvé sur Zenodo ici : https://doi.org/10.5281/zenodo.15186609
    REMARQUE : L’examen des gènes qui restent dans ces résultats filtrés peut commencer à expliquer le(s) mécanisme(s) moléculaire(s) sous-jacent(s) du phénotype associé aux échantillons de cas (par rapport aux échantillons de contrôle). Il est important de reconnaître qu’il est extrêmement difficile d’interpréter des listes de gènes de manière impartiale en raison du nombre relativement faible de symboles génétiques qui peuvent être rapidement rappelés. En tant que telle, l’analyse des voies de signalisation est un moyen utile de résumer les gènes filtrés en fonction de la façon dont ils interagissent et/ou communiquent entre eux dans la cellule.
  3. Le prétraitement des données de séquençage d’ARN en vrac peut prendre de quelques heures à plusieurs jours de temps de calcul, en fonction de la taille de l’ensemble de données analysé. Enregistrez ce fichier .rds dans le dossier Téléchargements de l’ordinateur. Notez que ce type de fichier .rds n’est pas lisible par l’homme.

5. Exécuter l’algorithme d’enrichissement du chemin SPIA

  1. Si vous l’exécutez à l’aide de R, utilisez le script R à partir de GitHub ou du fichier de codage supplémentaire 1. Tapez la commande suivante, en supposant que le fichier edgeR_dge.rds se trouve dans le dossier Téléchargements
    Rscript --vanilla SPIA_Code.Rmd ~/Downloads/edgeR_dge.rds
    1. Si le fichier edgeR_dge.rds se trouve dans un autre dossier (ou répertoire), remplacez cette commande par ce qui suit
      Rscript --vanilla SPIA_Code.Rmd
  2. Si vous l’exécutez à l’aide de RStudio, utilisez le script R de GitHub ou le fichier de codage supplémentaire 2.
    REMARQUE : Dans le langage R, l’ajout du symbole hashtag # avant une ligne de code le désactive temporairement. Les scripts ont été conçus à l’origine pour s’exécuter dans un environnement en ligne de commande au lieu de RStudio. L’activation ou la désactivation de certaines lignes de code est le moyen le plus simple de reconfigurer la configuration des fichiers d’entrée.
    1. Ouvrez le script SPIA_Code.Rmd dans R Studio en cliquant sur l’option Ouvrir un fichier dans le menu Fichier, puis en sélectionnant le nom du script. Dans la fenêtre de code R Studio, par défaut, il se trouve dans le panneau supérieur gauche.
    2. Sélectionnez toutes les lignes de code du fichier et cliquez sur le bouton Exécuter (ou Exécuter les lignes sélectionnées), qui se trouve au-dessus et à droite de la fenêtre de code. Une exécution réussie produira un fichier nommé similaire à
      edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23_
      10-56-45.12767_SPIA_Results.csv
      dans le répertoire de téléchargement. Ce fichier contiendra les voies de signalisation statistiquement significatives
    3. Examinez manuellement le fichier contenant les résultats statistiquement significatifs en l’ouvrant sous forme de feuille de calcul. Le contenu de ce fichier devrait aider à résumer les cascades de signalisation intracellulaire sous-jacentes qui sont significativement représentées par les gènes exprimés de manière différentielle.
      REMARQUE : Le calcul des chemins significatifs peut prendre de ~30 minutes à plusieurs heures, selon la force du signal dans l’ensemble de données analysé. Lorsque le programme est en cours d’exécution, les messages de progression en temps réel sont mis à jour en permanence dans la fenêtre de la console. Les messages fréquemment mis à jour indiquent que le programme fonctionne correctement. Des descriptions plus détaillées de ce qui se passe dans cette étape sont disponibles dans le dépôt GitHub : https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/tree/main
    4. Si vous utilisez l’exemple de fichier d’entrée, le fichier de sortie de cette étape se trouve dans le dossier Téléchargements et est nommé
      edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_"timestamp"_SPIA_Results.csv.
      Ce style de nommage reflète le nom du fichier d’entrée, le processus en cours d’exécution et la sortie. Cela permet d’éviter toute confusion lors de l’identification des dossiers si plus d’un est traité.
    5. Ajustez les autres paramètres comme décrit ci-dessous.
      1. Les paramètres par défaut de l’algorithme SPIA de cette bibliothèque sont de 1 000 permutations. Augmentez cette fréquence à 2 000 permutations pour améliorer la confiance dans les résultats. Ajustez le nombre de permutations aux lignes 84 et 85 de ce script en remplaçant la perm = 2000 par le nombre de permutations souhaité. Ajustez les autres paramètres comme décrit ci-dessous.
      2. Ajustez l’approche de correction de la valeur p aux lignes 84 et 85 en supprimant padj.method = 'BH'. Cela ne corrigera pas les valeurs p, ce qui peut rendre les résultats faussement positifs plus probables.

6. Exécution de l’algorithme de hiérarchisation des cibles Pathway2Targets sur la sortie SPIA

  1. Si vous exécutez R, utilisez le script R de GitHub ou le fichier de codage supplémentaire 3. Utilisez la commande suivante pour appeler cet algorithme
    Rscript --vanilla Pathway2Targets.R
  2. Si vous l’exécutez à l’aide de R Studio, utilisez le script R de GitHub ou le fichier de codage supplémentaire 4. Ouvrez le script Pathway2Targets.R dans R Studio en cliquant sur l’option Ouvrir un fichier dans le menu Fichier, puis en sélectionnant le nom du script.
    1. Dans la fenêtre de code RStudio (panneau en haut à gauche), remplacez le nom de fichier de la ligne 22 par le nom du fichier de résultats SPIA, par exemple (à partir des données d’exemple)
      infile <- "edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23_
      10-56-45.12767_SPIA_Results.csv"
    2. Sélectionnez toutes les lignes de code dans le fichier et cliquez sur le bouton Exécuter , qui se trouve au-dessus et vers le côté droit de la fenêtre de code. Les messages d’état de progression en temps réel seront affichés en continu dans le panneau inférieur droit. Une exécution réussie produira un fichier appelé (similar to)
      "edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23_
      10-56-45.12767_SPIA_Results.csv-RankedTargets.tsv"       dans le répertoire de téléchargement. Le style de nommage des fichiers reflète l’entrée, le processus et la sortie
      edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23
      _10-56-45.12767_SPIA_Results.csv
      est l’entrée d’un tel fichier.
      REMARQUE : Cette étape peut prendre de une à plusieurs heures, en fonction du nombre de voies de signalisation avec une valeur p significative, du nombre de produits géniques dans ces voies significatives et du nombre de produits géniques qui sont des cibles médicamenteuses connues.
  3. Certains paramètres de l’algorithme Pathway2Targets peuvent être ajustés. Plus précisément, ajustez les valeurs du multiplicateur (lignes 31 à 38 du script) pour personnaliser le schéma de pondération de chaque mesure. Des descriptions plus détaillées de ce qui se passe dans cette étape peuvent être trouvées dans le dépôt GitHub correspondant : https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/tree/main
    REMARQUE : À titre de référence, dans l’exemple, l’identification de médicaments potentiels à partir de 132 voies, composées de centaines de cibles individuelles, prend environ 2 heures. Sur la base de cette mesure, il est raisonnable d’estimer le temps de calcul total.

7. Ouvrir des fichiers de résultats pour des cibles et des traitements prioritaires

  1. Le fichier avec les cibles prioritaires et leurs métriques sera généré. Pour les exemples de fichiers d’entrée, utilisez le fichier de sortie qui se trouve dans le dossier Téléchargements, nommé :
    edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_"timestamp"_SPIA_Results.csv-RankedTargets.tsv
    1. Par défaut, ce fichier sera trié avec les cibles triées par ordre décroissant en fonction de la métrique pondérée personnalisée. Examinez manuellement le fichier de sortie pour vous assurer que les résultats sont pertinents sur le plan biologique et que les cibles sont logiques pour le phénotype évalué.
  2. Le fichier contenant les thérapies prioritaires et leurs métriques sera également généré. Pour les exemples de fichiers d’entrée, utilisez le fichier de sortie dans le dossier Téléchargements, nommé :
    edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_"timestamp"_SPIA_Results.csv-Treatments.tsv
    1. De même, ce fichier de sortie sera également, par défaut, trié avec les traitements pour les différentes cibles (à l’étape 7.1.1) triés par ordre décroissant en fonction de la métrique pondérée. Examinez le fichier manuellement avec une connaissance de base suffisante du système biologique sous-jacent pour déterminer si des expériences supplémentaires sont justifiées. On s’attend à ce que plusieurs produits thérapeutiques aient la même mesure pondérée, car de nombreuses cibles seront touchées par plus d’un traitement sur le marché.

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Résultats

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La configuration décrite aux étapes 1 à 3 du protocole est nécessaire pour permettre l’exécution ultérieure de SPIA et de l’algorithme Pathway2Targets. À la fin de chaque étape, un message sera généré pour confirmer la réussite de l’installation du logiciel. L’étape 4 consiste soit à télécharger un ensemble existant de résultats d’expression différentielle, qui peut inclure le fichier d’exemple fourni, un autre fichier existant, soit à prétraiter un ensemble de données de séquençage d’AR...

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Discussion

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Les étapes 1 à 3 du protocole concernent spécifiquement l’installation du logiciel R sous-jacent, des scripts et des dépendances pour exécuter correctement le logiciel en aval. Une liste détaillée des bibliothèques R requises est disponible (tableau supplémentaire 4). L’étape 4 du protocole consiste à récupérer un fichier de données R (format .rds), qui contient le résultat d’une analyse d’expression différentielle. Les logiciels courants pour cette étape impliquent edge...

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Déclarations de divulgation

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BEP détient une participation dans Pythia Biosciences. Aucun financement externe n’a été obtenu pour les travaux actuels.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Bureau de l’informatique de recherche de l’Université Brigham Young pour son expertise et son soutien lors de l’accès à l’environnement informatique haute performance du campus.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Scripts R de Pathway2TargetsUniversité Brigham Young (Laboratoire Pickett)Version 3.1https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/Pathway2Targets.R
R SoftwareRéseau complet d’archives R (CRAN)Version : 4.4.3https://cran.r-project.org
Logiciel de bureau R StudioPostulerVersion : 2024.12.1+563https://posit.co/download/rstudio-desktop/
Script SPIA RUniversité Brigham Young (Laboratoire Pickett)Version : 3.1https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/SPIA_Code.Rmd

Références

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Mots-clés

Differential Gene ExpressionRNA SequencingSPIA AlgorithmPathway2TargetsDrug Target PredictionProtein Interaction NetworksTherapeutic Target IdentificationDisease Gene Profiles

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