Surveillance de l’absorption et de la localisation des composés organiques dans les tissus végétaux à l’aide d’un test de radiomarquage hydroponique 14C et d’une imagerie au phosphore

Résumé

Cet article décrit une méthode d’étude de l’assainissement à médiation végétale à l’aide de contaminants organiques marqués ¹⁴C. Il décrit la préparation hydroponique des plantes, l’absorption des radiomarqueurs et l’imagerie au phosphore pour suivre l’absorption, la translocation et le métabolisme des contaminants. Cette technique offre un outil précieux pour évaluer le potentiel de phytoremédiation de diverses espèces végétales et polluants environnementaux.

Résumé

La phytoremédiation, c’est-à-dire l’utilisation de plantes pour atténuer les contaminants environnementaux, offre une approche durable et rentable pour nettoyer les sites contaminés. La mise au point de méthodes qui aident à élucider les mécanismes à l’origine de l’absorption et du métabolisme des polluants par les plantes est cruciale pour améliorer les pratiques de phytoremédiation. Cet article décrit une méthode permettant d’évaluer l’absorption et la transformation des contaminants organiques par les plantes à l’aide de composés radiomarqués. ¹⁴Les composés organiques marqués C, tels que les acides C-naphténiques modèle ¹⁴, sont utilisés pour suivre leur absorption, leur translocation, leur localisation et leur métabolisme dans les tissus végétaux. Nous avons déjà utilisé cette méthode avec plusieurs espèces de plantes, dont Elymus trachycaulus et Salix interior. Ces observations sont corroborées ici par la plante modèle, Arabidopsis thaliana, cultivée en hydroponie dans des solutions de Hoagland modifiées. L’absorption des radiomarqueurs a été surveillée par comptage par scintillation liquide et imagerie phosphorescente, ce qui permet de visualiser et de quantifier les composés radiomarqués dans les tissus végétaux. Cette méthode détaille la préparation des matières végétales, l’utilisation de composés radiomarqués et le processus d’analyse de la distribution et du devenir des contaminants dans les plantes. La méthode comprend également des stratégies d’évaluation de l’exsudation des composés et permet d’évaluer à la fois l’absorption par les plantes et la translocation des contaminants environnementaux. Cette approche donne un aperçu des processus d’assainissement à médiation végétale et peut être appliquée à l’étude d’un large éventail de contaminants environnementaux et d’espèces végétales.

Introduction

La biorestauration est une technologie d’assainissement médiée par des entités biologiques, telles que les plantes et les micro-organismes. La phytoremédiation, qui utilise des plantes ou des produits végétaux pour éliminer les contaminants de l’environnement, peut compléter ou servir de solution de rechange à l’assainissement microbien, en surmontant certaines des limites de l’utilisation des microorganismes seuls 1,2,3,4. La phytoremédiation est rentable en raison des processus solaires des plantes, où les contaminants sont absorbés par leurs racines ou leurs pousses et transportés entre les cellules et les tissus où ils peuvent être métabolisés, séquestrés ou volatilisés⁵. Les plantes les plus efficaces pour la phytoremédiation sont généralement des espèces résilientes et tolérantes au stress avec des taux de transpiration élevés, une production de biomasse rapide et des systèmes racinaires profonds, tels que ceux trouvés dans les genres Populus et Salix ⁶. En tant qu’organismes sessiles, les plantes ont développé diverses voies métaboliques pour gérer les composés toxiques dans leur environnement¹. Cela leur confère un large éventail de gènes et de processus biochimiques qui améliorent leur capacité à gérer les contaminants.

Le cadre de phytodégradation, proposé pour la première fois par Sandermann et al. (1977)⁷, décrit un processus en trois phases pour la détoxification des contaminants par les plantes : la transformation, la conjugaison et la compartimentation. Dans chaque phase, les contaminants subissent des modifications enzymatiques qui augmentent leur hydrophilie, réduisent leur toxicité et les rendent plus susceptibles d’être séquestrés ou de se minéraliser davantage⁴. Cependant, comme les plantes dépendent principalement du dioxyde de carbone atmosphérique pour la fixation du carbone, leur capacité à minéraliser complètement les contaminants organiques est potentiellement limitée. Les contaminants peuvent plutôt être séquestrés dans des vacuoles ou des parois cellulaires (phytoséquestration) ou volatilisés dans l’atmosphère (phytovolatilisation)¹.

L’un des principaux défis de la recherche en phytoremédiation est de déterminer si les plantes peuvent absorber et transformer les contaminants organiques de leur environnement¹. Les méthodes de détection traditionnelles ne permettent souvent pas de retracer avec précision les voies d’absorption et de translocation des contaminants, ce qui rend difficile l’évaluation de la capacité d’une usine à remédier à des polluants spécifiques ^1,5. Les composés organiques radiomarqués au carbone 14 (¹⁴°C) offrent une solution puissante à ce problème. En exposant les plantes à ¹⁴contaminants marqués au carbone, les chercheurs peuvent suivre l’incorporation du carbone radiomarqué dans les tissus végétaux, fournissant ainsi un aperçu précis de l’absorption, de la translocation et de la transformation du contaminant. Cette technique permet d’identifier des espèces végétales capables de remédier à des polluants organiques spécifiques et offre un moyen fiable d’évaluer les voies physiologiques impliquées. En fin de compte, l’utilisation de ¹⁴composés marqués C fait progresser notre compréhension du potentiel de phytoremédiation, soutenant l’élaboration de stratégies plus efficaces et ciblées pour l’assainissement de l’environnement.

Cet article décrit une méthode utilisant ¹⁴contaminants organiques radiomarqués au carbone pour surveiller l’absorption, la translocation et le devenir de ces contaminants à partir d’une solution hydroponique par les plantes. Une publication récente a décrit une méthode similaire pour suivre le devenir des herbicides ^{marqués au carbone 14}lors de l’application foliaire⁸. Cependant, la méthode décrite ici décrit comment évaluer l’élimination et la translocation des contaminants radiomarqués à partir d’une solution hydroponique, avec des commentaires sur la façon d’adapter cette méthode à l’utilisation du sol.

Protocole

REMARQUE : Avant d’aller de l’avant avec le présent protocole, il est important de consulter les lignes directrices et les règlements établis et nationaux pertinents en matière de sécurité des radio-isotopes. En bref, manipulez toutes les matières radioactives, ou tout ce qui pourrait avoir été en contact avec des radio-isotopes, en portant des gants doubles, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité. La procédure a été réalisée dans un espace dédié du laboratoire avec du ruban adhésif pour marquer les sections contenant des radio-isotopes. De plus, après toutes les procédures, nettoyez immédiatement la verrerie et les instruments, puis écouvillonnez-les et testez-les pour détecter la présence de radio-isotopes contaminants en comptant les scintillations. Tous les matériaux et liquides utilisés dans ces essais ont également été éliminés dans des conteneurs de déchets radioactifs réservés et éliminés correctement conformément aux lignes directrices de l’Université de Calgary et de la Commission canadienne de sûreté nucléaire.

1. Préparation de la solution de Hoagland

1. Préparez une solution de Hoagland 0,5x (demi-concentration) à partir d’un mélange commercial ou fabriquez le milieu à partir de zéro, composé de 0,5 mM NH₄H₂PO₄, 3 mM KNO₃, 2 mM Ca(NO₃)₂, 1 mM MgSO₄, 23 μM H₃BO₃, 5 μM MnCl₂•4H₂O, 400 nM ZnSO₄•7H₂O, 200 nM CuSO₄•5H₂O, 70 nM H₂MnO₄•1H₂O, 45 μM FeSO₄•7H₂O.
2. Ajouter du MES ou un autre tampon approprié pour obtenir une concentration finale de 10 mM.
3. Ajustez le pH à la valeur souhaitée (ici, le pH était de 5,0).

2. Préparation de la solution de radiomarquage

1. Transvaser le volume requis de solution Hoagland 0,5x (50 mL par répétition) dans une fiole propre.
2. Ajouter 0,1 à 0,26 kBq/mL du composé radiomarqué à la solution Hoagland.
   REMARQUE : Dans cette étude, on a utilisé ^{du 14}C-AdCA (acide adamantane-1-carboxylique) dissous dans du méthanol.
3. Bien mélanger en remuant la fiole pendant 2-3 min.
4. Aliquote 50 mL de la solution de radiomarquage dans des fioles Erlenmeyer de 125 mL pour chaque répétition.

3. Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) Préparation des plantes

REMARQUE : Le protocole de culture hydroponique d’Arabidopsis thaliana est détaillé dans Conn et al. (2013)⁹.

1. Pour chaque plante, retirez un capuchon d’un tube de microfuge standard de 1,7 ml à l’aide de ciseaux et percez un trou de 3 mm de diamètre au centre du capuchon à l’aide d’une perforatrice en cuir.
2. Scellez temporairement le haut des bouchons avec du ruban adhésif et remplissez-les de substrat Hoagland fondu 0,5x contenant 0,8 % d’agar-agar, puis placez-les dans le couvercle d’une boîte de pointes modifiée (le réservoir de germination) (Figure 1A).
3. Stérilisez en surface les graines d’Arabidopsis par lavages consécutifs à l’éthanol à 70 % pendant 10 min, puis 5 min, et séchez-les dans la hotte à flux sur du papier filtre stérile.
4. Semez les graines dans le milieu gélosé à travers le trou percé dans le haut du capuchon de la microcentrifugeuse.
5. Stétafiez les graines dans la grille de pointe à 4 °C pendant 2 à 4 jours.
6. Déplacer la cuve de germination dans une chambre de croissance dans des conditions de jours longs (16 h de lumière, 8 h d’obscurité à ~150 μmol/m²s de lumière et 22 °C).
7. Remplissez les paniers de pointes avec une solution Hoagland 0,5x.
   REMARQUE : Assurez-vous que la solution touche la gélose pour éviter le dessèchement.
8. Faites pousser les plantes pendant 2-3 semaines, en complétant la solution au besoin (tous les 3-4 jours) afin que la gélose reste en contact avec la solution hydroponique.
9. Transplantez les chapeaux et les semis dans une ouverture de 10 mm de diamètre percée au centre d’un couvercle en tube Falcon de 50 ml à l’aide d’une perceuse et d’un foret (figure 1B).
10. Percez 12 trous dans le couvercle du bac en plastique de 10 L à l’aide d’une mèche de scie à percer de 30 mm de diamètre (le réservoir de maturation).
11. Placez les couvercles des tubes Falcon sur les ouvertures du haut du fourre-tout afin que les racines passent dans le bac en dessous.
12. Fixez des pierres à air au fond de la cuve de maturation et remplissez-la de solution Hoagland jusqu’à ce que les racines soient presque submergées.
13. Remettez les plantes dans la chambre de croissance et faites-les pousser pendant encore 6 à 8 semaines (16 h de lumière, 8 h d’obscurité à ~150 μmol/m²s de lumière et 22 °C), jusqu’à ce que les rosettes aient un diamètre d’environ 10 cm.

Figure 1 : Cuves hydroponiques de germination et de maturation d’Arabidopsis et cuve de traitement ¹⁴C-AdCA. (A) Le réservoir de germination utilisé pour faire germer les graines d’Arabidopsis pour la croissance hydroponique. (B) Plantes d’Arabidopsis dans la cuve de maturation prêtes à l’expérimentation. (C) Une plante d’Arabidopsis dont les racines sont immergées dans la solution ^{de 14}C-AdCA pendant l’expérimentation. Les flacons de 50 mL (la cuve de traitement à ¹⁴°C) sont normalement recouverts d’une feuille d’aluminium (non illustrée) pendant l’exposition afin de prévenir la croissance des algues. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Jonc de la Baltique (Juncus balticus Willd. ) préparation de la plante

1. Stratifiez les graines entre deux morceaux de papier filtre humides dans une boîte de Pétri à 4 °C pendant 1 à 2 semaines.
2. Retirez le papier filtre supérieur et placez la parabole dans une chambre de culture dans des conditions de jours longs (16 h de lumière, 8 h d’obscurité à ~150 μmol/m²s de lumière et 22 °C) pendant 1 semaine.
3. Transplantez les plantules dans des claies d’extrémité modifiées comme décrit pour Arabidopsis (étapes 3.1-3.4).
4. Cultivez les plantes pendant 2 à 3 semaines (16 h de lumière, 8 h d’obscurité à ~150 μmol/m²s de lumière et 22 °C), ou jusqu’à ce que les racines atteignent 3 à 4 cm de longueur.
5. Transplantez les plantes dans un bac modifié de 10 L avec des pierres à air, remplissez-les de solution Hoagland jusqu’à ce que les racines soient presque submergées et poussez-les pendant 6 à 8 semaines supplémentaires (16 h de lumière, 8 h d’obscurité à ~150 μmol/m²s de lumière et 22 °C).

5. Préparation des plantules de saule bancal (Salix interior Rowlee)

REMARQUE : Le protocole de croissance des plantules de saule Sandbar est décrit dans Alberts et al. (2021)¹⁰.

1. Coupez des boutures de tige de 10 cm (5 mm de diamètre) et plongez-les une nuit à température ambiante dans du diH₂O pour hydrater et stimuler l’enracinement.
2. Transférez les boutures hydratées dans des réservoirs hydroponiques aérés avec 10 L de solution Hoagland 0,5x et cultivez-les pendant 1 mois (16 h de lumière, 8 h de noir à ~150 μmol/m²s de lumière et 22 °C) pour établir la croissance des racines et des pousses.
   REMARQUE : Rafraîchissez la solution Hoagland toutes les 2 semaines pour éviter une carence en nutriments pendant le développement des plantules.

6. Marquage des radio-isotopes

1. Après avoir préparé la solution de radiomarquage, prélever une aliquote de 100 μL de la solution pour comptage par scintillation liquide afin de déterminer la concentration isotopique initiale.
2. Séchez doucement les racines de la plante et transférez le capuchon du tube Falcon dans des fioles Erlenmeyer de 125 mL (le récipient de traitement à ¹⁴°C) contenant une solution de Hoagland 0,5 fois supérieure avec les composés organiques marqués au ^14eC de l’étape 2.4.
3. Marquez le niveau de solution sur le ballon pour vous assurer qu’il peut être rempli jusqu’au volume de départ pendant l’expérience, en tenant compte de l’évapotranspiration.
4. Enveloppez les flacons dans du papier d’aluminium et secouez-les à 40-60 tr/min sous des lampes de culture pendant toute la durée du test ou jusqu’à ce que les plantes étiquetées soient transférées dans une solution Hoagland 0,5x sans radiomarqueur pour une période de chasse.
5. Complétez le volume dans le ballon toutes les 1 à 2 h jusqu’à la ligne réalisée à l’étape 6.3 avec la solution de Hoagland sans le radiomarqueur avant de prélever 100 μL d’aliquotes. Assurez-vous de mesurer le volume de Hoagland ajouté à chaque flacon pour comparer le taux d’évapotranspiration de chaque solution. Après les 6 à 8 premières heures, les temps d’échantillonnage peuvent augmenter à toutes les 12 à 24 heures.
   REMARQUE : Cette étape peut durer des jours si nécessaire, mais assurez-vous de surveiller quotidiennement la radioactivité des aliquotes au fur et à mesure que l’expérience progresse.
6. Facultatif : Pour surveiller l’exsudation pendant la période de chasse, transférer la plante et le capuchon du tube Falcon dans un flacon contenant 50 mL de solution fraîche de Hoagland (ne contenant aucun composé marqué au ¹⁴C) et prélever une aliquote de 100 μL toutes les 2 h pendant les 6 à 8 premières h, puis à intervalles de 24 h à partir du début de l’expérience.
   REMARQUE : Pour distinguer l’exsudation passive diffuse et active du composé par les racines des plantes, un inhibiteur de transport actif tel que la cyclosporine A peut être ajouté à une concentration de 20 μM.
7. Mesurer les comptages radioactifs de chaque aliquote recueillie entre les étapes 6.1 à 6.6 à l’aide d’un compteur à scintillation liquide.

7. Imagerie au phosphore des plantes

1. Rincez les racines pendant 15 minutes dans une solution de Hoagland 0,5x sans le radiomarqueur pour éliminer le radio-isotope faiblement lié.
2. Prélever 100 μL de la solution de rinçage pour le comptage des scintillations liquides.
3. Pesez les plantes ou la matière végétale non ligneuse pour déterminer la masse fraîche.
4. Séchez la matière végétale à l’aide d’un séchoir à gel sur un morceau de papier filtre étiqueté à 50 °C sous vide pendant 2 h, puis laissez sécher toute la nuit à température ambiante.
   REMARQUE : Une fois séchées, les plantes peuvent être stockées pendant de longues périodes (4 à 6 mois) et l’imagerie peut avoir lieu à une date ultérieure avec une baisse minimale du signal radioactif.
5. Nettoyez l’écran au phosphore en l’exposant à une lumière vive sur une gomme au phosphore pendant 15 min.
6. Versez 2 à 10 μL de solution de radiomarqueur dont la radioactivité est connue sur un morceau de papier filtre et laissez-le sécher à température ambiante pendant la nuit.
   REMARQUE : Ici, les étalons avec les radioactivités : 67, 33, 17, 8, 4 et 2 Bq sont utilisés, mais cela peut être modifié pour tenir compte de l’intensité des signaux provenant des échantillons de l’usine.
7. Placez l’écran au phosphore sur les échantillons de plantes séchées et les étalons radioactifs dans l’obscurité ou dans un récipient opaque fermé et exposez-les pendant au moins 24 h.
   REMARQUE : Si l’image est sous-exposée ou surexposée, ajustez le temps d’exposition en conséquence.
8. Imagez les écrans avec un système d’imagerie au phosphore à balayage laser à une résolution de 50 μm.
9. Analysez l’intensité et la distribution du signal d’image au phosphore à l’aide du logiciel ImageJ¹¹.
   1. Étapes ImageJ : Ouvrez l’image en sélectionnant Fichier > Analyser > Définir les mesures... Sélectionnez Zone et Valeur de gris moyenne > OK. Choisissez l’outil de sélection de forme qui s’adapte le mieux au tissu. Cliquez et faites glisser sur l’image pour mettre en surbrillance la zone d’intérêt. Appuyez sur Ctrl + M. Copiez la zone et la valeur de gris moyenne dans une feuille de calcul.
10. Convertissez les valeurs moyennes de gris en Bq à l’aide des étalons radioactifs d’une courbe standard.
11. Calculez l’activité totale dans les tissus végétaux (densités intégrées) à l’aide de l’équation suivante :
    Densité intégrée (Bq) = (Bq moyen du tissu (Bq/cm²) - Fond (Bq/cm²)) * Aire (cm²)
    1. Facultatif : Convertissez l’image en niveaux de gris en une échelle d’intensité de couleur à l’aide du logiciel ImageJ¹¹.

Résultats

La procédure d’absorption du marquage ^{C 14}s’applique à une variété d’espèces végétales au-delà d’Arabidopsis, y compris Salix interior, Elymus trachycaulus (Link) Gould ex Shinners, et des espèces de zones humides telles que Juncus balticus^10,12. Cependant, à des fins représentatives, nous présentons les résultats de l’écotype Columbia-7 (Col-7) d’Arabidopsis. Précédemment, nous avons démontré...

Discussion

Au cours des dernières décennies, la phytoremédiation a attiré l’attention en tant que méthode passive, économique et respectueuse de l’environnement pour nettoyer les déchets industriels et les sites contaminés¹. L’identification des espèces végétales dont l’absorption des contaminants est accrue et la compréhension des processus moléculaires régissant l’absorption des molécules organiques pourraient améliorer les stratégies de phytoremédiation. Contrairement à d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Mélange de sel de base modifié Hoagland	Laboratoires de Phyto Technologie	N° H353	Contient du sulfate ferreux
Agar-agar	Boutique Bio	AGR001
MES (acide 2-(N-morpholino) éthane sulfonique)	Boutique Bio	MES555
Ph-mètre	Mettler Toledo	CinqFacile
Méthanol	Boutique Bio	MET302
Acide carboxylique 12C-Adamantane	Sigma Aldrich	106399
Acide carboxylique 14C-Adamantane	ViTrax		Synthèse sur mesure
Fioles Erlenmeyer de 125 mL	VWR	30623-174
Tubes Falcon de 50 mL	VWR	CA21008-940
Tubes microcentifuge	VWR	87003-294
Chambres de croissance des plantes	Conviron
Boîtes de pourboires	DiaMed	DIATEC530-8376
Rubbermaid Fourre-tout Roughneck 3 Gal	Amazone	B0B3345MYH
Papier filtre	VWR	CA28320-020
Pétri	VWR	11019-566
Agitateur avec porte-flacons	Forma Scientific	Modèle 4516
Cocktail à scintillation	Produits de recherche internationale	111195
Flacons à scintillation	VWR	10014-296
Compteur à scintillation	Beckman Coulter	LS 6000IC	Les flacons utilisés dépendront de votre compteur à scintillation
Séchoir à gel	Bio-Rad	Modèle 583
Imageur au phosphore à balayage laser	Bio-Rad	Imageur moléculaire FX