Article de méthode

Reprogrammation in vivo de cellules tumorales en cellules dendritiques conventionnelles de type 1

DOI :

10.3791/68739

⸱

1 août 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Medicine and Gene Therapy, Science for Life Laboratory, Lund Stem Cell Centre, Lund University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine, Lund University, 3Centre for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit la reprogrammation in vivo de cellules cancéreuses de souris en cellules dendritiques de type 1 dans le microenvironnement tumoral par l’expression forcée des facteurs de transcription PU.1, IRF8 et BATF3.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’efficacité de l’immunothérapie anticancéreuse repose sur le recrutement et l’activation des réponses des lymphocytes T cytotoxiques contre les tumeurs solides par les cellules dendritiques conventionnelles de type 1 (cDC1). Cependant, la génération de cDC1 pour l’immunothérapie du cancer est confrontée à des limites importantes, notamment un faible rendement cellulaire, une hétérogénéité fonctionnelle et une susceptibilité à l’immunosuppression dans le microenvironnement tumoral (TME). Nous avons récemment développé une modalité d’immunothérapie basée sur la reprogrammation in vivo des cellules cancéreuses en cellules immunogènes de type cDC1, ce qui a permis aux cellules cancéreuses de présenter les antigènes tumoraux comme des cDC1 et a induit des réponses des lymphocytes T cytotoxiques polyclonaux et une immunité antitumorale systémique durable. Ici, nous décrivons un protocole traitable pour générer des cellules de type cDC1 dans le TME en surexprimant le réseau minimal de régulation génique spécifique de cDC1 - PU.1, IRF8 et BATF3 (collectivement appelés PIB) - dans les cellules cancéreuses, suivi de l’implantation sous-cutanée d’un mélange de cellules transduites et parentales. La surexpression de PIB entraîne l’acquisition progressive du marqueur hématopoïétique CD45 et du complexe de présentation antigénique professionnel CMH de classe II sur les cellules tumorales, servant de lectures de surface cellulaire pour la reprogrammation in vivo de cDC1. Par rapport au processus de reprogrammation in vitro, la reprogrammation du modèle de mélanome de souris YUMM1.7 in vivo a démontré une cinétique plus rapide et une efficacité plus élevée. Les cellules de type cDC1 ont induit un remodelage rapide du TME en recrutant des cellules immunitaires de l’hôte dans les 3 premiers jours et en conduisant à la formation d’une structure lymphoïde tertiaire au 9e jour. Les cellules reprogrammées de type cDC1 ont persisté dans les tumeurs pendant au moins 9 jours, mais n’ont pas été détectées au 15e jour. Le protocole de reprogrammation in vivo de cDC1 décrit ici fournit une méthode robuste et traitable pour transformer efficacement les tumeurs « immunitaires-froides » en tumeurs « immuno-chaudes ». Dans l’ensemble, il offre une plate-forme puissante pour étudier les mécanismes sous-jacents à l’immunité antitumorale médiée par cDC1 et découvrir des combinaisons synergiques avec d’autres modalités d’immunothérapie du cancer.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les progrès récents dans les modalités d’immunothérapie du cancer, notamment le blocage des points de contrôle immunitaire (ICB), la thérapie cellulaire adoptive (ACT) et les vaccins, ont modifié le paysage du traitement du cancer1. Dans le mélanome, les taux de réponse à la protéine de mort cellulaire programmée 1 (-1) et à l’inhibition de la protéine associée aux lymphocytes T cytotoxiques 4 (CTLA-4) peuvent atteindre jusqu’à 60 %2. Néanmoins, plus de 40 % des patients atteints de mélanome ne répondent pas à l’ICB, et les taux de réponse dans les cancers moins immunogènes, tels que le cancer du sein, le cancer colorectal stable aux microsatellites et le glioblastome, restent inférieurs à 5 %, mettant en évidence des lacunes cliniques 3,4,5. L’un des principaux obstacles au succès clinique est la faible activation des réponses des lymphocytes T cytotoxiques, qui dépendent d’une présentation efficace de l’antigène dans le microenvironnement tumoral (TME)6.

Les cellules dendritiques conventionnelles de type 1 (cDC1) sont rares, mais indispensables à l’initiation de l’immunité spécifique à la tumeur, offrant trois signaux clés pour amorcer les réponses des lymphocytes T : (1) traitement et présentation professionnels des antigènes sur les principaux complexes d’histocompatibilité (CMH) de classe I et II, (2) co-stimulation via CD80 et CD86, et (3) signalisation pro-inflammatoire des cytokines, y compris IL-12 7,8. Parmi les sous-ensembles de cellules dendritiques (DC), les cDC1 excellent dans la présentation croisée d’antigènes associés aux cellules tumorales pour amorcer les lymphocytes T CD8+ naïfs ou réactiver ou pour favoriser la différenciation des lymphocytes T CD4+ en lymphocytes T auxiliaires de type 1 (TH1)9. De plus, les cDC1 sont les principaux producteurs de chimiokines, les ligands 9 et 10 des chimiokines du motif C-X-C (CXCL9/10), qui interviennent dans le recrutement des lymphocytes T dans le tissu tumoral 10,11,12,13. Au cours des dernières années, de nombreuses études ont mis en évidence que le rejet tumoral et les réponses efficaces à l’ICB ou à l’ACT sont fortement corrélés avec la présence de cDC1 intratumoraux12,13. Par conséquent, les cDC1 sont devenues une cible attrayante pour l’immunothérapie du cancer et l’exploitation réussie de leurs caractéristiques uniques peut avoir un potentiel translationnel important.

Les méthodes actuelles de génération de cDC1 sont basées sur l’isolement sanguin ou la différenciation à partir de progéniteurs CD34+ ou de cellules souches pluripotentes 14,15,16. Les stratégies cliniques prédominantes reposent sur l’isolement d’un mélange de sous-ensembles de DC autologues dans le sang et leur stimulation ex vivo avec des agonistes des récepteurs de type Toll ou des cytokines pro-inflammatoires pour induire un programme immunogène mature avant la réinjection16. Cependant, ces stratégies sont limitées par une faible maturation cellulaire, des barrières immunosuppressives dans le TME et l’hétérogénéité des sous-ensembles dans le mélange de DC perfusés, où seule une petite proportion de cDC1 est présente7. De plus, il est difficile d’isoler uniquement les cDC1 pour l’immunothérapie ou la vaccination contre le cancer en raison de leur abondance extrêmement faible dans le sang périphérique (<0,3 %)16. De plus, les cDC1 peuvent être produites à partir de cellules progénitrices CD34+ ou de cellules souches pluripotentes induites à l’aide de cytokines et de la signalisation NOTCH. Cependant, ces méthodes nécessitent des protocoles complexes et longs et produisent de faibles nombres et des populations hétérogènes de sous-ensembles de DC 17,18,19.

Pour remédier à ces limitations, la reprogrammation in vivo fournit une stratégie appropriée pour l’immunothérapie du cancer afin de générer des cellules de type cDC1, qui ressemblent aux propriétés phénotypiques, transcriptionnelles et fonctionnelles de cDC1s20. Grâce à la surexpression du réseau de régulation génique minimal spécifique de cDC1 - PU.1, IRF8 et BATF3 (collectivement appelés PIB) - les fibroblastes, les cellules stromales et les cellules cancéreuses ont été progressivement reprogrammés en cellules de type cDC1, permettant le traitement et la présentation de l’antigène tumoral sur les classes I et II du CMH, la signalisation co-stimulatrice via CD80 et CD86, et la sécrétion de cytokines/chimiokines, y compris CXCL9/10 et IL-1220, 21,22,23. La reprogrammation de cDC1 a progressé plus rapidement et plus efficacement dans les xénogreffes humaines in vivo et indépendamment de l’immunosuppression, générant des cellules de type cDC1 avec une signature immunogène mature20. Dans les tumeurs de mélanome syngéniques, nous avons observé que les cellules de type cDC1 remodelaient leur TME, induisaient la formation d’une structure lymphoïde tertiaire (TLS), et recrutaient et développaient des lymphocytes T polyclonauxH1 et des lymphocytes T à mémoire cytotoxique, conduisant à une immunité systémique à long terme20. Enfin, nous avons développé une nouvelle modalité d’immunothérapie du cancer basée sur la reprogrammation in situ de cellules cancéreuses en cellules de type cDC1 par injection intratumorale de vecteurs adénoviraux20. Ces résultats ouvrent la voie à l’application clinique de la reprogrammation des cDC1 en tant que nouvelle modalité d’immunothérapie du cancer capable d’exploiter les propriétés fonctionnelles des cDC1.

Ici, nous présentons un protocole tractable pour générer des cellules de type cDC1 dans le TME basé sur la reprogrammation in vivo de cDC1. L’administration lentivirale de PIB aux cellules cancéreuses et l’implantation ultérieure sous forme de mélange défini de cellules cancéreuses transduites avec des cellules cancéreuses parentales non transduites permettent la reprogrammation in vivo d’une fraction contrôlée de cellules cancéreuses au sein de l’EUT. De plus, cette méthode n’est pas limitée par l’efficacité de l’administration in situ des vecteurs viraux20. Nous décrivons les étapes d’une production efficace de vecteurs lentiviraux, d’un titrage fonctionnel et d’une reprogrammation in vivo de cDC1 en utilisant le modèle de mélanome syngénique, YUMM1.7, à titre d’exemple. Nous détaillons le dispositif expérimental et la stratégie de contrôle pour l’analyse in vivo de cellules de type cDC1 reprogrammées par cytométrie en flux après dissociation tumorale. Nous fournissons également les étapes pour évaluer les changements dans le TME en effectuant une cryoconservation, une section et une coloration par immunofluorescence des sections tumorales, suivie d’une microscopie confocale. Enfin, nous abordons comment surveiller l’immunité induite par cDC1 en mesurant la croissance et la survie des tumeurs. Cette approche flexible et évolutive offre aux chercheurs un outil précieux pour évaluer les stratégies de traitement combinatoire avec reprogrammation in vivo de cDC1, pour caractériser les changements dans la néogenèse du TME et du TLS dans des modèles de cancer ou pour effectuer de grands écrans modifiant l’expression de diverses voies immunitaires, par exemple, la présentation de l’antigène ou la sécrétion de cytokines/chimiokines, et démêler leur impact sur l’immunité antitumorale.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les procédures expérimentales sur les animaux ont été effectuées conformément à la réglementation suédoise après l’approbation du Conseil suédois de l’agriculture.

1. Préparation du réactif

  1. Pour préparer le milieu complet DMEM (Modified Eagle’s Medium) de Dulbecco, ajoutez 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS), 1 mM de pyruvate de sodium, 100 U/mL de pénicilline (Pen), 2 mM de substitut de glutamine et 100 mg/mL de streptomycine (Streptomycine).
  2. Pour préparer le milieu complet RPMI 1640, ajoutez 10 % (v/v) de FBS, 2 mM de substitut de glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 50 mM de 2-mercaptoéthanol, 100 U/mL de stylo et 100 mg/mL de streptocoque.
  3. Pour préparer un milieu complet de DMEM/F12, ajoutez 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS), 1 mM de pyruvate de sodium, 0,1 mM d’acides aminés non essentiels, 100 U/mL de stylo et 100 mg/mL de streptocoque.
  4. Pour préparer 1 mg/mL de polyéthylénimine (PEI), dissoudre 100 mg de poudre de PEI dans 100 mL d’eau désionisée stérile dans un bécher en verre ou un tube conique. Placez le bécher sur un agitateur magnétique et remuez à température ambiante (RT) pour créer un vortex jusqu’à dissolution complète. Ajustez le pH à 6,9-7,1, en ajoutant de l’acide chlorhydrique (HCl)/hydroxyde de sodium (NaOH) goutte à goutte, et filtrez la solution à travers un filtre à membrane PES de 0,22 μm.
  5. Pour préparer 1 mM de butyrate de sodium, dissoudre 1,10 mg dans 10 mL d’eau désionisée stérile.
  6. Pour préparer 8 mg/mL de Polybrene, dissoudre 80 mg de poudre de Polybrene dans 10 mL d’eau déminéralisée stérile.
  7. Pour préparer un tampon FACS, ajoutez 2 % de FBS et 1 mM d’EDTA à une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).

2. Production de lentivirus

  1. Décongelez les cellules HEK 293T en ajoutant 1 mL de cellules à 9 mL de milieu complet DMEM préchauffé et centrifugez les cellules à 350 × g pendant 5 min. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 20 mL de milieu complet DMEM et cultiver les cellules dans une plaque de 150 mm à 37 °C avec 5 % de CO2.
  2. Développez et divisez les cellules HEK 293T lorsqu’elles atteignent 80-90 % de confluence. Pour diviser les cellules, laver une fois avec du PBS, ajouter 5 mL de trypsine pour les dissocier de la plaque, et incuber 5 à 10 min à 37 °C avec 5 % de CO2.
  3. Prélever des cellules avec 5 mL de milieu complet DMEM, les centrifuger à 350 × g pendant 5 min et les diviser à l’échelle 1:6 en nouvelles plaques de 150 mm, 48 h avant la transfection.
    REMARQUE : La qualité de la lignée cellulaire productrice de lentivirus est cruciale pour la production de titres élevés. Ne laissez pas les cellules dépasser 95 % de confluence et évitez de les ensemencer à <30 % de confluence.
  4. Après 48 h, ou lorsque les cellules atteignent 70-80 % de confluence, préparez le mélange de transfection dans un tube conique de 50 ml. Utilisez le plasmide de transfert suivant : 1) SFFV-PIB-IRES-eGFP-un vecteur lentiviral polycistronique contenant les facteurs de transcription PU.1, IRF8, BATF3, un site d’entrée ribosomique interne (IRES) et une protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) comme rapporteur de transduction fluorescente ; ou 2) SFFV-eGFP, un vecteur lentiviral témoin avec un site de clonage multiple et eGFP ; ou 3) SFFV-mCherry, un vecteur lentiviral exprimant mCherry. Ajouter 10 μg de plasmide de transfert, 7,5 μg de plasmide d’emballage psPAX2 et 2,5 μg de plasmide d’enveloppe pMD2.G. Remplissez le tube avec Opti-MEM pour atteindre un volume total de 2 mL. Enfin, ajoutez 60 μL du réactif de transfection PEI (provenant de la pâte de 1 mg/mL) au mélange de transfection.
    REMARQUE : Le vecteur lentiviral SFFV-eGFP est utilisé comme contrôle de transduction pour les expériences de reprogrammation afin de tenir compte de l’immunogénicité à médiation lentivirale, tandis que SFFV-mCherry est utilisé pour générer des lignées cellulaires cancéreuses marquées par fluorescence.
  5. Vortex la transfection se mélange complètement pendant 1 min et incube pendant 15 min à RT pour permettre la formation de complexes ADN-lipides.
    REMARQUE : La confluence influence significativement les titres viraux. La transfection de cellules à moins de 70 % de confluence entraînera des titres viraux plus faibles en raison d’un nombre réduit de cellules recevant les plasmides.
  6. Aspirez le milieu des cellules HEK 293T et ajoutez 10 mL de DMEM sans Pen/Step et avec 10 % de FBS filtré stérilement.
  7. Ajouter le mélange de transfection goutte à goutte sur les plaques de 150 mm et incuber pendant 16 h à 37 °C avec 5 % de CO2.
  8. Après la transfection, remplacer le milieu par 20 mL de milieu complet DMEM complété par 1 mM de butyrate de sodium, et incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO2.
    REMARQUE : Le butyrate de sodium est un inhibiteur de classe 1 de l’histone désacétylase (HDAC) et peut améliorer l’expression génique dans les cellules HEK 293T en induisant l’hyperacétylation des histones, ce qui ouvre la structure de la chromatine et facilite la transcription de l’emballage viral et des plasmides de transfert. L’efficacité de la transfection peut être évaluée en vérifiant l’expression de l’eGFP à l’aide d’un microscope à fluorescence.
  9. Prélever le surnageant contenant du lentivirus 48 h et 60 h après la transfection dans des tubes coniques de 50 mL. Après la première collecte, ajouter 12 ml de milieu complet DMEM préchauffé par plaque de 150 mm pour la deuxième collecte. Conservez les collections à 4 °C, filtrez-les à travers un filtre PES à faible teneur en protéines de 0,45 μm et combinez-les.
  10. Pour concentrer le virus, pipeter 37 g de milieu contenant des lentivirus dans des tubes en polypropylène à paroi mince ouverts de 38,5 ml. Mesurez le poids des tubes à l’aide d’une balance de table.
    REMARQUE : Mesurez le poids du milieu contenant le lentivirus plutôt que son volume, car le poids offre une plus grande précision pour l’équilibrage. Le poids des tubes doit être bien équilibré pour éviter d’endommager l’ultracentrifugeuse.
  11. Placez les tubes dans les godets d’ultracentrifugation, fermez les couvercles et placez les godets dans un rotor à godets oscillants. Centrifugeuse à 25 000 × g pendant 90 min à 4 °C.
  12. Après la centrifugation, retirez les tubes des godets et aspirez le surnageant.
    REMARQUE : Les mêmes tubes peuvent être remplis à plusieurs reprises et utilisés pour un nombre total de trois cycles de centrifugation afin de produire une plus grosse pastille de lentivirus par tube.
  13. Placez les tubes en polypropylène à paroi mince à toit ouvert à l’envers pendant 5 minutes sur une lingette de laboratoire ou un matériau absorbant similaire pour permettre à l’excès de liquide de s’écouler et de sécher la pastille.
  14. Ajouter 200 μL de DMEM glacé complété par HEPES ou PBS à chaque granule. Placez les tubes de microcentrifugation dans des tubes coniques de 50 ml et fermez le couvercle pour maintenir la stérilité.
  15. Incuber le granulé pendant la nuit à 4 °C pour permettre la remise en suspension.
  16. Combinez les granulés remis en suspension, aliquotez-les et conservez-les à -80 °C jusqu’à un an.
    REMARQUE : Pour éviter la perte de titre due à des cycles répétés de congélation-décongélation, utilisez des volumes d’aliquote plus petits (p. ex., 50-200 μL).

3. Titrage fonctionnel du virus

REMARQUE : Cette étape doit être répétée pour chaque lot de lentivirus afin de déterminer la dose virale optimale requise pour obtenir un rapport de 1:1 entre les cellules transduites (eGFP+) et les cellules non transduites (eGFP-).

  1. Décongeler et développer les cellules cancéreuses dans des milieux de culture appropriés (p. ex., la lignée cellulaire de mélanome murin YUMM1.7 dans un milieu complet DMEM/F12).
    REMARQUE : Les cellules doivent subir au moins un tour de division avant une expérience de reprogrammation. Les passages de cellules doivent être similaires entre les expériences.
  2. Un jour avant l’établissement de la tumeur, soulevez les cellules cancéreuses en aspirant leur milieu de culture, en les lavant une fois avec du PBS et en ajoutant 2 ml ou 5 ml de trypsine par plaque de 100 mm ou 150 mm. Incuber pendant 5 à 10 minutes à 37 °C avec 5 % de CO2 et prélever les cellules en ajoutant 8 ml ou 5 ml de milieu complet par plaque de 100 mm ou 150 mm, respectivement, dans des tubes coniques de 50 ml.
  3. Centrifuger les cellules à 350 × g pendant 5 min pour éliminer la trypsine et la remettre en suspension dans un milieu complet.
  4. Prenez une aliquote de 10 μL de cellules, ajoutez 10 μL de Trypan Blue et comptez les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre.
  5. Transférez 6 × 105 cellules dans un nouveau tube conique de 50 mL contenant 12 mL de milieu complet et ajoutez 12 μL de polybrène à 8 mg/mL à la suspension cellulaire pour atteindre une concentration de travail de 8 μg/mL.
  6. Pipeter 2 mL de suspension cellulaire dans chaque puits sur une plaque de culture tissulaire à 6 puits.
    REMARQUE : Si nécessaire, augmentez le nombre de cellules à 1,2-1,8 x 106 par plaque de 6 puits.
  7. Ajoutez des volumes croissants de lentivirus dans chaque puits pour déterminer le volume optimal nécessaire pour obtenir un rapport de 1:1 entre les cellules transduites (eGFP+) et les cellules non transduites (eGFP-).
    REMARQUE : Ajouter les volumes recommandés de lentivirus de 1, 2, 4, 8, 16 et 32 μL en trois exemplaires. Effectuer le titrage fonctionnel du vecteur lentiviral témoin vide SFFV-eGFP et SFFV-mCherry.
  8. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO2.
  9. Le jour 0, retirer le milieu contenant du lentivirus, le remplacer par un milieu frais et l’incuber pendant 72 h à 37 °C avec 5 % de CO2.
  10. Le jour 3, vérifiez l’expression de l’eGFP dans les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence.
    REMARQUE : Cette étape permet une vérification rapide de la transduction cellulaire mais ne remplace pas l’analyse effectuée par cytométrie en flux à l’étape 3.14 pour déterminer le rapport exact entre les cellules eGFP+ et eGFP- .
    Dans certaines cellules cancéreuses (p. ex., les cellules de mélanome de souris B16), le signal eGFP peut être faible et difficile à détecter à l’aide d’un microscope à fluorescence. Il est recommandé de procéder directement à la cytométrie en flux.
  11. Aspirez le milieu, lavez les cellules une fois avec du PBS et ajoutez 500 μL de trypsine par puits. Incuber pendant 5 à 10 min à 37 °C avec 5 % de CO2.
  12. Soulevez les cellules de chaque puits avec 1,5 mL de tampon FACS et pipetez la suspension cellulaire dans des tubes de polystyrène de 5 mL. Prélever une aliquote et compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre et d’une coloration au bleu de trypan.
  13. Centrifuger la suspension cellulaire à 350 × g pendant 5 min, remettre la pastille en suspension dans 100 μL de tampon FACS et procéder à l’analyse par cytométrie en flux.
  14. Quantifiez le rapport précis entre les cellules transduites (eGFP+) et les cellules non transduites (eGFP-) par cytométrie en flux. Pour les essais in vivo , utilisez le volume de lentivirus dont le rendement se rapproche le plus du rapport de 1:1.
    REMARQUE : Pour déterminer avec précision le rapport entre les cellules eGFP+ et eGFP- , incluez les cellules cancéreuses non transduites comme témoins négatifs pour le gating.

4. Etablissement tumoral sous-cutané pour la reprogrammation in vivo

  1. Décongeler et développer les cellules cancéreuses dans leur milieu de culture approprié pour générer des cellules exprimant mCherry.
    REMARQUE : L’expression de mCherry facilite la distinction entre les cellules cancéreuses lors de l’analyse par cytométrie en flux et celles des autres populations de la tumeur, par exemple, les cellules stromales et immunitaires endogènes.
  2. Effectuer les étapes 3.2 à 3.4 et remettre les cellules en suspension dans un milieu complet à une concentration de 10à 5 cellules par ml.
  3. Ajouter 8 μg/mL de polybrène et le volume déterminé de lentivirus SFFV-mCherry à la suspension cellulaire pour atteindre une efficacité de transduction de >90 %.
    REMARQUE : Alternativement, si l’atteinte d’une transduction de >90 % compromet la viabilité cellulaire, triez les cellules mCherry+ par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) 72 h après la transduction et élargissez les cellules triées en culture.
  4. Plaque de 5 mL de suspension cellulaire (contenant 5 × 105 cellules) par plaque de 100 mm et incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 h.
  5. Après 24 h, remplacer le milieu par 10 mL de milieu complet et dilater les cellules en les cultivant à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant au moins 7 jours avant de commencer les expériences de reprogrammation.
  6. Après l’expansion, suivez les étapes 3.2 à 3.4 pour préparer les suspensions de cellules en vue d’une transduction ultérieure avec le volume préalablement déterminé de SFFV-PIB-IRES-eGFP, ce qui permet d’obtenir le rapport le plus proche de 1:1 entre les cellules transduites (eGFP+) et les cellules non transduites (eGFP-) le jour 3.
  7. Ajouter 8 μg/mL de polybrène à la suspension cellulaire, ainsi que le volume de lentivirus préalablement déterminé à la suspension cellulaire dans des tubes coniques de 50 mL. Bien mélanger sans créer de bulles.
  8. Pipeter 2 mL de suspension cellulaire (contenant 10 à5 cellules) par puits dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits et incuber pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO2.
    REMARQUE : On peut également plaquer les cellules dans 5 mL de milieu de transduction dans des plaques de culture tissulaire de 100 mm. Cependant, notez que l’efficacité de la transduction peut être réduite dans des volumes plus importants et doit être déterminée empiriquement comme décrit aux étapes 3.1 à 3.13.
    Il est recommandé de transduire au moins 10 % de cellules en plus pour compenser la perte potentielle de cellules pendant le processus de transduction et pour assurer un volume suffisant pour le pipetage ou l’injection lors de l’établissement de la tumeur.
  9. Après 24 h, retirer le milieu contenant du lentivirus, laver deux fois avec du PBS, ajouter 500 μL de trypsine dans chaque puits et incuber pendant 5 à 10 minutes à 37 °C avec 5 % de CO2.
  10. Vérifiez au microscope optique si les cellules se sont complètement dissociées des plaques, puis collectez-les avec un milieu complet dans des tubes coniques de 50 ml.
  11. Granulez les cellules en les centrifugeant pendant 5 min à 350 × g, lavez le granulé avec du PBS et centrifugez-le à nouveau pendant 5 min à 350 × g. Prélever une aliquote et compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre et d’une coloration au bleu de trypan.
  12. Remettre la pastille en suspension dans du PBS glacé pour atteindre une concentration de 2-4 × 107 cellules par mL, ce qui correspond à 1-2 × 106 cellules dans 50 μL de volume d’injection par tumeur.
    REMARQUE : Il est important de noter que ces chiffres ont été validés pour les tumeurs de mélanome YUMM1.7 afin d’isoler in vivo des cellules de type cDC1 reprogrammées pour l’analyse par cytométrie en flux. Pour d’autres lignées cellulaires et pour d’autres lectures expérimentales, telles que la croissance tumorale et les expériences de survie, les chiffres doivent être testés empiriquement. Pour les expériences de croissance et de survie tumorales, un nombre de cellules plus bas, allant de 100 000 à 250 000 cellules par tumeur, est recommandé.
  13. Installez-vous dans la zone de travail où les expériences sur les animaux sont effectuées et gardez les cellules sur la glace.
    REMARQUE : Après la préparation des cellules, effectuez les injections de cellules le plus rapidement possible car la viabilité des cellules est réduite avec le temps.
  14. Préparez la solution d’anesthésie contenant 3 μL de xylazine (20 mg/mL), 27 μL de kétamine (100 mg/mL) et 30 μL de PBS par souris.
  15. Anesthésie les souris CD45.1 en injectant 60 μL d’anesthésique par voie intrapéritonéale. Randomisez les souris et gardez-les sur un coussin chauffant pour éviter une baisse de la température corporelle. Appliquez une crème pour les yeux sur leurs yeux pour prévenir la déshydratation oculaire pendant l’anesthésie.
    REMARQUE : Il est essentiel d’utiliser des souris CD45.1 pour permettre de distinguer les cellules de type cDC1 reprogrammées in vivo exprimant l’allèle CD45.2 de type sauvage et les cellules immunitaires endogènes. Si la lignée cellulaire est CD45.1, les souris C57BL/6 (CD45.2) peuvent être utilisées comme receveuses. Les souris doivent être appariées en fonction du sexe et de l’âge entre les groupes expérimentaux et randomisées avant l’établissement de la tumeur.
  16. Attendez 5 à 10 minutes jusqu’à ce que toutes les souris soient complètement anesthésiées.
  17. Rasez le flanc droit des souris à l’aide d’un rasoir ; Si vous le souhaitez, marquez-les à l’aide d’une tondeuse à oreilles. Désinfectez la zone et essuyez les cheveux restants avec de l’éthanol à 70 %.
  18. Remettez en suspension les cellules cancéreuses en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette P1000. Chargez la suspension cellulaire dans une seringue de 0,5 ml de 30 g.
  19. Soulevez doucement la peau du flanc rasé de la souris à l’aide de deux doigts et insérez la pointe de l’aiguille à l’endroit où la peau forme un pli.
    REMARQUE : Faites attention à ne pas vous percer les doigts avec l’aiguille.
  20. Relâchez la peau, maintenez la seringue en place d’une main et utilisez deux doigts de l’autre main pour étirer la peau de la souris.
  21. Injectez lentement 50 μL de suspension de cellules cancéreuses pour créer un renflement ovale (gonflement sous-cutané) au site d’injection.
    REMARQUE : Si un renflement ne se forme pas, la suspension peut s’être infiltrée dans le tissu sous-cutané environnant, ce qui peut entraîner une formation tumorale incohérente ou ratée.
  22. Après l’intervention, surveillez le réveil de toutes les souris pour assurer leur survie après l’anesthésie.
  23. Maintenez les souris dans un environnement à température contrôlée avec 23 ± 2 °C et un cycle clair/obscurité fixe de 12 heures et un accès libre à la nourriture et à l’eau.
    REMARQUE : Si vous souhaitez surveiller la croissance tumorale, passez aux étapes 4.24-4.26. Sinon, sautez ces étapes et passez directement aux sections suivantes.
  24. Pour surveiller la croissance tumorale, retenez doucement la souris d’une main, ce qui permet une visualisation claire de la tumeur.
  25. À l’aide d’un pied à coulisse électronique, mesurez la longueur (l), la largeur (w) et la hauteur (h) de la tumeur. Calculez le volume tumoral (V) à l’aide de la formule : V = (l x l x h) / 2.
  26. Mesurez les dimensions de la tumeur tous les deux à trois jours. Lorsque la tumeur atteint un volume qui répond au critère d’évaluation sans cruauté (par exemple, 1 500 mm³), euthanasier l’animal conformément aux directives éthiques et institutionnelles.

5. Isolement tumoral pour l’analyse par cytométrie en flux

  1. Préparez des ciseaux, des pinces, un tampon FACS et des plaques de culture non tissulaire à 12 puits avec un milieu complet RPMI glacé pour la collecte d’échantillons tumoraux.
  2. Préparez la solution de digestion tumorale en mélangeant 30 μL de collagénase D de 100 mg/mL et 3 μL de DNAse I de 10 mg/mL dans 3 mL de milieu complet RPMI par tumeur (pour atteindre une concentration de travail de 1 mg/mL de collagénase D et de 10 μg/mL d’ADN I).
    REMARQUE : Si l’efficacité de la digestion n’est pas optimale, ajoutez 2 à 5 mM de CaCl2 pour soutenir l’activité de la collagénase.
  3. Euthanasier les souris par luxation cervicale ou asphyxie au CO2 le jour de l’isolement.
  4. Excise les tumeurs sous-cutanées avec des ciseaux et des pinces et place chaque tumeur dans un puits de la plaque de culture non tissulaire à 12 puits avec RPMI glacé. Essayez de minimiser l’excision du tissu non tumoral.
  5. Coupez les échantillons de tumeur en3 morceaux de 1 à 2 mm à l’aide de ciseaux, collectez les morceaux dans des tubes coniques de 50 ml contenant 3 ml de solution de digestion et incubez à 37 °C en agitant à 200-250 tr/min pendant 30 à 45 min.
    REMARQUE : Vortex ou pipette toutes les 15 min pour faciliter le processus de digestion.
  6. Après la digestion, pipeter vigoureusement le mélange pendant 1 min à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL. Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 70 μm dans un nouveau tube conique de 50 mL.
  7. À l’aide du piston d’une seringue de 10 ml, écraser les morceaux non digérés contre la crépine à cellules de 70 μm et rincer la passoire avec 10 mL de milieu complet RPMI.
  8. Centrifuger la suspension cellulaire à 350 × g pendant 5 min à 4 °C, la remettre en suspension dans 1 mL de tampon FACS et compter les cellules viables.
  9. Transférez la suspension cellulaire dans des tubes de polystyrène de 5 ml, les cellules de granulés à 350 × g pendant 5 min, et remettez en suspension 10à 6 cellules viables par 100 μL de tampon FACS.
  10. Cellules séparées pour les commandes monochromes (SC) et FMO dans des tubes en polystyrène séparés.
  11. Préparez un mélange maître de coloration d’anticorps contenant du sérum de rat (1:100) pour bloquer la liaison non spécifique ; un colorant de viabilité fixable (1:100) pour exclure les cellules mortes de l’analyse ; et des anticorps anti-CD45.1, anti-CD45.2 et anti-CMH-II marqués par fluorescence à leur concentration optimale. Ajoutez 100 μL du mélange maître à chaque échantillon et incubez pendant 20 min à 4 °C dans l’obscurité.
  12. Lavez les échantillons 2 fois avec 2 mL de tampon FACS et procédez à l’analyse par cytométrie en flux.
  13. Quantifier les pourcentages de cellules de type cDC1 exprimant CD45.2 et/ou le CMH-II, en intégrant des cellules cancéreuses transduites (eGFP+) (CD45.1-mCherry+).
    REMARQUE : Ce protocole peut être utilisé pour effectuer l’immunophénotypage de tumeurs après reprogrammation in vivo de cDC1 en complétant le panel de coloration avec des anticorps contre les populations de cellules immunitaires lymphoïdes et/ou myéloïdes endogènes.

6. Congélation et coupe de tumeurs pour l’analyse par microscopie confocale

  1. Préparez-vous à l’isolement de la tumeur en suivant les étapes 5.1 et 5.3. Excise les tumeurs sous-cutanées avec des ciseaux et des pinces.
  2. Fixez les tumeurs dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) fraîchement préparé dans du PBS à 4 °C avec une légère agitation. Ajustez le temps de fixation en fonction de la taille de la tumeur, en utilisant 1 h par mm³ de tissu comme ligne directrice.
  3. Transférez les tumeurs dans 15 % de saccharose dans du PBS et incubez à 4 °C tout en secouant doucement les tissus jusqu’à ce qu’ils coulent au fond du tube. Ensuite, déplacez-les à 20 % de saccharose dans le PBS dans les mêmes conditions.
  4. Une fois que les tumeurs se sont installées au fond du tube, incubez-les dans un mélange 1:1 de 20 % de saccharose dans un composé PBS et OCT pendant 30 min à 4 °C en agitant.
  5. Retirez le mélange, intégrez les tissus dans un cryomoule avec 100 % d’OCT et congelez-le à l’aide d’azote liquide.
    REMARQUE : Portez toujours un équipement de protection individuelle approprié (cryogants, écran facial et blouse de laboratoire) pour éviter les brûlures par le froid ou les blessures dues à l’expansion rapide de la vapeur. Travaillez dans un endroit bien ventilé pour éviter le risque d’asphyxie.
    1. Stockez les blocs à -80 °C dans des récipients fermés pour éviter la déshydratation.

7. Coloration par immunofluorescence de sections tumorales

  1. À l’aide d’un cryostat, découpez les tumeurs en sections d’environ 8 m d’épaisseur et montez-les sur des lames de verre de microscope. Si nécessaire, stockez les lames à -80 °C.
    REMARQUE : Pour préserver l’intégrité des tissus, conservez les blocs et les lames avec les coupes tumorales montées sur de la glace sèche pendant le transport vers et depuis le cryostat. Assurez-vous que le cryostat est maintenu à -20 °C pendant la section.
  2. Décongeler les lames dans du PBS pendant 5 min et les fixer dans une solution de PFA à 4 % pendant 10 min à RT.
  3. Après la fixation, laver les lames dans du PBS pendant 5 min.
    REMARQUE : Assurez-vous que les tissus restent hydratés ; Conservez-les toujours dans un liquide tout au long de toutes les étapes de coloration ultérieures. Si l’expérience doit être mise en pause, les lames peuvent être stockées dans PBS à RT jusqu’à 3 heures. Évitez de stocker les diapositives dans PBS pendant la nuit.
  4. Pour la récupération de l’antigène, remplissez un cuiseur vapeur d’eau et allumez-le. Placez un bocal contenant de l’eau déminéralisée et un bocal contenant 10 mM de citrate de sodium (pH 6) dans le cuiseur vapeur et couvrez l’ouverture avec du papier d’aluminium. Sans retirer le couvercle, insérez un thermomètre dans les évents du couvercle du cuiseur vapeur, percez le papier d’aluminium et surveillez la température, en vous assurant que les solutions atteignent ~99 °C.
  5. Lorsque les tampons atteignent ~99 °C, trempez les lames dans de l’eau désionisée pendant 10 secondes, puis transférez-les rapidement dans la solution de récupération de l’antigène.
  6. Incuber les lames à ~99 °C pendant 15 min.
  7. Lavez les lames dans 1x PBS pendant 3 x 5 min.
  8. Utilisez un stylo Pap barrière hydrophobe pour délimiter chaque section de tissu, formant un périmètre hydrophobe qui empêche tout liquide ajouté aux tissus de s’échapper.
    REMARQUE : Les lavages ultérieurs du PBS peuvent perturber le périmètre hydrophobe entourant les tissus et nécessiter un renouvellement. Dessinez-le à nouveau au besoin.
  9. Bloquez et perméabilisez les tissus avec 150 μL de tampon de blocage (5 % de sérum et 0,5 % de Triton X-100 dans 1x PBS) pendant 60 min à RT. Pour toutes les étapes de coloration, utilisez du sérum de la même espèce que l’hôte de l’anticorps secondaire.
  10. Laver les lames dans 1x PBS pendant 3 x 5 min.
  11. Incuber des tissus avec 20 μg/mL de l’anticorps anti-CD45 primaire dans un tampon bloquant (5 % de sérum et 0,5 % de Triton X-100 dans 1X PBS) pendant une nuit à 4 °C.
    REMARQUE : Pour utiliser d’autres anticorps, validez empiriquement la concentration d’anticorps.
  12. Laver les lames dans 1x PBS pendant 3 x 5 min.
  13. Incuber les coupes de tissu avec l’anticorps secondaire anti-rat de chèvre conjugué à AlexaFluor-647 à une dilution de 1:250 dans un tampon bloquant (sérum à 5 %) pendant 2 h dans l’obscurité à RT.
    REMARQUE Après avoir ajouté l’anticorps secondaire, effectuez toutes les étapes suivantes dans l’obscurité pour éviter le photoblanchiment des fluorophores.
  14. Laver les lames dans 1x PBS pendant 3 x 5 min.
  15. Incuber des tissus avec 1 μg/mL de DAPI et 20 μg/mL d’anticorps conjugués AlexaFluor-594 dans un tampon bloquant (5 % de sérum) pendant 1 h dans l’obscurité à RT.
  16. Laver les lames dans 1x PBS pendant 3 x 5 min.
  17. Ajoutez une goutte de solution de montage sur chaque section de tumeur, puis appliquez quelques gouttes de milieu de montage sur la lamelle. Retournez rapidement la lamelle sur la lame pour la monter et assurez-vous de l’absence de bulles à proximité des tumeurs.
  18. Laissez les lames sécher pendant la nuit et imagez-les par microscopie confocale.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une vue d’ensemble schématique du protocole de reprogrammation in vivo tractable est présentée à la figure 1. Tout d’abord, nous avons produit le vecteur lentiviral polycistronique SFFV-PIB-IRES-eGFP (PIB-eGFP), codant pour les facteurs de reprogrammation CP1 PU.1, IRF8, BATF3, suivis d’un site d’entrée ribosomique interne (IRES) et d’une protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) dans la lignée cellulaire d’emballage HEK 293T. Pour contrôler l’immunogénicité médiée par le lentivirus, nous avons produit un vecteur SFFV-MCS-eGFP (eGFP) vide, contenant un site de clonage multiple (MCS) et IRES-eGFP, mais excluant les facteurs de reprogrammation. Suite à la production virale, nous avons récolté le surnageant contenant du lentivirus et l’avons concentré par ultracentrifugation. Nous avons titré fonctionnellement le virus pour déterminer la quantité nécessaire pour obtenir un rapport de 1:1 entre les cellules transduites (eGFP+) et les cellules non transduites (eGFP-), que nous avons évalué le 3e jour après la transduction. Ensuite, nous avons utilisé la quantité de virus résultante pour transduire la lignée cellulaire cancéreuse sélectionnée au jour -1. Après 24 h, nous avons collecté les cellules et les avons implantées par voie sous-cutanée pour établir des tumeurs. Cette stratégie a permis de s’assurer que les cellules transduites se reprogrammaient en cellules de type cDC1 in vivo, au sein du TME. À des moments précis après la greffe, nous avons excisé et traité des tumeurs pour des analyses en aval, y compris la cytométrie en flux des cellules tumorales dissociées, afin de quantifier l’efficacité de la reprogrammation in vivo, ou la coloration par immunofluorescence de sections tumorales cryopréservées pour caractériser les changements dans le TME.

Tout d’abord, pour assurer la production de titres lentiviraux élevés, nous avons surveillé les cellules HEK 293T avant la transfection, en visant à atteindre une confluence de 70-80 % et 24 h plus tard, nous avons évalué l’efficacité de la transfection par expression eGFP par microscopie à fluorescence (Figure 2A). Ensuite, nous avons collecté un milieu contenant le virus 48 h et 60 h après la transfection, l’avons ultracentrifugé et stocké dans des aliquotes à -80 °C (Figure 2B). Ensuite, nous avons déterminé la quantité virale optimale nécessaire pour obtenir un rapport de 1:1 entre les cellules eGFP+ et eGFP- dans les cellules de mélanome YUMM1.7. Nous avons ensemencé 10 cellulesde 5 YUMM1.7 par puits dans une plaque de 6 puits, transduit les cellules avec des volumes croissants de lentivirus et remplaçons le surnageant contenant le virus par un milieu complet DMEM/F12 frais après 24 h (Figure 2C). Le jour 3, nous avons évalué l’expression de l’eGFP par microscopie à fluorescence, avant de procéder à la quantification des pourcentages précis de cellules eGFP+ par cytométrie en flux (Figure 2C). Pour quantifier le rapport entre les cellules eGFP+ et les cellules eGFP- , nous avons utilisé des cellules uniques vivantes pour exclure les cellules mortes et les doublets (Figure 2D). Le volume optimal du lot de lentivirus produit a été déterminé à la fois pour le PIB-eGFP et le virus témoin eGFP à 2 μL par 10 cellules5 YUMM1.7, ce qui a donné 50,0 ± 0,3 % et 63,0 ± 0,9 % de cellules eGFP+ , respectivement (figure 2E).

Ensuite, pour évaluer l’efficacité de la reprogrammation in vivo, nous avons généré une lignée cellulaire cancéreuse marquée par fluorescence (mCherry+) (YUMM1.7-mCherry). Cela nous a permis de faire la distinction entre les cellules cancéreuses et les cellules stromales ou immunitaires en intégrant des cellules mCherry+ vivantes dans l’analyse par cytométrie en flux (Figure 3A,B). Nous avons ensuite transduit des cellules YUMM1.7-mCherry avec 2 μL de PIB-eGFP ou le virus témoin eGFP par 10à 5 cellules pour obtenir un rapport eGFP+ à eGFP- de 1:1. Nous avons implanté par voie sous-cutanée 1,6 × 106 cellules par tumeur chez des souris CD45.1 et conservé une aliquote de cellules à cultiver in vitro à des fins de comparaison. Nous avons évalué l’efficacité de la reprogrammation par cytométrie en flux, en contrôlant les cellules vivantes mCherry+ eGFP+ et CD45.1- pour exclure les cellules immunitaires de l’hôte qui ont englouti eGFP ou mCherry (Figure 3B). Du 1er au 9e jour, nous avons observé l’acquisition progressive de l’expression de CD45.2 et/ou du CMH-II, marquant les cellules de type cDC1 partiellement reprogrammées (CD45.2+ MHC-II- ou CD45.2- MHC-II+) et les cellules de type cDC1 entièrement reprogrammées (CD45+ MHC-II+) (Figure 3C). Nous avons validé que la reprogrammation des cellules cancéreuses de souris in vivo entraînait des pourcentages plus élevés de cellules de type cDC1 au jour 9 par rapport aux conditions in vitro (9,54 ± 1,54 % CD45+ MHC-II+ in vivo vs 4,72 ± 1,1 % CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0,018). La cinétique de reprogrammation a également été accélérée puisque nous avons observé un pourcentage plus élevé de cellules de type cDC1 dès le jour 4 (8,7 ± 3,3 % de CD45+ MHC-II+ in vivo vs 0,3 ± 0,1 % de CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0,05), indiquant que la présence de signaux environnementaux favorise une reprogrammation plus rapide et plus efficace vers les cellules de type cDC119. Alors que des cellules de type cDC1 reprogrammées in vitro étaient présentes jusqu’au 15e jour, les cellules de type cDC1 in vivo ont persisté pendant 9 jours, mais n’ont pas été détectées au 15e jour, ce qui suggère une appauvrissement du TME par le système immunitaire de l’hôte (Figure 3C). 

Enfin, nous avons cherché à caractériser les changements précoces du TME à la suite de la reprogrammation in vivo de cDC1 dans les 9 premiers jours. Nous avons effectué une coloration par immunofluorescence de tissus tumoraux cryoconservés et sectionnés de tumeurs eGFP et PIB-eGFP après 3 et 9 jours de reprogrammation in vivo , en nous concentrant sur l’infiltration des cellules immunitaires marquées par le marqueur pan-hématopoïétique CD45. Notamment, les cellules de type cDC1 ont recruté significativement plus de cellules CD45 dans le TME facilement au jour 3, par rapport aux tumeurs eGFP (49,6 ± 17,0 vs 8,0 ± 5,8 eGFP intensité moyenne de fluorescence de la coloration CD45 par zone tumorale ; Figures 4A, B). Il est intéressant de noter que nous avons détecté TLS dans le TME des tumeurs après 9 jours de reprogrammation in vivo . Cela suggère que les cellules de type cDC1 peuvent rapidement remodeler le TME d’un environnement « immunitaire-froid » à un environnement « immunitaire-chaud » en 3 jours, ce qui conduit ensuite à la formation de TLS le 9e jour.

figure-results-1
Figure 1 : Présentation du protocole pour générer des cellules de type cDC1 par reprogrammation in vivo de cellules cancéreuses. Les vecteurs lentiviraux SFFV-PIB-IRES-eGFP codant pour PU.1, IRF8 et BATF3 dans une cassette polycistronique sous le contrôle du promoteur du virus formant le foyer de la rate (SFFV) et de l’eGFP après un site d’entrée interne du ribosome (IRES) pour suivre les cellules transduites par cytométrie en flux et microscopie à fluorescence - sont produits dans la lignée cellulaire d’emballage HEK 293T. Ensuite, les vecteurs lentiviraux sont ultracentrifugés et titrés fonctionnellement pour déterminer la quantité de virus nécessaire à la transduction des cellules cancéreuses dans un rapport de 1:1 entre les cellules eGFP+ transduites et les cellules eGFP- non transduites. Pour les expériences de reprogrammation in vivo, les cellules cancéreuses reçoivent la quantité optimale de lentivirus au jour -1. Le lendemain, ce mélange 1:1 de cellules GFP+ transduites et de cellules GFP- non transduites est lavé et collecté pour l’établissement de tumeurs sous-cutanées chez la souris. Des cultures in vitro parallèles sont maintenues pour valider la transduction au jour 3 par cytométrie en flux. Les animaux sont surveillés tous les 2-3 jours pour la croissance tumorale et la survie. Les tumeurs sont collectées à des moments définis, dissociées et colorées pour l’expression de marqueurs de surface pour l’analyse par cytométrie en flux. Alternativement, des tissus entiers sont fixés, cryoconservés et sectionnés pour la coloration par immunofluorescence et l’analyse par microscopie confocale. L’efficacité de la reprogrammation in vivo est évaluée par analyse par cytométrie en flux, tandis que les modifications du microenvironnement tumoral sont caractérisées par l’imagerie confocale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Production et titrage fonctionnel de lentivirus pour la reprogrammation in vivo de cDC1. (A) Lorsque les cellules HEK 293T atteignent une confluence de ~70-80 %, elles sont transfectées avec un mélange contenant 10 μg de plasmide de transfert SFFV-PIB-eGFP (PIB-eGFP) ou un contrôle de vecteur lentiviral vide SFFV-eGFP (eGFP), ainsi que 7,5 μg de psPAX2, 2,5 μg de mPD2.G et 60 μL de 1 mg/mL d’EPI. Images de microscopie à fond clair et à fluorescence des cellules HEK 293T montrant l’expression de l’eGFP 24 h après la transfection, indiquant une administration réussie du plasmide. Barres d’échelle = 200 μm. (B) Représentation schématique du flux de travail d’ultracentrifugation pour concentrer le lentivirus. Le surnageant contenant du lentivirus des cellules HEK 293T est prélevé 48 h et 60 h après la transfection, filtré à travers un filtre PES à faible liaison protéique de 0,45 μm, et 37 g sont pesés dans des tubes en polypropylène à paroi mince ouverts à l’aide d’une balance de laboratoire. Les tubes sont ultracentrifugés dans un rotor à godets oscillants, le surnageant est aspiré et les granulés sont séchés pendant 5 min. Les granulés sont ensuite remis en suspension dans du DMEM glacé contenant HEPES et incubés pendant la nuit avant d’être aliquotés et stockés à -80 °C. (C) Stratégie expérimentale du titrage fonctionnel pour déterminer la dose virale optimale permettant d’obtenir un rapport de 1:1 entre les cellules GFP+ et GFP-. Images de microscopie à fond clair et à fluorescence montrant l’expression de l’eGFP dans les cellules de mélanome YUMM1.7, 72 h après la transduction, indiquant une administration réussie des facteurs de reprogrammation et de l’eGFP. Barres d’échelle = 100 μm. (D) Graphiques de cytométrie en flux représentatifs montrant la stratégie de contrôle pour quantifier le rapport des cellules eGFP+. Les cellules vivantes ont été contrôlées pour la viabilité de la population négative aux colorants (DAPI), suivie de l’exclusion des doublets. (E) Quantification par cytométrie en flux de l’efficacité de la transduction avec des doses virales croissantes afin de déterminer le volume optimal pour obtenir des cellules GFP+/GFP- 1:1. Pour les lentivirus PIB-eGFP et eGFP, un volume de 2 μL par 10à 5 cellules a atteint le rapport souhaité. Abréviations : cDC1s = cellules dendritiques conventionnelles de type 1 ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; PIB = PU.1, IRF8 et BATF3 ; PEI = polyéthylénimine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Évaluation de l’efficacité de reprogrammation in vivo de cDC1. (A) Représentation schématique du flux de travail expérimental pour évaluer l’efficacité de reprogrammation in vivo de cDC1. Les cellules cancéreuses sont d’abord transduites avec un lentivirus exprimant mCherry pour générer une lignée cellulaire marquée par fluorescence (YUMM1.7-mCherry), suivie d’une transduction avec la dose optimisée de lentivirus PIB-eGFP le jour -1. Les cellules sont ensuite injectées par voie sous-cutanée avec un rapport de 1:1 de cellules eGFP+/eGFP- le jour 0 pour établir des tumeurs chez les souris CD45.1 et permettre aux cellules transduites par PIB de se reprogrammer en cellules de type cDC1 au sein du TME. Les tumeurs sont ensuite isolées à des moments indiqués, dissociées et colorées pour CD45.1, CD45.2 et CMH-II à l’aide de la cytométrie en flux. Cela permet d’exclure les cellules immunitaires de l’hôte CD45.1 pour quantifier l’efficacité de reprogrammation in vivo de cDC1 par l’expression de CD45.2 et du CMH-II. Des cultures in vitro parallèles sont conservées tout au long des points temporels à titre de comparaison avec la reprogrammation in vivo. (B) Graphiques représentatifs de cytométrie en flux illustrant la stratégie de déclenchement au jour 9. Les cellules ont été contrôlées sur mCherry+ et GFP+ pour identifier les cellules cancéreuses transduites avec succès. Les cellules immunitaires de l’hôte ont été exclues en excluant les cellules CD45.1+. (C) Quantification de l’efficacité de reprogrammation in vivo (à gauche) des cellules YUMM1.7-mCherry par cytométrie en flux en pourcentage de cellules CD45+ MHC-II+ (complètement reprogrammées) et de cellules CD45.2+ HLA-DR- ou CD45.2- HLA-DR+ cDC1-like (partiellement reprogrammées) contrôlées au sein d’eGFP+ mCherry+ Cellules. Graphiques représentatifs de cytométrie en flux (à droite) montrant l’acquisition progressive de l’expression de CD45.2 et du CMH-II dans les cellules YUMM1.7-mCherry transduites par PIB-eGFP aux points de temps indiqués. Des cellules YUMM1.7-mCherry transduites par eGFP ont été utilisées comme contrôle et des cellules de type cDC1 reprogrammées in vitro ont été utilisées à des fins de comparaison. Les données en (C) indiquent la moyenne ± ET de 3 à 5 expériences de réplication biologique. L’analyse statistique en (C) a été effectuée pour les cellules CD45+ du CMH-II+ à l’aide du test de Mann-Whitney. *P < 0,05. Abréviations : cDC1s = cellules dendritiques conventionnelles de type 1 ; PIB = PU.1, IRF8 et BATF3 ; TME = microenvironnement tumoral. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Analyse de l’infiltration immunitaire dans le microenvironnement tumoral suite à la reprogrammation in vivo de cDC1. (A) Des images confocales représentatives montrant des cellules CD45+ dans les tumeurs YUMM1.7 après implantation sous-cutanée de cellules PIB-eGFP- ou de cellules témoins transduites eGFP (rapport 1:1 entre les cellules transduites et les cellules parentales) aux jours 3 et 9. Barres d’échelle = 500 μm. (B) Quantification de l’IMF pour la coloration CD45 dans les tumeurs YUMM1.7 traitées par PIB et témoins transduites par eGFP aux jours 3 et 9. Les données de la partie (B) indiquent l’écart-type moyen ± de 3 à 6 expériences de répétitions biologiques. L’analyse statistique en (B) a été effectuée à l’aide du test de Mann-Whitney. *P < 0,05 et ***P < 0,001. Abréviations : cDC1s = cellules dendritiques conventionnelles de type 1 ; PIB = PU.1, IRF8 et BATF3 ; MFI = intensité moyenne de fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode traitable pour générer des cellules de type cDC1 basée sur la reprogrammation in vivo de cellules cancéreuses à partir de tumeurs solides. Nos résultats démontrent que la surexpression de PU.1, IRF8 et BATF3 entraîne l’acquisition progressive d’un phénotype cDC1 dans le TME jusqu’au jour 9, après quoi les cellules de type cDC1 sont épuisées des tumeurs. En fin de compte, cela conduit à une augmentation de l’infiltration des cellules CD45 dans le TME au jour 3, provoquant le remodelage d’un TME « immunitaire-froid » à devenir « immuno-chaud ».

Les protocoles actuels pour générer cDC1 comprennent l’enrichissement des CD autologues à partir du sang périphérique, la différenciation à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques CD34+ ou la différenciation à partir de cellules souches pluripotentes 14,15,16,17,18,19. Cependant, ces méthodes présentent des facteurs limitants : maturation insuffisante, présentation réduite de l’antigène et capacité de production de cytokines/chimiokines in vivo, sensibilité à l’immunosuppression, hétérogénéité élevée des DC et faible nombre de cellules générées7. Ici, nous fournissons un protocole qui permet la génération évolutive de cellules de type cDC1 in vivo pour des études fonctionnelles et mécanistes.

Avec cette méthode, nous avons testé si l’expression de la combinaison de facteurs de transcription PU.1, IRF8 et BATF3 était suffisante pour entraîner une reprogrammation in vivo . Ce protocole permet un contrôle précis de l’efficacité de l’administration, car la variation de la dose de cellules génétiquement modifiées implantées influence directement l’efficacité du traitement. Nous avons précédemment montré que 2 % de cellules transduites, ce qui correspond à 0,15 % de cellules CD45+ et de type CMH-II+ cDC1, sont suffisantes pour provoquer une immunité antitumorale20. De plus, l’infiltration immunitaire rapide observée au jour 3 suggère que les cellules de type cDC1 partiellement reprogrammées sont fonctionnellement actives in vivo, car il n’y a pas d’augmentation substantielle des cellules de type cDC1 entièrement reprogrammées à ce stade. À l’avenir, il sera intéressant de démêler le rôle fonctionnel des cellules de type cDC1 partiellement reprogrammées par rapport aux cellules entièrement reprogrammées dans l’efficacité antitumorale en utilisant des vecteurs modifiés contenant un gène suicide pour induire la mort cellulaire dans des populations cellulaires sélectionnées à des points temporels définis24. Ce protocole peut ensuite être utilisé pour explorer la combinaison avec des adjuvants épigénétiques, ce qui peut augmenter l’efficacité de la reprogrammation25. Enfin, cette méthode pourrait également être adaptée pour générer d’autres sous-types de DC in vivo, en lançant différents types de réponses immunitaires, par exemple, des réponses antivirales ou tolérogènes14. De plus, nous pouvons exploiter la reprogrammation in vivo comme plate-forme pour effectuer des criblages à code-barres pour les combinaisons de facteurs de transcription afin de générer divers types de cellules immunitaires. Cette possibilité pourrait augmenter la flexibilité des traitements en exploitant diverses propriétés fonctionnelles de sous-ensembles immunitaires spécifiques.

Dans notre étude précédente, nous avons démontré que l’environnement immunosuppresseur in vivo n’entrave pas la reprogrammation des cellules cancéreuses humaines en cDC1s20 immunogènes. Dans cet article, nous montrons que chez la souris, la reprogrammation est plus rapide et plus efficace in vivo qu’in vitro, ce qui suggère que la reprogrammation accrue observée in vivo est un phénomène conservé chez les deux espèces. Cependant, l’une des limites de cette méthode est l’absence d’environnement in vivo lors de l’administration initiale du vecteur ; Ainsi, il ne peut pas discerner si les indices environnementaux ont un impact sur l’efficacité de l’administration in vivo. Cela devrait être déterminé in situ en comparant différentes fractions. Les vecteurs adénoviraux, que nous avons identifiés comme étant plus efficaces que les vecteurs lentiviraux pour l’administration in situ 20 , pourraient être comparés à des fractions non virales telles que des ARN linéaires, circulaires et auto-amplifiés ou des cocktails de petites molécules2 6,27.

Nous avons précédemment montré que la reprogrammation de cDC1 dote les cellules cancéreuses de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et de chimiokines de recrutement de lymphocytes, ainsi que du traitement et de la présentation professionnels de l’antigène sur le CMH-I et le CMH-II dans les modèles de mélanome23,28. Cela se traduit par un remodelage du TME d’un état « immunitaire-froid » à un état « immunitaire-chaud » en induisant la formation de TLS, ce qui augmente l’infiltration des lymphocytes T effecteurs cytotoxiques, des lymphocytes NK et des lymphocytes B, et réduit les populations immunosuppressives telles que les lymphocytes T régulateurs et épuisés20. Chez les patients, les réponses positives à l’immunothérapie ont été associées à la présence de TLS dans les tumeurs, où l’amorçage soutenu des lymphocytes T et B contre les antigènes tumoraux génère des réponses anticorps spécifiques à la tumeur29,30. À l’avenir, nous envisageons d’utiliser ce protocole de reprogrammation cDC1 in vivo pour démêler les mécanismes de néogenèse induite par TLS, de remodelage des TME et d’immunité antitumorale dans différents types de cancer et caractériser si la production d’anticorps spécifiques à la tumeur est stimulée.

Nous avons précédemment observé une synergie entre la reprogrammation in vivo de cDC1 et l’ICB avec l’anti--1 ou l’anti-CTLA-420. Cela suggère que le TME « immuno-chaud » créé par la reprogrammation de cDC1 pourrait fournir un environnement favorable à d’éventuelles combinaisons avec d’autres immunothérapies telles que l’ACT, y compris les lymphocytes T à récepteur des lymphocytes T (TCR), les lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) ou les lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL). Un autre avantage de cette méthode est la possibilité d’effectuer de grands criblages combinatoires ou CRISPR non biaisés, dans lesquels les récepteurs immunologiques, les cytokines, les chimiokines ou les lymphotoxines pourraient être surexprimés ou appauvris dans les cellules de type cDC1 dans les types de tumeurs résistantes, démêlant ainsi le rôle de voies distinctes dans l’amélioration de l’immunité médiée par cDC1. En conclusion, le protocole actuel constitue une ressource précieuse pour une large communauté scientifique, car la reprogrammation in vivo de cDC1 est une plate-forme flexible et puissante pour les études mécanistes et l’innovation thérapeutique en immunothérapie du cancer.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.-F.P. détient une participation au capital et occupe des postes de direction chez Asgard Therapeutics AB, qui développe des immunothérapies anticancéreuses basées sur des technologies de reprogrammation de DC in vivo. C.-F.P est l’inventeur des brevets US 11,345,891, JP 7303743 et CN ZL201880005047.3 et des demandes de brevet WO 2018/185709 et WO 2022/243448 (conjointement avec E.A.) détenues par Asgard Therapeutics, qui couvrent l’approche de reprogrammation cellulaire décrite ici.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Mariana Lopes et Camille Chatelain, membres du Laboratoire de reprogrammation cellulaire en hématopoïèse et immunité, pour l’édition et la relecture du manuscrit.

Cette étude a été réalisée dans le cadre de l’École nationale de recherche ATMP financée par le Conseil suédois de la recherche. Les projets dont il est question ici ont été cofinancés par le Conseil européen de la recherche dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (866448-TrojanDC et 101189370), Novo Nordisk Fonden (NNF22C0079466), Conseil européen de l’innovation (101130218-RESYNC), Cancerfonden (23 2932 Pj), le Conseil suédois de la recherche (2020-00615), l’Agence suédoise pour l’innovation (2024-02178), ALF (44410), FCT (2022.02338.PTDC) et Plano de Recuperação e Resiliência de Portugal pelo fundo NextGenerationEU (C644865576-00000005). La Fondation Knut et Alice Wallenberg, la Faculté de médecine de l’Université de Lund et la Région Skåne sont récompensées pour leur généreux soutien financier.

Disponibilité des matériaux :

Les constructions et les vecteurs utilisés pour la reprogrammation sont disponibles auprès d’Asgard Therapeutics dans le cadre d’un accord de transfert de matériel avec la société. Toutes les autres données nécessaires à l’évaluation des conclusions de l’article sont présentes dans le texte principal ou dans les documents supplémentaires.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,45 &mu ; Filtre à faible teneur en protéines, filtre à vide de 150 mlFisher scientifique15983297
2-Mercaptoéthanol 50 mMThermoFisher Scientific31350010
Anticorps monoclonal CD45 anti-souris (clone : 30-F11), IgG2b de rat, &kappa ;ThermoFisher Scientific14-0451-82
N° B6. SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl (CD45.1)Le Laboratoire Jackson002014
Seringues à insuline BD Micro-Fine U-100 (0,5 ml)Fisher Scientific11395751
Souris C57BL/6JLe Laboratoire Jackson000664
Collagénase DSigma Aldrich11088882001
Passoire à cellules Corning Falcon pour une utilisation avec des tubes coniques de 50 mlSigma AldrichCLS352340
Verres de protection Corning 24 x 50 mm  ;Sigma AldrichCLS2975245
DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate)ThermoFisher ScientificD1306
DNase ISigma Aldrich10104159001
Colorant de viabilité fixable eBioscience eFluor 450Invitrogen65-0863-14
Solution de récupération d’antigène IHC eBioscience - pH faible (10x)ThermoFisher Scientific00-4955-58
Sérum fœtal bovin (FBS)ThermoFisher ScientificA5256701
Support de montage Fluoromount-GThermoFisher Scientific00-4958-02
Anticorps GFP [Alexa Fluor 594]Novus BiologicalsNB600-308AF594
Mélange Gibco DMEM/Nutriments F-12 (DMEM/F-12)ThermoFisher Scientific31331028
Gibco MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)ThermoFisher Scientific11140035
Gibco Opti-MEM IThermoFisher Scientific11058021
Gibco Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MoyenThermoFisher Scientific52400025
Pyruvate de sodium Gibco (100 mM)ThermoFisher Scientific11360070
Gibco Trypan Blue Solution, 0,4 %ThermoFisher Scientific15250061
Supplément GlutaMAXThermoFisher Scientific35050061
Anticorps secondaire anti-rat IgG (H+L) de chèvre adsorbé croisé, polyclonal, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11006
Cellules HEK 293TCIFACRL-11268
Bromure d’hexadiméthrine (Polybrene)Sigma AldrichN° H9268
HyClone Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) avec une teneur élevée en glucoseCytivaSH30243.01
HyClone Pénicilline Streptomycine 100x Solution (Pen/Streptocoque)CytivaSV30010
Solution saline tamponnée au phosphate HyClone (PBS)CytivaSH30028.02
Ketaminol vet. Solution injectable 100 mg/mLMSD Santé animale SuèdeQN01AX03
Lame Microtome - C35PFM médical207500005
Anti-CD45.2 pour souris (104), Surface, APC, MonoclonalBiolégende109814
Anti-MHCII de souris (M5/114.15.2), Surface, PE-Cy7, MonoclonalBiolégende107630
Sérum de chèvre normalAbcamAB7481
Sérum de rat normal (stérile)AbcamAB7488
Tubes en polypropylène à paroi mince à toit ouvertBeckman Coulter Sciences de la vie326823
Paraformaldéhyde, 16 % p/v aq. soln., sans méthanolThermoFisher Scientific043368.9M
pFUW-tetO-Batf3, une souris monocistronique codant pour cassette Batf3Addgene139837
pFUW-tetO-Irf8, une souris monocistronique codant une cassette Irf8Addgene139838
pFUW-tetO-Pu.1, une souris monocistronique codant une cassette Pu.1Addgene139839
Plasmide pMD2.GAddgene12259
Plasmide psPAX2Addgene12260
Plasmide SFFV-eGFP (eGFP)Clonage en interne-
Plasmide SFFV-mCherry (mCherry)Clonage en interne-
Plasmide SFFV-PIB-eGFP,  ; une cassette polycistronique codant une souris PU.1, IRF8 et BATF3 (PIB)  ;Clonage en interne-Les constructions et les vecteurs utilisés pour la reprogrammation sont disponibles auprès d’Asgard Therapeutics dans le cadre d’un accord de transfert de matériel avec la société
Polyéthylénimine (PEI), linéaire, MW 25000, qualité transfectionPolysciences23966
ReadyProbes Stylo Pap barrière hydrophobeThermoFisher ScientificR3777
Sodium ButyrateSigma Aldrich303410
SaccharoseSigma-AldrichS7903
Lames de microscope à adhérence SuperFrost PlusEprediaJ1800AMNZ
Composé Tissue-Tek O.C.T.Sakura Finetek4583
TrypLE Express Enzyme (1x) sans rouge de phénolThermoFisher Scientific12604021
TT Cryomold Intermédiaire, carré (15 x 15 x 5 mm)Sakura Finetek4566
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575020
Xysol vet. Solution injectable 20 mg/mLVM PharmaQN05CM92
MIAMM1.7 cellulesAntineo

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Oliveira, G., Wu, C. J. Dynamics and specificities of T cells in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 23 (5), 295-316 (2023).
  2. Larkin, J., et al. Five-year survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med. 381 (16), 1535-1546 (2019).
  3. Adams, S., et al. Pembrolizumab monotherapy for previously untreated, PD-L1-positive, metastatic triple-negative breast cancer: cohort B of the phase II KEYNOTE-086 study. Ann Oncol. 30 (3), 405-411 (2019).
  4. Patel, M. R., Falchook, G. S., Hamada, K., Makris, L., Bendell, J. C. A phase 2 trial of trifluridine/tipiracil plus nivolumab in patients with heavily pretreated microsatellite-stable metastatic colorectal cancer. Cancer Med. 10 (4), 1183-1190 (2021).
  5. Reardon, D. A., et al. Randomized phase 3 study evaluating the efficacy and safety of nivolumab vs bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: CheckMate 143. Neuro Oncol. 19 (suppl_3), iii21-iii21 (2017).
  6. Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy. Cell. 168 (4), 707-723 (2017).
  7. Heras-Murillo, I., Adán-Barrientos, I., Galán, M., Wculek, S. K., Sancho, D. Dendritic cells as orchestrators of anticancer immunity and immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 21 (4), 257-277 (2024).
  8. Heras-Murillo, I., et al. Immunotherapy with conventional type-1 dendritic cells induces immune memory and limits tumor relapse. Nat Commun. 16 (1), 3369(2025).
  9. Theisen, D. J., et al. WDFY4 is required for cross-presentation in response to viral and tumor antigens. Science. 362 (6415), 694-699 (2018).
  10. Meiser, P., et al. A distinct stimulatory cDC1 subpopulation amplifies CD8+ T cell responses in tumors for protective anti-cancer immunity. Cancer Cell. 41 (8), 1498-1515.e10 (2023).
  11. Spranger, S., Dai, D., Horton, B., Gajewski, T. F. Tumor-residing Batf3 dendritic cells are required for effector T cell trafficking and adoptive T cell therapy. Cancer Cell. 31 (5), 711-723.e4 (2017).
  12. Hubert, M., et al. IFN-III is selectively produced by cDC1 and predicts good clinical outcome in breast cancer. Sci Immunol. 5 (46), eaav3942(2020).
  13. Mahadevan, K. K., et al. Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer. Science. 384 (6703), eadh4567(2024).
  14. Ascic, E., Pereira, C. -F. Transcription factor-mediated reprogramming to antigen-presenting cells. Curr Opin Genet Dev. 90, 102300(2025).
  15. Silk, K. M., et al. Cross-presentation of tumour antigens by human induced pluripotent stem cell-derived CD141+ XCR1+ dendritic cells. Gene Ther. 19 (10), 1035-1040 (2012).
  16. Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. Isolation and generation of human dendritic cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 7, 7.32.1-7.32.23 (2012).
  17. Makino, K., et al. Generation of cDC-like cells from human induced pluripotent stem cells via Notch signaling. J Immunother Cancer. 10 (1), e003827(2022).
  18. Balan, S., et al. Large-scale human dendritic cell differentiation revealing Notch-dependent lineage bifurcation and heterogeneity. Cell Rep. 24 (7), 1902-1915.e6 (2018).
  19. Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Rep. 23 (12), 3658-3672.e6 (2018).
  20. Ascic, E., et al. In vivo dendritic cell reprogramming for cancer immunotherapy. Science. 386 (6719), eadn9083(2024).
  21. Rosa, F. F., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into antigen-presenting dendritic cells. Sci Immunol. 3 (30), 1-16 (2018).
  22. Rosa, F. F., et al. Single-cell transcriptional profiling informs efficient reprogramming of human somatic cells to cross-presenting dendritic cells. Sci Immunol. 7 (69), eabg5539(2022).
  23. Zimmermannova, O., et al. Restoring tumor immunogenicity with dendritic cell reprogramming. Sci Immunol. 8 (85), eadd4817(2023).
  24. Bouquet, L., et al. RapaCaspase-9-based suicide gene applied to the safety of IL-1RAP CAR-T cells. Gene Ther. 30 (9), 706-713 (2023).
  25. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2. Nat Biotechnol. 26 (11), 1269-1275 (2008).
  26. Rojas, L. A., et al. Personalized RNA neoantigen vaccines stimulate T cells in pancreatic cancer. Nature. 618 (7963), 144-150 (2023).
  27. Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
  28. Ferreira, A. G., Zimmermannova, O., Kurochkin, I., Ascic, E., Åkerström, F., Pereira, C. F. Reprogramming cancer cells to antigen-presenting cells. Bio Protoc. 13 (22), 1-25 (2023).
  29. Cabrita, R., et al. Tertiary lymphoid structures improve immunotherapy and survival in melanoma. Nature. 577 (7791), 561-565 (2020).
  30. Ng, K. W., et al. Antibodies against endogenous retroviruses promote lung cancer immunotherapy. Nature. 616 (7957), 563-573 (2023).

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Reprogrammation des cellules tumoralescellules de type cDC1immunoth rapie du cancermicroenvironnement tumorallymphocytes T cytotoxiquespr sentation de l antig netransduction lentiviralestructures lympho des tertiairesmarqueur CD45

Articles connexes