Flux de travail de caractérisation des neuropeptides, de l’échantillonnage à l’acquisition indépendante des données Spectrométrie de masse

Summary

Ce protocole décrit un flux de travail complet de neuropeptidomique dans le tissu cérébral du rat qui combine la spectrométrie de masse DDA-PASEF (DDA-PASEF) et la spectrométrie de masse à acquisition indépendante des données (DIA).

Abstract

Les neuropeptides endogènes sont des modulateurs clés de la fonction cérébrale, jouant un rôle essentiel dans le comportement, le stress, la douleur et la régulation homéostatique, mais leur analyse reste difficile. Biologiquement, ils sont peu abondants, se dégradent rapidement et sont traités de manière variable à partir de protéines précurseurs, avec une expression limitée à de petites populations cellulaires localisées. Techniquement, leur détection est compliquée par une large plage dynamique, diverses modifications post-traductionnelles et des signaux clairsemés dans les ensembles de données de spectrométrie de masse. Ce protocole décrit un flux de travail complet pour l’analyse des neuropeptides dans le tissu cérébral de Rattus norvegicus à l’aide de la spectrométrie de masse (MS) d’acquisition dépendante des données (DDA) et d’acquisition indépendante des données (DIA) sur une plateforme timsTOF. Après une préparation optimisée de l’échantillon de cerveau, y compris la dissection, l’extraction et le nettoyage des peptides, la nanochromatographie liquide (LC)-MS est réalisée avec fractionnement en phase gazeuse à mobilité ionique pour améliorer la sensibilité et la précision de la détection. La bibliothèque spectrale générée par DDA prend en charge la quantification basée sur DIA dans Skyline, ce qui permet des mesures de niveau MS2 à haut niveau de confiance. Ce flux de travail intégré augmente la couverture des neuropeptides et améliore la reproductibilité quantitative, fournissant une plate-forme robuste pour l’étude des neuropeptides dans les tissus cérébraux complexes.

Introduction

Les neuropeptides sont une classe fonctionnellement diversifiée de molécules de signalisation endogènes qui servent de modulateurs essentiels de la communication neuronale, des fonctions nerveuses et des systèmes neuroendocriniens. Agissant comme des neuromodulateurs, des hormones ou des cotransmetteurs, ils influencent un large éventail de processus physiologiques, notamment la modulation de la douleur, la réponse au stress, la régulation circadienne et le contrôle de l’appétit. Contrairement aux neurotransmetteurs classiques, qui sont synthétisés sous forme de petites molécules, les neuropeptides sont codés dans de grandes protéines précurseurs qui sont synthétisées par traduction de l’ARNm. Les protéines précurseurs, ou prohormones, subissent ensuite un traitement protéolytique pour libérer les peptides actifs, qui sont emballés dans des vésicules à noyau dense (DCV). Lors de la stimulation, les neuropeptides sont libérés pour exercer des effets modulateurs, généralement plus lents et plus prolongés, par le biais d’interactions avec les récepteurs couplés aux protéines G. Leur importance dans le maintien de la fonction du système nerveux central et périphérique en a fait un domaine d’intérêt biologique et clinique intense 1,2,3,4,5.

Malgré leur pertinence, les neuropeptides restent difficiles à caractériser sur le plan analytique. Leurs structures très hétérogènes - allant de séquences courtes à étendues, portant souvent diverses modifications post-traductionnelles (PTM) telles que l’amidation, l’acétylation, la phosphorylation, l’isomérisation des acides aminés ou la troncature - conduisent à une variabilité des comportements d’ionisation et de fragmentation en spectrométrie de masse (MS⁾1,6,7,8 . De plus, ils sont généralement présents à de faibles concentrations par rapport aux composants de la matrice biologique, sont facilement dégradés et sont localisés de manière spatialement restreinte dans le tissu complexe du système nerveux. Ces caractéristiques compliquent à la fois l’identification et la quantification, en particulier lors de l’utilisation d’approches protéomiques traditionnelles qui reposent sur une digestion enzymatique prévisible et des propriétés peptidiques uniformes ^9,10,11.

Ici, nous présentons une stratégie complète pour l’identification et la quantification des peptides endogènes dans le cerveau de Rattus norvegicus, avec un accent particulier sur les neuropeptides. Le flux de travail commence par des procédures d’échantillonnage cérébral optimisées, suivies de séparations étendues par chromatographie liquide (LC), et se termine par une analyse MS à haute résolution utilisant l’accumulation parallèle par fragmentation en série (PASEF) sur une plateforme de spectrométrie de mobilité des ions piégés (TIMS) 12,13,14,15,16. En intégrant le fractionnement en phase gazeuse à mobilité ionique (IM-GPF) avant la sélection des précurseurs, l’approche PASEF D’ACQUISITION DÉPENDANTE DES DONNÉES (DDA-PASEF) permet une meilleure séparation des précurseurs et une meilleure détection des neuropeptides de faible abondance, dont beaucoup seraient autrement manqués dans les flux de travail DDA unidimensionnels¹⁷.

Bien que la DDA reste la stratégie la plus couramment utilisée dans l’identification des peptides en raison de ses spectres MS/MS de haute qualité, elle est intrinsèquement limitée par sa dépendance à la sélection des ions précurseurs en fonction de l’intensité, ce qui favorise les espèces de faible abondance 18,19,20. De plus, son échantillonnage semi-stochastique entraîne des valeurs manquantes dans toutes les répétitions, ce qui entrave la quantification reproductible. Pour surmonter ces limitations, nous avons construit une bibliothèque spectrale robuste à l’aide de nos données DDA-PASEF, qui peuvent ensuite être utilisées pour l’analyse d’acquisition indépendante des données (DIA). Contrairement à la DDA, la DIA échantillonne tous les ions précurseurs dans des fenêtres m/z définies, assurant un échantillonnage cohérent des peptides abondants et rares, et lorsqu’elle est combinée à la bibliothèque spectrale et à l’analyse ciblée dans Skyline, elle permet une quantification sensible et reproductible au niveau MS2 21,22,23,24.

Cette approche intégrative, qui englobe l’extraction de peptides cérébraux, la séparation chromatographique, l’acquisition de la MS améliorée par la mobilité ionique et la quantification hybride basée sur DDA/DIA, a été développée en tenant compte de la complexité des neuropeptides. Il maximise la couverture peptidique tout en minimisant la perte de données, ce qui résout les principales limitations d’une peptidomique DDA plus simple. En tant que tel, nous présentons une plate-forme flexible et puissante pour explorer le paysage des neuropeptides dans le cerveau des mammifères, qui peut être facilement adaptée à un large éventail de questions expérimentales et d’échantillons de tissus.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux de cette étude ont été menées conformément au protocole d’utilisation des animaux approuvé par l’Illinois Institutional Animal Care and Use Committee (23228), dans le strict respect des normes nationales et ARRIVE pour le traitement et les soins éthiques des animaux.

1. Dissection animale et isolement cérébral

1. Effectuez une perfusion saline froide immédiatement suivie d’une congélation instantanée des tissus afin de préserver l’intégrité des neuropeptides, de minimiser les artefacts de dégradation et d’améliorer la qualité des données pour l’analyse peptidomique en aval.
2. Euthanasier le rat en utilisant la méthode du CO₂ en suivant les directives de l’établissement en matière de soins aux animaux. Confirmer la mort par l’absence de battements cardiaques et le manque de réflexes.
3. Placez le rat en décubitus dorsal ; Faites une incision pour exposer la cavité thoracique.
4. Faites une petite incision dans le ventricule gauche du cœur.
5. Faites une petite incision dans l’oreillette droite pour permettre l’écoulement du sang et de la solution de perfusion.
6. Insérez une pointe de pipette en plastique coupée à la taille voulue fixée à une seringue de 60 mL remplie de 50 mL de solution physiologique glacée (p. ex. solution saline à 0,9 % ou mGBSS) dans le ventricule gauche.
7. Perfuser le corps de l’animal avec la solution. Décapitez le rat à l’aide de ciseaux tranchants ou d’une guillotine.
8. Retirez la peau et le crâne recouvrant le cerveau avec des rongeurs ou des ciseaux fins.
9. Soulevez délicatement le cerveau de la cavité crânienne, en coupant les nerfs crâniens au besoin.
10. Congelez immédiatement le cerveau sur de la glace sèche ou congelez-le dans de l’isopentane refroidi sur de la glace sèche.
11. Transférer dans des cryoflacons ou une feuille étiquetés, puis conserver à -80 °C.

2. Extraction de peptides à partir de tissu cérébral de rat

1. Pour des échantillons de cerveau entier, pesez rapidement chaque tissu congelé à l’aide d’une balance analytique. Homogénéiser le tissu à l’aide d’une solution de qualité LC-MS contenant 10 % d’acide acétique glacial et 1 % d’eau dans du méthanol, en utilisant un rapport solvant/tissu de 10:1 (v/p).
2. Incuber les échantillons homogénéisés sur de la glace pendant 20 min.
3. Centrifuger les échantillons à 16 000 × g pendant 20 min à 4 °C. Récupérez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille.
4. Remettre la pastille en suspension dans de l’eau de qualité LC-MS, en utilisant un rapport solvant/tissu de 10:1 (v/p), et répéter l’incubation sur de la glace pendant 20 min.
5. Centrifugez à nouveau dans les mêmes conditions (16 000 × g, 20 min, 4 °C) et prélevez le deuxième surnageant.
6. Combinez les deux surnageants et transférez 1/10 du volume total dans un nouveau tube pour le traitement en aval. Faites sécher cette aliquote à l’aide d’un concentrateur sous vide jusqu’à ce qu’elle soit complètement sèche. Conservez le reste de l’extrait à -80 °C pour une utilisation future.

3. Extraction en phase solide (SPE) à l’aide de colonnes de spin C18

REMARQUE : Tous les solvants doivent être de qualité LC-MS. Sauf indication contraire, les étapes de centrifugation sont effectuées à 1 500 × g à température ambiante à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse.

1. Préparation des réactifs
   1. Préparez la solution d’activation (A) : 50 % d’acétonitrile/50 % d’acide formique à 0,1 % dans de l’eau.
   2. Préparez la solution d’équilibrage et de lavage (B) : 0,1 % d’acide formique dans l’eau.
   3. Préparez la solution d’élution (C) : 50 % d’acétonitrile/50 % d’acide formique à 0,1 % dans de l’eau.
2. Préparation des échantillons
   1. Reconstituer l’extrait peptidique séché dans 200 μL de solution (B).
   2. Centrifuger l’échantillon à 16 000 × g pendant 10 min à 4 °C.
   3. Récupérez soigneusement le surnageant pour l’EPS.
3. Conditionnement et équilibrage des colonnes
   1. Ajouter 150 μL de solution (A) dans la colonne de centrifugation en C18.
   2. Centrifuger pendant 1 min à 1 500 × g.
   3. Répétez les étapes 3.3.1 et 3.3.2 deux fois pour garantir une activation complète.
   4. Ajouter 150 μL de solution (B).
   5. Centrifuger pendant 1 min.
   6. Répétez les étapes 3.3.4 et 3.3.5 deux fois.
4. Chargement et lavage des échantillons
   1. Chargez 200 μL de la solution d’échantillon préparée sur la colonne.
   2. Centrifuger pendant 1 min.
   3. Rechargez le flux sur la colonne trois fois pour maximiser la rétention peptidique.
   4. Ajouter 150 μL de solution (B).
   5. Centrifuger pendant 1 min.
   6. Répétez les étapes 3.4.4 et 3.4.5 trois fois pour éliminer les contaminants non retenus.
5. élution peptidique
   1. Ajouter 150 μL de solution d’élution (C) dans la colonne.
   2. Centrifuger pendant 1 min.
   3. Répétez les étapes d’élution 3.5.1 à 3.5.2 une fois de plus.
   4. Combinez les deux éluats et conservez-les sur de la glace ou procédez au séchage sous vide.

4. Analyse LC-MS/MS

1. Préparez la solution (A) : 0,1 % d’acide formique dans l’eau, solution ; (B) : Acide formique à 0,1 % dans de l’acétonitrile, solution ; (C) : Temps de rétention standard (iRT) de 25 fmol/μL d’acide formique à 0,1 % dans l’eau.
2. Remettre les échantillons en suspension dans une solution de 20 μL (C) avant l’injection de LC-MS.
   REMARQUE : Deux échantillons biologiques ont été analysés, et chacun a été injecté cinq fois pour les analyses DDA et DIA, ce qui a donné lieu à cinq répétitions techniques par méthode et par échantillon.
3. Effectuez la séparation peptidique à l’aide d’un système de chromatographie liquide à haute performance (HPLC), la phase mobile A étant constituée de solution (A) et la phase mobile B constituée de solution (B).
4. Chargez 1 μL d’échantillons sur une vingt-cinq colonnes analytiques C18 (150 μm × 250 mm, particules de 1,9 μm, taille des pores de 120 Å) et maintenez-les à 40 °C tout au long du cycle.
5. Effectuer la séparation LC à un débit de 600 nL/min en utilisant le profil de pente suivant : 0-5 min : 2-10 % B ; 5 à 85 min : 10 à 45 % B ; 85 à 87 min : 45 à 50 % B ; suivi d’un lavage et d’un rééquilibrage à haute teneur en matières organiques.
   REMARQUE : Le LC a été directement couplé à un timsTOF MS via une source d’ions.
6. Pour l’analyse DDA, utilisez la méthode d’application par défaut DDA PASEF-standard_1.1sec_cycletime sur timsTOF MS.
   1. En bref, faites fonctionner le spectromètre de masse en mode PASEF avec l’exclusion dynamique activée. Réglez chaque cycle pour qu’il se compose de 10 balayages PASEF MS/MS sur un cycle d’utilisation de 1,1 s.
   2. Réglez la plage de masse sur m/z 100-1700 et la plage de mobilité ionique de 0,60 à 1,60 V·s/cm², en utilisant un temps de rampe de 100,0 ms. Augmentez l’énergie de collision de 20,0 à 59,0 eV en fonction de la mobilité ionique.
7. Fractionnement en phase gazeuse à mobilité ionique (IM-GPF)
   1. Segmentez la plage de mobilité ionique de 0,6 à 1,6 V·s/cm² en trois fenêtres qui se chevauchent : 0,6-1,0, 0,9-1,3 et 1,2-1,6 V·s/cm².
   2. Pour ce faire, modifiez les valeurs de début et de fin de la mobilité dans le réglage TIMS : appuyez sur timsControl ou l’éditeur timsControl pour les valeurs de fenêtre correspondantes.
   3. Acquérez des données pour chaque fenêtre. Pour toutes les fenêtres d’acquisition de mobilité ionique, utilisez une accumulation constante et un temps de rampe de 100 ms.
   4. Acquérez les données en mode DDA-PASEF en utilisant les mêmes paramètres détaillés à l’étape 4.6.
8. Pour l’analyse DIA, utilisez une largeur de fenêtre d’isolation de 25 m/z sur la plage de masse de 400 à 1200 m/z. Utiliser les mêmes paramètres expérimentaux de mobilité ionique (IMEX) que ceux utilisés dans la méthode DDA.
   1. Les paramètres DIA supplémentaires incluent une rampe MS1 suivie de 16 rampes MS/MS par cycle, ce qui donne une durée de cycle totale de 1,8 s.
   2. Utilisez la méthode protéomique DIA-PASEF par défaut comme modèle pour le développement de la méthode DIA. Après avoir créé la méthode DIA, chargez-la dans l’onglet méthode de Hystar. Aucune activation du mode DIA n’est requise.
      REMARQUE : La méthode DIA sera automatiquement enregistrée une fois chargée avec succès.

5. Traitement des données

REMARQUE : Après l’acquisition des données, l’identification des peptides doit être effectuée à l’aide d’outils bioinformatiques tels que PEAKS Online, PEAKS Studio, MSFragger, Maxquant ou des plateformes similaires. Cette étude a utilisé Peaks Online, capable de travailler avec des données brutes au format .d.

1. Recherche dans la base de données
   1. Utilisez une base de données de référence appropriée pour les recherches de peptides, telle qu’une base de données de peptides de signalisation de rat, un protéome de rat ou un protéome humain, ou une base de données de peptides de signalisation basée sur la source de l’échantillon.
      REMARQUE : Ces bases de données peuvent être obtenues auprès de sources fiables telles que NCBI ou UniProt (https://www.uniprot.org/). Veuillez noter que seuls les protéines ou les peptides de la base de données seront identifiés. Les données du signal du rat ont été sélectionnées en filtrant le protéome du rat par l’annotation « Peptide du signal » dans UniProt. Dans les termes Uniprot, le filtrage par « peptide signal » signifie réduire le protéome aux protéines impliquées dans la sécrétion, la localisation membranaire ou le trafic compartimental. Cette base de données personnalisée contient 5630 protéines. Limiter la taille de la base de données de protéines de 50 000 à 5 000 offre plusieurs avantages. Tout d’abord, il améliore la confiance de l’identification en réduisant la probabilité de correspondances aléatoires entre les peptides et le spectre, augmentant ainsi la précision des attributions peptidiques. Deuxièmement, une base de données plus petite améliore l’efficacité des calculs, ce qui permet d’accélérer les temps de traitement et de réduire la demande de ressources informatiques. Troisièmement, une base de données plus concise peut conduire à un meilleur contrôle du taux de fausses découvertes (FDR), ce qui se traduit par des identifications de protéines plus fiables et statistiquement robustes. Cependant, la base de données doit être relativement volumineuse pour éviter une inflation artificielle des scores de confiance et une estimation inexacte du FDR.
   2. Configurez la recherche dans la base de données dans l’interface graphique du programme avec les paramètres recommandés suivants : Tolérance d’erreur de masse du précurseur : 10-25 ppm ; tolérance d’erreur de masse de fragment : 0,01-0,05 Da ; spécificité enzymatique : aucune (digestion non spécifique) ; Gamme de longueurs peptidiques : 4-45 acides aminés.
   3. Définissez l’ensemble des PTM à inclure dans la recherche.
   4. Une fois la recherche dans la base de données terminée, exportez les fichiers pepxml et mzXML (ou MGF) correspondant à chaque fenêtre de mobilité ionique, y compris la plage de mobilité complète standard (0,6-1,6 V·s/cm²).
2. Construction de la bibliothèque Skyline
   1. Ouvrez Skyline et créez un nouveau document, assurez-vous que l’interface Proteomics est sélectionnée et utilisez les paramètres par défaut , sauf indication contraire.
   2. Accédez à Fichier > Importer > Recherche de peptides.
   3. Dans l’Assistant Importer une recherche peptide , sélectionnez Générer et ajoutez les fichiers pepxml appropriés (assurez-vous que les fichiers mzXML ou MGF correspondants se trouvent dans le même répertoire).
   4. Définissez les peptides standard iRT sur Automatique, choisissez DIA comme flux de travail, puis cliquez sur Suivant.
   5. Après la construction de la bibliothèque, choisissez environ 10 à 15 peptides comme étalons iRT pour l’alignement entre les répétitions. Si vous êtes invité à recalibrer iRT, cliquez sur OK pour continuer.
   6. Sur la page Extraire les chromatogrammes , cliquez sur Parcourir pour sélectionner et importer tous les fichiers bruts DIA, puis cliquez sur Continuer.
   7. Dans la fenêtre Paramètres de transition , définissez la plage de frais de précurseur sur 1-5, la plage de frais de produit sur 1-3, les types d’ions sur ,p,y,b et définissez la sélection d’ions de produit de l’ion 2 au dernier ion. Autres paramètres recommandés : tolérance de correspondance ionique : 0,05 Da, pics à choisir : 5.
   8. Dans la fenêtre Paramètres peptides , définissez les modifications qui correspondent au paramètre de recherche Pics décrit dans la version 4.1.3.
   9. Sur la page Schéma d’isolation , entrez un nom pour l’isolement et le schéma, puis sélectionnez Fenêtres d’isolement prédéfinies. Cliquez sur importer et chargez l’un des fichiers DIA pour importer automatiquement la configuration de la fenêtre d’isolement de l’expérience.
   10. Définissez les paramètres d’acquisition de balayage complet à l’aide des paramètres suivants. Méthode d’acquisition : DIA ; Analyseur de masse de produit : Centroïdé ; Schéma d’isolation : Utilisez celui défini ci-dessus ; Précision de masse : 10-20 ppm ; Pouvoir de résolution de la mobilité : 30-50 ; Activez l’option Utiliser uniquement les balayages dans les 5 minutes suivant la RT prévue ; Si vous le souhaitez, modifiez le filtrage MS1 si l’importation de chromatogrammes MS1 est nécessaire. Sélectionnez un analyseur de masse et une résolution appropriés pour une extraction optimale du chromatogramme MS1.
   11. Importez FASTA et générez des leurres. Définir la méthode de génération de leurre : Séquence aléatoire.
   12. Sélectionner l’enzyme : la digestion n’est pas spécifique dans l’analyse des peptides endogènes. Modifiez l’enzyme en sélectionnant Ajouter dans le menu déroulant des enzymes. Définissez le nom de l’enzyme, tapez les deux, clivez c-terminal sur KR et clivez le N-terminal sur KR, autorisez le semi-clivage et cliquez sur OK. Réglez les décolletés manqués à 3.
   13. Importez le fichier FASTA cible, puis cliquez sur Terminer. Confirmez la page Protéines associées si vous y êtes invité.
   14. Assurez-vous que la bibliothèque spectrale a été créée avec succès et que les données DIA ont été importées. Inspectez manuellement la liste des peptides identifiés et procédez à l’analyse quantitative et qualitative en aval.
3. Mesures qualitatives et quantitatives
   REMARQUE : Les analyses qualitatives et quantitatives sont effectuées dans Skyline. Pour plus de détails sur l’analyse des données DIA dans Skyline, visitez https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorial_dia_swath.
   1. Si les données DDA sont chargées, sélectionnez Paramètres > Paramètre de transition dans le menu, choisissez DDA dans Méthode d’acquisition ; dans Paramètres > Réglage peptidique, choisissez le niveau MS 1 pour la quantification.
   2. Si les données DIA sont chargées, Paramètres > Paramètre de transition, choisissez DIA dans Méthode d’acquisition ; dans Paramètres > Réglage peptidique, choisissez le niveau MS 2 pour la quantification.
   3. Dans Afficher > grille de documents, sélectionnez Quantification des peptides, puis Exporter la feuille de calcul. Combinez les feuilles de calcul des résultats DDA et DIA résultats.
      REMARQUE : La feuille de calcul récapitule les zones de pic de tous les peptides de la bibliothèque pour tous les échantillons. Dans cette expérience, les zones de pics peptidiques ont été normalisées en fonction du peptide standard de temps de rétention GISNEGQNASIK, qui fait partie du mélange de temps de rétention Pierce. La normalisation a été effectuée en calculant le rapport entre l’aire du pic de chaque peptide et celle de l’étalon.

Results

Un schéma expérimental représentatif est illustré à la figure 1. L’analyse des données DDA-PASEF (Figure 2) acquises à l’aide de la gamme de mobilité ionique standard et de l’IM-GPF a révélé une couverture peptidique nettement plus élevée pour l’approche IM-GPF (Figure 2B). Notamment, la plupart des peptides identifiés à l’aide de la méthode standard DDA-PASEF chevauchaient ceux trouvés dans l’ensemble de données IM-GPF. Afin de maximiser la couverture d’identification des peptides, une bibliothèque spectrale complète a été générée en intégrant les identifications des deux approches.

Une analyse plus poussée des bases de données de répliques acquises via DDA- et DIA-PASEF (Figure 3), à l’aide d’une base de données de peptides de signalisation de rat, a révélé 217 protéines communes aux deux méthodes. De plus, 115 protéines ont été identifiées de manière unique par DIA-PASEF, tandis que 69 étaient exclusives à DDA-PASEF. Des analyses exploratoires utilisant des banques spectrales dérivées des données DDA et IM-GPF ont démontré que DIA-PASEF permettait de détecter avec certitude des neuropeptides tels que NPAFLFQPQRF (neuropeptide SF) et YGGFMRRVGRPEWWMDYQ (dérivé de la proenképhaline). Ces neuropeptides n’ont pas été détectés de manière fiable dans les ensembles de données DDA-PASEF correspondants en raison d’une mauvaise attribution des pics (figures 3B et C).

D’un point de vue quantitatif, le nuage de points de la figure 4A révèle une corrélation positive modérée entre l’intensité des précurseurs de DDA et l’intensité des ions des fragments DIA, comme prévu étant donné que les deux approches quantifient les mêmes peptides mais capturent des types d’ions différents. Les boîtes à moustaches pour les peptides sélectionnés illustrées à la figure 4B illustrent davantage la reproductibilité des mesures quantitatives obtenues par les deux approches. Les boîtes à moustaches montrent les zones de pic relatives pour chaque peptide mesuré par DIA et DDA, avec des barres d’erreur représentant la variabilité de mesure entre les répétitions techniques. Les peptides sélectionnés sont dérivés de prohormones opioïdes, notamment la proenképhaline (PENK) et la prodynorphine (PDYN), qui jouent toutes deux un rôle central dans la modulation de la douleur et l’analgésie.

Figure 1 : Vue d’ensemble du flux de travail de la peptidomique pour l’identification et la quantification des peptides endogènes à partir de tissu cérébral de rat. Le flux de travail comprend la dissection tissulaire, l’extraction et la purification de peptides, l’acquisition de données LC-ion mobility-MS (LC-IM-MS) par fractionnement en phase gazeuse (IM-GPF) et le traitement des données pour générer des bibliothèques spectrales et effectuer des analyses quantitatives. Des parties de la figurine ont été créées dans BioRender. Tan, Y. (2025) https://BioRender.com/vrejrsk. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Base de données sur l’identification des peptides et des protéines. (A) Diagramme à barres comparant le nombre total de précurseurs, de correspondances de spectre peptide (PSM) et de peptides uniques identifiés dans différentes fenêtres de mobilité ionique. (B) Graphique circulaire illustrant la proportion de peptides couramment identifiés dans toutes les fenêtres de mobilité et ceux détectés de manière unique dans les fenêtres individuelles. (C, D) Cartes thermiques illustrant la distribution des signaux ioniques sur les dimensions m/z et de mobilité ionique pour la plage de mobilité complète (0,6-1,6 V·s/cm²) (C) et la fenêtre de mobilité restreinte (0,6-1,0 V·s/cm²) (D). (E) Graphique inversé montrant le nombre de protéines identifiées dans les ensembles de données acquises à l’aide des méthodes DDA et DIA, mettant en évidence les identifications de protéines partagées et uniques. (F) Carte thermique représentant les peptides dérivés du précurseur de la proenképhaline identifiés dans les réplicats acquis par DIA (panneau supérieur) et les réplicats acquis par DDA (panneau inférieur). La leu-enképhaline n’a pas été détectée dans deux des quatre réplicats de DDA, ce qui indique des valeurs potentiellement manquantes dans l’acquisition basée sur le DDA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Analyse comparative et exploratoire des données DDA-PASEF et DIA-PASEF à l’aide de bibliothèques spectrales. (A) Alignement du temps de rétention des neuropeptides SF entre les répétitions DIA et DDA-PASEF. (B) EIC des ions de fragments PENK (212-229) à partir d’ensembles de données DIA (en haut) et DDA (en bas). (C) Chromatogrammes ioniques fragmentaires de neuropeptide SF à partir de réplicats DIA démontrant une coélution et une qualité spectrale élevées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Comparaison des mesures quantitatives entre DIA-PASEF (niveau MS2) et DDA-PASEF (niveau MS1). (A) Ce diagramme de dispersion compare les intensités de signal peptidique obtenues à l’aide des modes DIA et DDA. Plus précisément, l’axe des x représente l’aire du pic précurseur transformé en log₁₀ de DDA, tandis que l’axe des y montre l’aire du pic du fragment transformé en log₁₀ de DIA pour chaque peptide. (B) Les boîtes à moustaches représentent les aires de pic relatives de quatre peptides représentatifs, PENK 107-133, PENK 188-195, PDYN 221-233 et PDYN 235-248. Les barres d’erreur représentent la variabilité entre les réplicats techniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

En peptidomique, en particulier lors de l’analyse de peptides endogènes, la préservation du profil peptidique natif est essentielle pour l’intégrité des données et l’interprétation biologique. La perfusion saline froide élimine non seulement le sang, mais refroidit également le cerveau, ce qui réduit considérablement la dégradation protéolytique post-mortem qui se produit rapidement en raison de l’activité des protéases endogènes. En abaissant la température du cerveau, l’activité enzymatique est ralentie et les protéases circulantes sont évacuées du système vasculaire, tout en réduisant les changements métaboliques post-mortem^25,26. La perfusion avec une solution saline glacée élimine également le sang du système vasculaire du cerveau. Cette étape est particulièrement importante, car le sang contient des protéines riches en abondance (telles que l’albumine et les globulines) et des protéases circulantes qui peuvent interférer avec la détection des neuropeptides. La dégradation post-mortem de protéines sanguines abondantes peut augmenter la complexité des extraits de neuropeptides et masquer les signaux de faible abondance, compromettant finalement à la fois l’identification et la quantification 25,26,27. La congélation immédiate du tissu cérébral, soit sur de la glace sèche, soit par congélation instantanée dans de l’isopentane réfrigéré, interrompt les processus enzymatiques presque instantanément. Cette préservation est particulièrement importante pour détecter les neuropeptides matures de faible abondance et de pleine longueur et pour assurer une quantification fiable. Sans ces étapes, la dégradation des peptides peut entraîner une variabilité accrue et des artefacts qui compromettent à la fois l’identification et la quantification. Ainsi, l’ablation du sang, la perfusion froide et le refroidissement rapide du cerveau sont des techniques fondamentales qui ont un impact direct sur la qualité, la sensibilité et la reproductibilité des données peptidomiques avant les mesures.

L’analyse des peptides extraits du cerveau du rat a révélé la présence de deux panaches distincts de mobilité ionique (Figure 2C,D). Ce phénomène peut être attribué soit à différentes classes moléculaires, soit à des états de charge variables des peptides. Si les panaches correspondent à des classes moléculaires distinctes, les espèces non peptidiques coéluantes peuvent entrer en compétition avec les peptides pour la sélection et la fragmentation. De plus, si la séparation résulte de différences dans les états de charge, on s’attendrait à ce que le panache contenant des peptides fortement chargés produise des spectres MS/MS de meilleure qualité, ce qui faciliterait une identification plus fiable des peptides.

Pour étudier cela, nous avons mis en œuvre une stratégie de fractionnement de la mobilité ionique, en acquérant des données à travers trois fenêtres de mobilité discrètes : 0,6-1,0, 0,9-1,3 et 1,2-1,6 V·s/cm². Ces fenêtres couvrent collectivement toute la gamme de mobilité ionique généralement analysée dans les expériences standard DDA-PASEF pour les peptides. Comme l’illustre la figure 2, bien que le nombre total de précurseurs détectés ait été le plus élevé dans toute la plage de balayage (0,6-1,6 V·s/cm²), un nombre significativement plus élevé de correspondances du spectre peptide (PSM) a été observé dans la fenêtre de 0,6-1,0 V·s/cm² . Cette découverte suggère que la présence de deux panaches pourrait en effet être due à l’interférence d’autres molécules.

Le fractionnement des précurseurs basé sur la mobilité ionique a entraîné une augmentation de 30 % de la couverture peptidique par rapport à la méthode conventionnelle de balayage complet. Environ 82 % des peptides identifiés dans l’ensemble de données de balayage complet chevauchaient les peptides identifiés par fractionnement (figure 2B), ce qui souligne la cohérence et la robustesse de la stratégie de fractionnement. Sur la base de ces observations, nous avons utilisé les données de fractionnement de la mobilité ionique et de balayage complet pour construire des banques spectrales pour l’analyse quantitative des peptides neuroendocriniens à l’aide de DIA-PASEF.

L’analyse de bases de données d’ensembles de données répétées acquises via DDA et DIA a révélé un nombre plus élevé d’identifications de peptides et de protéines dans les données DIA, y compris 115 protéines identifiées de manière unique par DIA (Figure 2E). Il s’agissait notamment de neuropeptides tels que les peptides liés à la pro-FMRFamide FF et VF. En revanche, 69 protéines ont été identifiées exclusivement par DDA, dont beaucoup sont associées à l’adhésion cellulaire et au développement neuronal. Ces résultats suggèrent que les méthodologies DDA et DIA peuvent être appliquées de manière complémentaire pour obtenir une couverture peptidique plus large.

Une analyse plus poussée a démontré que l’acquisition de DIA résout efficacement une partie du problème de la valeur manquante fréquemment rencontré dans l’analyse des peptides endogènes à l’aide de la DDA. Par exemple, la leu-enképhaline n’a été détectée que dans deux des quatre réplicats de la DDA (figure 2F, panneau du bas), alors qu’elle a été systématiquement identifiée dans les quatre réplicats de la DIA (figure 3F, panneau du haut).

Skyline, une plate-forme largement utilisée pour la protéomique quantitative, a été utilisée pour analyser les ensembles de données DDA et DIA-PASEF²⁸. Le logiciel facilite l’identification des peptides grâce à l’appariement de la bibliothèque spectrale, à la co-élution ionique des fragments et à l’alignement du temps de rétention. Pour évaluer la capacité de DIA-PASEF à réduire les identifications manquantes, nous avons effectué une évaluation qualitative des peptides exclusivement détectés dans l’ensemble de données DIA.

Comme le montre la figure 3D, le neuropeptide SF a été détecté de manière cohérente dans toutes les réplicats DIA au cours de la même fenêtre de temps de rétention. La détection dans les réplicats de DDA a montré une variabilité considérable, avec des temps de rétention allant de 25 min à 45 min (figure 3A). Les incohérences observées, y compris les erreurs d’affectation des pics avec des scores de confiance faibles, étaient probablement dues à une couverture ionique de fragment limitée ou de faible qualité, comme le montre la figure 3B. En revanche, la figure 3C montre que les ions de fragment correspondant au neuropeptide SF étaient bien alignés sur toutes les réplicats de DIA, ce qui permet une identification automatisée fiable.

Une comparaison de la qualité spectrale MS/MS pour le peptide PENK (212-229), dérivé de la proenképhaline, a démontré les avantages de DIA-PASEF. Les spectres obtenus à partir de la DIA ont montré une intensité plus élevée et une meilleure qualité des ions de fragment par rapport à la DDA (Figure 3), ce qui est particulièrement bénéfique pour la détection des peptides endogènes de faible abondance.

L’analyse quantitative a confirmé que la technologie DIA-PASEF a permis d’obtenir des mesures cohérentes et reproductibles sur l’ensemble des répétitions biologiques, avec des performances comparables à celles de la DDA (figure 4). De plus, la DIA a permis la quantification au niveau MS2, offrant une spécificité au niveau des ions de fragment et une confiance accrue dans l’identification des peptides par rapport à la DDA basée sur MS1. Ces résultats soutiennent l’utilisation de DIA-PASEF en tant qu’approche fiable et efficace pour la quantification ciblée des neuropeptides dans des matrices biologiques complexes, en particulier lorsque l’exhaustivité et la reproductibilité des données sont essentielles.

Ce protocole décrit une stratégie globale d’analyse et de quantification des neuropeptides. L’approche IM-GPF facilite la construction de bibliothèques spectrales de haute qualité. Bien que le DIA-PASEF offre une reproductibilité améliorée et une couverture peptidique accrue par rapport au DDA-PASEF, il améliore également la quantification basée sur MS2. La combinaison des deux stratégies d’acquisition augmente la couverture globale des peptides, car chaque méthode contribue de manière unique à l’identification de peptides distincts (Figure 2E). La limite de ce protocole est la nécessité de disposer d’un échantillon suffisant pour prendre en charge à la fois la génération de bibliothèques spectrales et l’acquisition de données par les méthodes DDA et DIA-PASEF.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 % d’acide formique dans l’eau	Fisher Scientific  ;	LS118-500	de qualité LC/MS
;	Fisher Scientific  ;	A11350	Acétonitrile de qualité LC/MS
	Fisher Scientific  ;	AA47138K7	de qualité LC/MS
	Fisher Scientific  ;	PI28905	Méthanol de qualité LC/MS
	Fisher Scientific  ;	AA47192K7
nanoELute2	Bruker	N/A
Pierce C18 spin columns	Fisher Scientific  ;
Pierce Peptide Retention Time Calibration Mixture	Thermo Fisher	A11351	LC/MS grade SpeedVac
concentrateur sous vide	Genevac	https://scientificproducts.com/product_cat/benchtop-solvent-evaporators/	Le modèle spécifique utilisé dans cette étude n’est plus disponible auprès du fabricant. Un lien vers le modèle équivalent actuel est fourni pour la référence
timsTOF Pro2	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-pro-2.html
Water	Fisher Scientific  ;	AA47146M6	Grade LC/MS