Article de méthode

SCAnED - Une macro de segmentation cutanée open-source pour la détection semi-automatisée des cellules et des noyaux dans les compartiments cutanés épidermiques et dermiques

DOI :

10.3791/68746

⸱

8 août 2025

 ,  , 
1Department of Dermatology, Medical University of Vienna

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole semi-automatisé pour identifier et quantifier les cellules immunitaires et non immunitaires dans des coupes de peau à l’aide de SCAnED, une macro gratuite basée sur ImageJ pour la segmentation de la peau.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La distribution spatiale des cellules immunitaires et non immunitaires au sein des tissus et l’expression de marqueurs spécifiques aux cellules fournissent des informations essentielles sur le fonctionnement cellulaire in situ. La peau humaine est un organe très complexe avec des compartiments définis comprenant différentes cellules avec des phénotypes divers. En utilisant le marquage multi-fluorescence, des populations distinctes de cellules cutanées peuvent être déterminées et caractérisées plus en détail. Cependant, à l’heure actuelle, la disponibilité d’outils non commerciaux pour l’analyse d’images d’échantillons de peau qui permettent la segmentation in silico de cellules spécifiquement dans l’épiderme ou le derme à une résolution unicellulaire est limitée. Nous fournissons ici un protocole étape par étape pour la coloration par immunofluorescence de coupes de peau, la microscopie confocale et l’analyse d’images à l’aide de notre outil SCAnED (Skin Compartment Analysis of Epidermis and Dermis). La macro SCAnED permet l’identification et la classification précises des cellules et des noyaux dans les compartiments épidermiques et dermiques de la peau humaine. Nous fournissons des lignes directrices sur la façon de déterminer les niveaux d’intensité moyens d’expression du fabricant dans différentes cellules et compartiments cellulaires, tels que le cytoplasme et le noyau, et sur la façon de quantifier les cellules exprimant des quantités variables de ces marqueurs à l’aide d’un pipeline Python fourni sous la forme d’un cahier Jupyter prêt à l’emploi exécuté dans Google Colab. Ce protocole permettra aux utilisateurs inexpérimentés de déterminer les profils d’expression spécifiques aux cellules dans les tissus cutanés et de fournir des informations sur la distribution spatiale des cellules dans les compartiments épidermiques et dermiques, permettant ainsi une compréhension plus approfondie de la structure tissulaire complexe et de la composition cellulaire de la peau humaine.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La compréhension des tissus cutanés au niveau cellulaire et la distinction des phénotypes cellulaires, de la morphologie et de leur localisation dans les compartiments épidermiques et dermiques sont essentielles dans la recherche dermatologique et l’histopathologie 1,2. La composition cellulaire de l’épiderme, englobant les kératinocytes, les mélanocytes et les cellules de Langerhans dans des conditions saines, devient considérablement déséquilibrée dans les maladies inflammatoires de la peau et le cancer. De plus, le phénotype et la localisation des cellules dans le derme, situé sous l’épiderme et hébergeant les fibroblastes et la majorité des cellules immunitaires, peuvent changer considérablement au cours de la maladie. Par conséquent, la segmentation des cellules et des noyaux est impérative pour évaluer les attributs cellulaires tels que le nombre de cellules, l’expression des protéines, la morphologie et l’organisation spatiale, ainsi que les caractéristiques du noyau telles que la taille, la forme et l’expression des facteurs de transcription, aidant ainsi à la compréhension de l’homéostasie cutanée et des maladies 3,4,5.

Malgré la disponibilité de plates-formes d’analyse d’images à usage général telles que QuPath6, CellProfiler7 et ilastik8, ces outils nécessitent souvent une personnalisation et une scriptisation poussées pour s’adapter à la complexité structurelle et à la morphologie cellulaire hétérogène des tissus cutanés. Peu d’outils ont été spécifiquement adaptés à la segmentation automatisée des compartiments épidermiques et dermiques, et de nombreuses solutions disponibles sont commerciales et ne sont pas librement accessibles. Ces limites rendent difficile pour les non-experts de mettre en œuvre des pipelines efficaces pour l’analyse spécifique de la peau.

Nous présentons ici un protocole complet pour l’analyse des cellules et des noyaux dans les tissus cutanés et leurs compartiments, couvrant toutes les étapes vitales, de la coloration des tissus à l’analyse d’images, à l’aide de notre pipeline d’analyse d’images semi-automatisé. Nous commençons par des informations détaillées sur la coloration par immunofluorescence des tissus cutanés, y compris la coloration à l’E-cadhérine pour la segmentation de l’épiderme et du derme et au 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour la détection des cellules/noyaux. Deux marqueurs d’intérêt, le Vimentin (VIM) et le CD90, ont été inclus à des fins de validation. Nous recommandons d’utiliser des anticorps à des concentrations optimisées (voir tableau 1) et de capturer des images à l’aide de la microscopie confocale avec des paramètres cohérents pour l’intensité laser, le temps d’exposition et la résolution afin d’assurer la reproductibilité.

De plus, nous présentons notre macro ImageJ9 SCAnED conçu sur mesure, qui signifie Skin Compartment Analysis of Epidermis and Dermis, et nous fournissons toutes les étapes nécessaires à la segmentation in silico et à la détection des noyaux et des cellules dans l’épiderme et le derme. Les utilisateurs peuvent choisir entre deux méthodes de détection de noyaux différentes, soit à l’aide d’un seuillage simple et rapide, soit à l’aide de l’outil d’apprentissage profond StarDist10 et de notre modèle de peau entraîné, avant de passer au protocole SCAnED. Contrairement aux outils généraux, SCAnED a été développé spécifiquement pour l’histologie cutanée et les surpasse en permettant la compartimentation automatique des régions épidermiques et dermiques et la quantification intégrée de plusieurs marqueurs dans les deux régions. Ceci est particulièrement utile pour les chercheurs qui manquent d’expertise en programmation ou en apprentissage profond, offrant un outil prêt à l’emploi adapté à l’analyse d’images de peau.

Nous montrons en outre comment les niveaux d’intensité moyens sont extraits par cellule à partir d’images d’immunofluorescence d’un maximum de cinq marqueurs d’intérêt distincts. Enfin, nous fournissons un code Python pour l’analyse statistique des données unicellulaires obtenues écrites et exécutées dans Google Colab11 et partagées sous forme de notebook Jupyter. Notre protocole et la macro SCAnED visent à fournir aux chercheurs sur la peau sans expertise avancée en immunofluorescence et en informatique un outil pratique pour marquer et quantifier semi-automatiquement l’expression des cellules et des marqueurs dans la peau humaine, en se concentrant sur les compartiments épidermiques et dermiques.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Marquage par immunofluorescence de l’E-cadhérine, du VIM et du CD90 et coloration nucléaire avec DAPI dans des coupes de peau enrobées de paraffine

REMARQUE : Le protocole montre les étapes pour les sections enrobées de paraffine. Pour les échantillons de tissus frais et congelés, fixez les coupes de tissus et passez à l’étape 1.3 du protocole.

  1. Faites fondre la paraffine à l’aide d’un ventilateur ou d’un four.
  2. Réhydratez les sections en passant dans des alcools gradués à teneur en eau croissante (par exemple, le xylène → 100 % d’éthanol → 85 % d’éthanol → 70 % d’éthanol → l’eau).
  3. Effectuez les étapes de prélèvement de l’antigène appropriées pour les antigènes.
  4. Perméabiliser des coupes de tissu avec 0,3 % de Triton X dans du PBS (3 x 20 min) (voir tableau 2).
  5. Laver les lames avec du PBS (1 x 5 min).
  6. Encerclez chaque échantillon avec un marqueur à lames hydrophobe pour éviter les déversements de liquide et minimiser le volume de réactifs, puis laissez sécher.
  7. Appliquer des anticorps primaires (tampon pour Abs : PBS + 2 % BSA) (voir tableau 1 et tableau 2). Placez les lames dans une boîte de chambre humidifiée (boîte humide) et incubez pendant la nuit.
  8. Laver les lames avec 0,3 % de Triton X dans du PBS (3 x 5 min).
  9. Enlever l’excès de détergent en lavant les lames avec du PBS (1 x 5 min).
  10. Appliquez des anticorps secondaires et du sérum de chèvre (voir tableau 1). Incuber les lames dans un endroit sombre pendant 1 h.
  11. Laver les lames avec 0,3 % de Triton X dans du PBS (3 x 5 min).
  12. Enlever l’excès de détergent en lavant les lames avec du PBS (1 x 5 min).
  13. Ajouter du DAPI pour la coloration des noyaux (voir tableau 1). Incuber les lames dans un endroit sombre pendant 30 min.
  14. Laver les lames avec 0,3 % de Triton X dans du PBS (3 x 5 min).
  15. Laver les lames avec du PBS (1 x 5 min).
  16. Appliquez 1 gouttelette (~5-15 μL) de milieu de montage de fluorescence sur chaque échantillon et placez soigneusement les lamelles (retirez les bulles si nécessaire). Laissez les lames sécher dans l’obscurité.
Anticorps et colorantConcentration de travailDilution
anticorps anti-Vimentine0,8 μg/mL1:50
anticorps anti-E-cadhérine1 μg/mL1:333
anticorps anti-CD901:1000
AF488 anti-souris1:500
AF568 anti-lapin1:500
AF647 anti-souris1:500
DAPI1 μg/mL

Tableau 1 : Anticorps et colorant.

1. Tampon de coloration
RéactifConcentration finaleQuantité
BSA2%1 g
PBS1x50 ml
Totaln/a50 ml
2. Tampon de perméabilisation
RéactifConcentration finaleQuantité
Triton X0.30%300 μL
PBS1x100 ml
Totaln/a100 ml

Tableau 2 : Recettes de solutions.

2. Imagerie confocale

REMARQUE : Pour ce protocole, un microscope confocal à balayage laser, équipé d’un objectif 10x (NA 0,4) et de 4 lignes laser (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm) a été utilisé.

  1. Acquérez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence (voir l’exemple d’image de la figure 1).
  2. Utilisez le paramètre de taille de balayage suivant pour créer la macro, entraîner le modèle StarDist et, idéalement, pour l’acquisition d’images : Taille de l’image = 4 096 x 4 096 pixels (ou 1 273 x 1 273 microns), profondeur de bits = 16 bits, taille minimale des pixels = 0,3 micron, rapport signal/bruit (SNR) = minimum de 3.

figure-protocol-1
Figure 1 : Coloration par immunofluorescence d’une section de peau. DAPI : marquage des noyaux, CD90 : marqueur de fibroblaste, E-cadhérine : utilisé pour marquer l’épiderme, VIM : cellules exprimant le VIM, Merge : fusion des colorants DAPI (magenta), CD90 (bleu), E-cadhérine (jaune) et VIM (vert). Barres d’échelle = 100μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. Analyse d’images à l’aide de la macro SCAnED (Supplemental File 1, Supplemental Video S1 et Supplemental Video S2)

  1. Démarrez la macro (SCAnED.mp4 vidéo).
    1. Ouvrez des images d’immunofluorescence dans Fiji/ImageJ à l’aide de Bio-Formats avec les paramètres par défaut.
      REMARQUE : Ne divisez pas les canaux à cette étape.
    2. Téléchargez et exécutez la macro SCAnED en accédant à Plug-ins | Macros | Exécutez et sélectionnez le script de macro SCAnED (Fichier supplémentaire 1).
    3. Suivez les instructions étape par étape à l’écran fournies par la macro.
  2. Segmentation in silico de l’épiderme et du derme à l’aide de la macro SCAnED.
    1. Sélectionnez le canal E-cadhérine lorsque vous y êtes invité.
    2. Ajustez le seuil manuellement en accédant à Image | Ajuster | Seuil et en cliquant sur OK pour que le canal E-cadhérine capture entièrement la région épidermique.
    3. Si nécessaire, confirmez l’étape Flood Fill pour fermer les espaces dans le masque E-cadhérine en sélectionnant l’icône de l’outil Flood Fill dans ImageJ, en cliquant sur la partie supérieure de l’épiderme et en cliquant sur OK (Figure supplémentaire S1A-E et conseils de dépannage dans la section de discussion).
    4. Si le masque est inversé, sélectionnez Oui et OK lorsque vous êtes invité à inverser la sélection ; sinon, sélectionnez Non et OK (voir la figure supplémentaire S1F,G et les conseils de dépannage dans la section de discussion).
    5. Sélectionnez le canal DAPI lorsque vous y êtes invité. Les images des noyaux avant et après la segmentation épidermique-dermique sont présentées à la figure 2.
  3. Segmentation des noyaux à l’aide de la fonction de seuil
    1. Définissez automatiquement les niveaux d’intensité.
  4. Segmentation des noyaux à l’aide de StarDist
    1. Ouvrez StarDist dans ImageJ (Figure 3).
    2. Chargez le modèle de détection de noyaux (fichier supplémentaire 2) dans l’interface graphique StarDist (Figure 4). La paire d’entraînement correspondante pour la création du modèle StarDist est illustrée dans la figure supplémentaire S2.
      REMARQUE : La version 1.15 de Tensor Flow doit être utilisée pour ce modèle en cas d’erreur StarDist (voir Figure supplémentaire S3).
    3. Cliquez d’abord sur le canal des noyaux.
    4. Ajustez les paramètres des tuiles en conséquence (assurez-vous que le nombre de tuiles correspond à la taille de parcelle attendue (256 x 256 px) (voir Figure 3 et Figure 4).
      REMARQUE : La segmentation StarDist peut prendre du temps en fonction du nombre de noyaux.
  5. Mesure de l’intensité et quantification des protéines nucléaires
    REMARQUE : Avant d’exécuter SCAnED, accédez à Analyser | Définissez les mesures et configurez les paramètres pour garantir une sortie de données précise et pertinente (Figure 5).
    1. Lorsque vous y êtes invité, sélectionnez Oui pour mesurer l’intensité du marqueur dans les noyaux.
    2. Choisissez le canal de marqueur approprié (jusqu’à cinq possibles).
    3. Enregistrez les résultats sous forme de fichiers CSV comme indiqué par la macro.
    4. Répétez l’opération pour chaque canal.
    5. Une fois tous les canaux traités, enregistrez les résultats sous forme de fichiers CSV comme indiqué par la macro.
      REMARQUE : Pour une meilleure visualisation, nous avons inclus une vue agrandie d’une région cutanée spécifique pour le reste de l’analyse (Figure 6).
  6. Segmentation cellulaire (région cytoplasmique)
    REMARQUE : La segmentation cellulaire est basée sur l’expansion du retour sur investissement nucléaire et doit donc être initiée après la segmentation des noyaux.
    1. Lorsque la fonction de seuil a été utilisée pour la segmentation des noyaux, appliquez la dilatation binaire.
    2. Lorsque StarDist a été utilisé pour la segmentation des noyaux, utilisez l’expansion d’agrandissement, qui a un temps de traitement plus long (voir la figure supplémentaire S4).
  7. Mesure d’intensité et quantification des protéines cytoplasmiques
    1. Sélectionnez Oui pour mesurer l’intensité du marqueur dans des cellules entières.
    2. Enregistrez les fichiers CSV du résultat comme indiqué par la macro.
    3. Répétez l’opération pour chaque canal de marqueur dans l’ordre.
    4. Conservez le même ordre des canaux pour les mesures du noyau et de la cellule afin de maintenir la cohérence des données de sortie.
    5. Choisissez Ignorer chaque fois que la macro vous le demande, pour éviter de mélanger les données des noyaux entre l’épiderme et le derme. La figure 7 illustre toutes les étapes de la segmentation basée sur les seuils.

figure-protocol-2
Figure 2 : Analyse et séparation des noyaux spécifiques aux canaux dans les noyaux épidermiques et dermiques. La coloration par immunofluorescence du DAPI démontre la morphologie et la distribution spatiale des noyaux dans la peau entière (image de gauche). Représentation des canaux nucléaux des noyaux épidermiques colorés au DAPI, donnant un aperçu de la distribution des noyaux dans le compartiment épidermique (image du milieu). Représentation des canaux nucaux des noyaux dermiques colorés au DAPI, offrant une visualisation de la distribution des noyaux dans le compartiment dermique (image de droite). Barres d’échelle = 100μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-protocol-3
Figure 3 : Utilisation de l’option « StarDist ». Capture d’écran mettant en évidence l’emplacement de l’option « StarDist 2D » dans le menu/Plugins/StarDist/StarDist 2D. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-protocol-4
Figure 4 : Instructions d’utilisation du modèle de détection des noyaux. Téléchargez le fichier « nuclei_detection_model.zip » et indiquez son chemin d’accès dans la section Parcourir. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-5
Figure 5 : Configuration des paramètres de mesure. (A) Capture d’écran mettant en évidence l’emplacement de l’option Définir les mesures dans le menu, permettant la personnalisation des paramètres de mesure pour l’analyse ultérieure. (B) Boîte de définition des mesures affichant l’interface d’ajustement des paramètres de mesure, permettant aux utilisateurs de spécifier des paramètres pour la collecte et l’analyse des données. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-6
Figure 6 : Vue agrandie d’une région spécifique. (A) Fusion des colorants DAPI (magenta) et VIM (vert). (B) Vue agrandie d’une région spécifique à partir de A, fournissant une visualisation détaillée de l’expression de la VIM dans le tissu cutané. Veuillez noter la morphologie différente des noyaux au sein de l’épiderme et du derme. Barres d’échelle = 100 μm (A), 20 μm (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-7
Figure 7 : Segmentation de SCAnED dans l’épiderme et le derme pour les noyaux et les cellules à l’aide du seuil. (A) Image entière : Fusion des colorations DAPI (magenta) et VIM (vert). Partie supérieure : (B) Fusion des noyaux épidermiques colorés au DAPI et au VIM après séparation. (C) Masque des noyaux épidermiques à l’aide d’un seuil. (D) Segmentation des noyaux épidermiques superposés à la fusion de DAPI et VIM, aidant à la visualisation de la distribution des noyaux dans le compartiment épidermique. (E) Segmentation cellulaire des noyaux épidermiques superposés à la fusion de DAPI et VIM, aidant à la visualisation de la distribution des noyaux dans le compartiment épidermique en utilisant le seuil et la dilatation, car elle montre que la région de sélection est plus grande que les noyaux. Partie inférieure : (F) Fusion des noyaux dermiques colorés au DAPI et au VIM après séparation. (G) Masque des noyaux dermiques à l’aide d’un seuil. (H) Segmentation des noyaux dermiques superposés à la fusion de DAPI et de VIM, aidant à la visualisation de la distribution des noyaux dans le compartiment dermique. (I) Segmentation cellulaire des noyaux dermiques superposés à la fusion de DAPI et de VIM, aidant à la visualisation de la distribution des noyaux dans le compartiment dermique. Barres d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

4. Classification et visualisation des données extraites d’une seule cellule (vidéo supplémentaire S3)

REMARQUE : Chaque marqueur d’immunofluorescence génère deux fichiers CSV : un pour le compartiment épidermique et un pour le compartiment dermique.

  1. Établissez des seuils d’intensité spécifiques aux marqueurs à l’aide d’échantillons de contrôle d’isotypes.
    1. Importez les fichiers de sortie CSV générés par la macro SCAnED dans Google Colab à l’aide du Jupyter Notebook fourni. Dans un premier temps, téléchargez le bloc-notes Jupyter approprié (par exemple, le fichier supplémentaire 3 ou le fichier supplémentaire 4), accédez à Google Colab (https://colab.research.google.com/), cliquez sur Fichier, ouvrez le bloc-notes, sélectionnez le fichier, exécutez les cellules de code une par une. Lorsque vous êtes invité à choisir des fichiers, cliquez sur le bouton et téléchargez le fichier .csv.
    2. Pour chaque anticorps, calculez l’intensité moyenne de fluorescence à partir des contrôles d’isotype. Pour déterminer la coupure de chaque anticorps, ouvrez le carnet DotPlot (fichier supplémentaire 4), téléchargez le fichier de contrôle d’isotype correspondant et exécutez le code.
    3. En fonction de la distribution des points dans le contrôle de l’isotype et des graphiques d’anticorps spécifiques, choisissez un seuil d’intensité approprié pour séparer le bruit de fond (contrôle de l’isotype) du signal (coloration spécifique). Utilisez ces valeurs comme seuils pour classer des cellules individuelles comme positives ou négatives pour l’expression du marqueur.
  2. Comparez les intensités des marqueurs dans les échantillons expérimentaux aux seuils calculés.
    1. Classez les cellules dont l’intensité ≥ le seuil sont positives.
    2. Classez les cellules dont l’intensité < le seuil sont négatives.
    3. Classez les sous-populations en fonction de combinaisons d’expression de marqueurs, par exemple, identifiez les populations cellulaires mono-positives, doubles-positives ou triplement positives.
  3. Visualisez la distribution et les relations de l’expression des marqueurs à l’aide de deux types de graphiques :
    1. Créez des histogrammes et superposez des histogrammes pour comparer la distribution de l’intensité entre les affections (par exemple, peau témoin ou peau malade) en exécutant le code de l’histogramme (téléchargez le fichier supplémentaire 3, accédez à Google Colab (https://colab.research.google.com/), cliquez sur Fichier, ouvrez le carnet, sélectionnez le fichier, exécutez le code) (Figure 8).
    2. Créez des diagrammes à points pour simuler des diagrammes de dispersion de type cytométrie en flux pour évaluer les modèles de co-expression en exécutant le code DotPlot (téléchargez le fichier supplémentaire 4, accédez à Google Colab (https://colab.research.google.com/), cliquez sur Fichier, ouvrez le bloc-notes, sélectionnez le fichier, exécutez le code) (Figure 9).
    3. Exportez les données traitées pour des analyses supplémentaires et l’évaluation des différences significatives à l’aide de tests statistiques.

figure-protocol-8
Figure 8 : Histogramme de superposition comparant l’intensité moyenne des cellules VIM positives. Superposition d’histogrammes comparant l’intensité moyenne des cellules VIM dans les échantillons sains (H) en bleu et les échantillons de psoriasis (P) en orange dans le derme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-protocol-9
Figure 9 : Signaux positifs doubles sur un graphique à points. Une démonstration de diagramme à points à double coloration qui peut aider à une meilleure visualisation des populations mono-positives, doublement positives et doublement négatives. Cet exemple montre la double coloration de CD90 et de VIM dans le derme d’une peau (A) saine et (B) d’une peau atteinte de psoriasis, ainsi que dans l’épiderme d’échantillons de peau (C) saine et (D) d’échantillons de peau atteinte de psoriasis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans une étude précédente, nous avons utilisé avec succès SCAnED pour détecter et quantifier les cellules et les niveaux d’expression de la lysyl oxydase (LOX), une protéine cytoplasmique, et du facteur de transcription facteur 1 inductible par l’hypoxie (HIF-1) dans les cellules du derme de la peau humaine12 , mettant en évidence l’applicabilité de cet outil pour la recherche sur la peau.

Pour évaluer davantage la précision de notre macro de segmentation cutanée dans l...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole SCAnED est une méthode semi-automatisée d’analyse spécifique des cellules immunitaires et non immunitaires dans les tissus cutanés humains. Le flux de travail intègre un protocole de coloration basé sur la E-cadhérine pour permettre la segmentation de l’épiderme et du derme, la détection des noyaux et des cellules à base de DAPI, suivie de la quantification de l’expression des marqueurs dans les noyaux et les cellules à l’aide de notre macro basée sur ImageJ. De plus, nous g...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le développement de ce pipeline d’analyse d’images a été financé par le Land Niederösterreich dans le cadre du cluster de recherche sur les allergies au Danube et par la Fellinger Krebsforschung.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,3 % Triton X  ;Sigma-AldrichT9284
BSA (albumine sérique bovine)Sigma Aldrich
CD90Signalisation cellulaireD3V8A
DAPI  ;Roche10236276001
Désionisée
E-cadherine  ;Abcamab1416
Milieu de montage à fluorescence   ;DakoS3023
Anticorps secondaire croisé IgG1 anti-souris chez la chèvre, Alexa Fluor 488  ; (AF 488 anti-souris)Thermo Fisher ScientificA-21121
Anticorps secondaire anti-souris IgG2a adsorbé croisé, Alexa Fluor 647 (AF 647 anti-souris)Thermo Fisher ScientificA-21241
Anticorps secondaire anti-lapin IgG (H+L) adsorbé croisé chez la chèvre, Alexa Fluor 568 (AF 568 anti-lapin)Thermo Fisher ScientificA-11011
Sérum de chèvre   ;Agilent Technologies & Ouml ; sterreich GmbH, DakoX0907
PBS  ;Gibco14190-094
Vimentin  ;DakoM7020
Matériaux
Boîte à chambre (boîte humide)
Coverslips  ;Thermo Fisher
Marqueur culisant répulsif aux liquides pour coloration (hydrophobe) & nbsp ;Daido SangyoZ37782124x50mm
Solutions
Tampon de perméabilisation (0,3 % Triton X dans PBS) & nbsp ;Voir le tableau 2
Tampon de coloration (2 % BSA dans PBS) & nbsp ;Voir le tableau 2
logiciel et jeux de données
Microscope laser confocal & nbsp ;OlympeFV3000 basé sur l’IX83 inversééquipé d’un objectif 10x (NA 0,4), 4 lignes laser (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm, cohérent)
Fidji (ImageJ)  ;V1.54h
Google ColabGoogle
GraphPad Prism  ;GraphPad Software Inc.Prisme 10pour une analyse statistique plus approfondie
HALOIndica Labs
Programme PythonPython 3.11.12
QuPathlogiciel ouvert (Bankhead, P. et al., https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5)v0.5.1
StarDistInstaller la version CPU de TF1.15.0

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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