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Article de méthode

Préparation de la propagation des chromosomes méiotiques à partir d’ovocytes de souris pour l’évaluation de la synapse et de la recombinaison

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DOI :

10.3791/68749

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18 juillet 2025

1Department of Biomedical Sciences, Cornell University, 2Cornell Reproductive Sciences Center, Cornell University

Dans cet article

Résumé

Les erreurs méiotiques dans les synapses et la recombinaison sont courantes chez les ovocytes de mammifères. Une analyse rigoureuse des protéines impliquées dans ces processus est essentielle pour comprendre comment et pourquoi l’ovogenèse tourne souvent mal. Les techniques présentées ici permettent un suivi complet de la recombinaison et des synapses pour évaluer la qualité des ovocytes chez la souris.

Résumé

Trois processus critiques et interdépendants définissent la prophase I méiotique : les chromosomes homologues doivent s’apparier, une structure protéique appelée complexe synaptonémique se forme pour lier les homologues ensemble (synapse), et les homologues subissent une recombinaison, échangeant réciproquement du matériel génétique pour former des croisements (CO). Des erreurs dans ces processus peuvent entraîner une insuffisance ovarienne prématurée, une aneuploïdie et, finalement, une perte de grossesse et l’infertilité. La recombinaison méiotique est particulièrement sujette aux erreurs dans les ovocytes, avec plus de 7 % des ovocytes humains contenant au moins une paire de chromosomes sans croisement, et entre 20 % et 80 % des ovules contre 2,5 % à 7 % des spermatozoïdes sont aneuploïdes. Cependant, on ne sait toujours pas pourquoi les erreurs chromosomiques montrent des disparités sexuelles aussi frappantes. Le présent protocole décrit les méthodes de préparation et d’analyse des propagations des chromosomes de la prophase I et de la métaphase I des ovocytes à partir de souris fœtales et juvéniles, respectivement. Pour suivre la dynamique chromosomique critique tout au long de la prophase I méiotique, ce protocole utilise la coloration par immunofluorescence de marqueurs communs pour la recombinaison méiotique (RAD51 pour les cassures double brin, MSH4 pour les intermédiaires CO et MLH1/MLH3 pour identifier la plupart des CO) et la synapse (SYCP3 pour les axes chromosomiques, SYCP1 pour les régions synapsées et HORMAD1 pour les régions asynapsées). De plus, ce protocole utilise la maturation in vitro des ovocytes collectés pour évaluer le nombre de chromosomes appariés (bivalents) et le nombre total de croisements (chiasmes) en métaphase I. Ensemble, ces techniques fournissent un cadre complet et quantitatif pour examiner les mécanismes régulant la dynamique chromosomique précoce dans la méiose féminine.

Introduction

La méiose est une division cellulaire spécialisée essentielle à la production de gamètes haploïdes. Au cours de la prophase I, les chromosomes homologues (chacun constitué de chromatides sœurs maintenues ensemble par la cohésine) doivent accomplir trois tâches critiques : 1) se reconnaître et s’apparier, 2) se connecter en formant le complexe synaptonémal (SC) entre leurs axes latéraux, et 3) échanger de l’ADN par recombinaison homologue, ce qui entraîne des croisements (CO) entre chromatides non sœurs 1,2. La connexion physique résultant de la formation de croisements, maintenue par la cohésine, assure une bonne biorientation et ségrégation des chromosomes pendant la métaphase I 3,4,5.

La prophase méiotique I comprend cinq étapes, chacune définie par l’état de la synapse6. Dans le leptonème (grec pour fil fin), les chromosomes se condensent lorsque l’élément axial (marqué par SYCP3) se forme le long des axes chromosomiques. Au cours des zygonema (fils joints), les homologues commencent à synapser lorsque l’élément transversal du SC (SYCP1) se forme entre les axes7. Chez le pachynema (fil épais), les chromosomes sont synapsés sur toute leur longueur. Le SC se désassemble ensuite pendant le diplonéma (deux fils), laissant les homologues connectés uniquement aux sites de croisement (chiasmes). Les chiasmes sont le produit d’une recombinaison homologue, un processus initié par l’induction programmée de cassures double brin de l’ADN (DSB). Sur des centaines de DSB, seulement ~10 % deviennent des CO. Chez la souris, la plupart (90 % à 95 %) se forment par la voie CO de classe I facilitée par MutLγ (MLH1-MLH3), les CO restants étant fabriqués par MUS81-EME1 par la voie CO de classe II8, 9, 10, 11.

L’appariement, la synapse et la recombinaison sont des processus hautement régulés et interdépendants. Les erreurs déclenchent généralement des mécanismes de point de contrôle, conduisant à la mort cellulaire. Chez les femelles, la perte de cellules germinales due à des erreurs précoces de prophase I peut entraîner une insuffisance ovarienne prématurée12,13, tandis que des erreurs tardives (par exemple, des homologues ne formant pas de CO, un mauvais déplacement des CO ou une perte prématurée de cohésine) peuvent entraîner une méségrégation chromosomique et une aneuploïdie. Chez l’homme, les erreurs méiotiques sont l’une des principales causes de perte de grossesse et d’infertilité. La méiose féminine est particulièrement sujette aux erreurs. Environ 20 à 80 % des ovules humains (contre 2,5 à 7 % des spermatozoïdes) portent un nombre anormal de chromosomes, la plupart résultant d’erreurs dans la première division méiotique 14,15,16,17. Bien que l’âge ait été identifié comme la principale cause d’aneuploïdie maternelle, la raison pour laquelle les ovocytes sont si sensibles aux erreurs reste incertaine.

Malgré l’importance de comprendre les facteurs sous-jacents aux taux d’erreur élevés dans les ovocytes, la plupart de nos connaissances sur la régulation des événements de prophase I proviennent d’études sur la méiose masculine. Parce qu’un petit fragment de matériel testiculaire adulte fournit suffisamment de matériel pour évaluer tous les stades des cellules germinales méiotiques et post-méiotiques, la méiose masculine a longtemps été plus facilement accessible aux chercheurs. En revanche, la méiose féminine se produit de manière discontinue. Chez la souris, la prophase I progresse de manière semi-synchrone dans l’ovaire fœtal, à partir d’environ 14 jours après le coït (dpc ; Figure 1A), peu de temps après la détermination du sexe gonadique 18,19,20. Au moment de la naissance, les ovocytes entrent en arrêt dictyé jusqu’à l’ovulation des mois (chez la souris) ou des décennies (chez l’homme) plus tard 21,22,23. Par conséquent, les stades spécifiques de la prophase I ne sont accessibles que pendant des fenêtres de développement limitées (Figure 1A), les événements post-prophase I ne se produisant que dans quelques ovocytes à la fois chez les juvéniles et les adultes. Bien que les progrès techniques aient amélioré les études sur la méiose des ovocytes chez les mammifères, ces méthodes restent difficiles et longues par rapport aux techniques comparables utilisées dans les études masculines.

L’analyse méiotique féminine est encore compliquée par la limitation de la sous-stadification des ovocytes pachytènes, ce qui est essentiel pour l’étude de la désignation et de la maturation des transitions. Les études masculines bénéficient d’une dynamique d’appariement des chromosomes sexuels bien caractérisée et de la présence de la variante d’histone, H1t, qui servent de marqueurs pour le pachynème précoce, moyen et tardif 24,25,26. Cependant, aucune méthode fiable n’a été formalisée pour sous-stadifier les ovocytes de pachytènes.

Les protocoles présentés ici facilitent une analyse complète de la synapse et de la recombinaison dans les ovocytes de souris de la prophase I précoce à la métaphase I. Ce travail s’appuie sur les techniques classiques de propagation des chromosomes développées par Peters et al.27 et Tarkowski28 et les raffinements antérieurs de ces méthodes par Hunt29 et Sun et Cohen30. Ce protocole a été développé pour mettre l’accent sur : 1) l’enrichissement et l’identification de sous-étapes spécifiques de la prophase I, 2) la maximisation du nombre d’applications effectuées par paire d’ovaires fœtaux, et 3) des mesures complètes et accessibles pour l’évaluation des défauts de synapse et de la recombinaison des foyers aux chiasmes.

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Protocole

Toutes les manipulations et procédures ont été effectuées à la suite de l’approbation du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de Cornell (IACUC) en vertu du protocole 2004-0063.

1. Préparation de la lame d’étalement du chromosome de la prophase I de l’ovocyte

  1. En fin d’après-midi, mettez en place des accouplements programmés de souris femelles C57BL/6J (âgées de 2 à 6 mois) avec des mâles (âgés de 2 à 12 mois). À partir du lendemain, vérifiez les femelles chaque matin (avant 9 h) pour un bouchon copulatoire. Midi le jour de la prise est défini comme 0,5 dpc.
  2. Préparez ce qui suit avant de sacrifier des souris enceintes.
    1. Mettez en place une chambre humidifiée avec une température ambiante H2O.
    2. Préparez 10 mL de tampon d’extraction hypotonique (HEB ; voir le tableau 1) composé de 30 mM de Tris-HCl, 50 mM de saccharose, 17 mM de citrate de sodium, 5 mM d’EDTA, 2,5 mM de DTT et 0,5 mM de PMSF dans de l’eau Milli-Q. Avant d’ajouter du DTT et du PMSF, ajustez le pH à 8,2 - 8,4 en utilisant 50 mM d’acide borique. Préparez HEB frais et utilisez-le dans les 2 heures suivant l’ajout de la TNT.
    3. Préparez 100 mM de saccharose en ajoutant 342 mg de saccharose à 10 mL de H2O. Conserver à 4 °C lorsqu’il n’est pas utilisé.
    4. Préchauffer l’ultra-pur H2O au micro-ondes standard pendant 1 min (jusqu’à 90 - 95 °C). Sous une hotte, ajoutez le H2O ultrapur chauffé à 0,5 g de paraformaldéhyde (PFA). Ajouter deux gouttes de 1 N NaOH, mélanger au vortex et laisser refroidir à température ambiante. Ajuster le pH à 9,2 - 9,3 avec 50 mM d’acide borique et ajouter Triton X-100 à 0,15 % (v/v). Ajouter du H2O ultrapur à un volume final de 50 mL (solution fixatrice de PFA à 1 %) et verser le fixateur dans un bocal de coloration Coplin en verre de 50 mL.
      REMARQUE : Ce protocole a été optimisé en utilisant de l’eau presque bouillante pour préparer le PFA ; cependant, le chauffage du PFA en solution au-dessus de 65 °C peut provoquer une dégradation et le dégagement de fumées toxiques. Vous pouvez également préchauffer l’ultra-pur H2O à 60 °C dans un bain-marie.
    5. Nettoyer les lames de microscope en verre avec 70 % d’éthanol. À l’aide d’un stylo PAP barrière hydrophobe, dessinez jusqu’à trois carrés (environ 20 x 20 mm ; voir la figure 1E). Une seule paire d’ovaires fournira suffisamment de matériel pour six carrés (ou deux lames de 3 carrés, chacune).
  3. Sacrifier des souris enceintes de 14,5 à 18,5 dpc par asphyxie au CO2 et luxation cervicale selon les directives de l’IACUC.
    1. Les points temporels de l’enrichissement de stades spécifiques de la prophase I chez les souris C57BL/6J sont décrits à la figure 1A. Pour les moments de développement donnés, le pourcentage approximatif d’ovocytes à chaque stade de la prophase I a été fourni à l’aide des données d’Evans et al. (1982)31. Pour les ovocytes de zygotène, prélever 16,5 dpc ; pachytène précoce sur 17,5 dpc ; et pachytène moyen - diplotène à 18,5 dpc.
  4. Utilisez des ciseaux de dissection pour ouvrir la cavité abdominale et retirer les cornes utérines.
  5. Disséquez les souris fœtales de la corne utérine, du tissu décidual et du sac vitellin. Placez les souris fœtales dans une boîte de Pétri de 100 mm avec 1 tampon phosphate salin (PBS).
  6. Disséquer les ovaires d’un fœtus féminin à la fois tout en maintenant le reste en 1x PBS. Sacrifiez des souris fœtales par décapitation selon les directives de l’IACUC. À l’aide de goupilles en acier inoxydable, fixez la surface ventrale du torse à un tampon en silicone dans une boîte de dissection.
  7. Utilisez des ciseaux de microdissection pour faire une incision abdominale juste en dessous de l’ombilic, en prenant soin d’éviter d’entailler les artères. Utilisez des pinces fines pour déplacer l’intestin jusqu’à ce que les cornes utérines du fœtus soient visibles.
  8. Pour localiser les ovaires, suivez chaque corne utérine vers l’extérieur de la vessie vers le rein. L’ovaire et l’oviducte apparaîtront comme de petites structures globulaires aux extrémités des cornes utérines, situées juste en dessous du rein et près de la partie postérieure de la cavité péritonéale (Figure 1B).
  9. À l’aide d’une pince fine, pincez les ovaires et recueillez-les dans un petit verre de montre rempli de 750 μL de 1x PBS.
  10. Disséquez l’ovaire des tissus environnants et placez les deux ovaires dans un verre de montre contenant 750 μL d’HEB, en prenant soin de s’assurer que les ovaires sont complètement immergés (voir les figures 1C et 1D). Incuber les ovaires pendant 15 min à température ambiante.
  11. Pipette de 35 μL de 100 mM de saccharose sur une lame de concavité. Utilisez des pinces fines pour transférer les deux ovaires de HEB à saccharose.
  12. Utilisez une aiguille 25G pour fixer un ovaire à la lame tout en utilisant une deuxième aiguille, biseauté vers le bas, pour presser les ovocytes de l’ovaire.
    1. Lorsque l’ovaire devient transparent et gélatineux, retirez l’ovaire de l’HEB et répétez le processus avec le deuxième ovaire. Pipetez doucement la solution pour disperser les cellules.
  13. Trempez la lame dans le pot de coloration Coplin de PFA et tamponnez brièvement le bord de la lame contre une serviette en papier. Une fois que le PFA a été collecté en petites gouttes le long de la limite hydrophobe de chaque carré (figure 1E), pipeter 5 μL de la solution d’ovocyte-saccharose dans chaque goutte de PFA.
  14. Répartissez les ovocytes sur les sections carrées en inclinant doucement les lames d’avant en arrière. Veillez à ne pas laisser la solution d’un carré se répandre dans les carrés adjacents.
  15. Placez la lame dans une chambre humide et continuez à faire des lames jusqu’à ce que la solution d’ovocyte-saccharose soit épuisée.
  16. Répétez les étapes 1.6 à 1.15 jusqu’à ce que tous les fœtus féminins aient été utilisés. Incuber les lames dans une chambre humide à température ambiante pendant 2 h.
  17. Après l’incubation, ouvrez la chambre humide. Comme la plupart (sinon la totalité) du liquide ou du fixateur doivent encore être présents sur la surface de la lame (environ 10 μL dans chaque section carrée), transférez doucement les lames sur une serviette en papier et laissez les lames sécher complètement à l’air libre à température ambiante sur une paillasse de laboratoire (ce processus prend généralement de 30 à 60 minutes, selon l’humidité locale).
    REMARQUE : Les lames peuvent également être séchées à l’air sous une hotte pour atténuer l’exposition potentielle aux fumées résiduelles de PFA. Cela raccourcira également le séchage à environ 20 à 30 minutes.
  18. Laver les lames avec un agent mouillant à 0,4 % dans du H2O ultrapur pendant 2 min. Laissez les lames sécher complètement.
    REMARQUE : À ce stade, les lames peuvent être stockées à -80 °C ; cependant, certains épitopes sont instables (par exemple, d’après notre expérience, MLH1 se colore mal et la coloration SYCP3 présente des artefacts importants après la congélation). Il est fortement conseillé d’immunocolorer immédiatement les lames.

2. Coloration par immunofluorescence des prophases I des propagations du chromosome

  1. Préparez un tampon de dilution d’anticorps 10x (ADB ; voir tableau 2) contenant 10 % (v/v) de sérum de chèvre normal, 3 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,05 % de Triton X-100 dans 1x PBS. Filtrer la stérilisation à l’aide d’un filtre de 0,45 μm et le conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
  2. Lavez les lames dans un pot de coloration Coplin avec 0,4 % d’agent mouillant dans 1x PBS pendant 10 min. Laver les lames dans un pot de coloration Coplin de 0,1 % Triton X-100 dans 1x PBS pendant 10 min. Bloquez les lames dans un bocal de coloration Coplin de 1x ADB pendant 10 min.
  3. Diluez les anticorps primaires sélectionnés dans 10x ADB (voir la table des matériaux pour la liste des anticorps et leurs dilutions respectives).
    1. Préparer quatre combinaisons d’anticorps pour l’immunomarquage multiplex : (1) SYCP332,33, SYCP133 HORMAD133 ; (2) SYCP332,33, RAD5132,33, MLH332 ; (3) SYCP332,33, MSH432, MLH332 ; et (4) SYCP334, MLH132, 33, 34, CREST35.
  4. Retirez les lames de l’ADB, tapotez l’excès de liquide et placez les lames dans une chambre humidifiée avec de l’eau à température ambiante. Appliquez 30 μL d’anticorps dilués par section carrée de chaque lame, en veillant à ce que les anticorps d’un carré ne se répandent pas dans les carrés adjacents.
  5. Fermez la chambre humidifiée et laissez les lames incuber toute la nuit à température ambiante.
  6. Le lendemain matin, ouvrez la chambre humide et tapotez les anticorps dilués des lames. Répétez l’étape 2.2.
  7. Diluez les anticorps secondaires sélectionnés dans 10x ADB (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE : À partir de ce moment, les lames et les anticorps sont photosensibles. Terminez toutes les incubations subséquentes dans l’obscurité.
  8. Retirez les lames de l’ADB, tapotez l’excès de liquide et placez-les dans une chambre humidifiée d’eau à température ambiante. Appliquez 30 μL d’anticorps dilués sélectionnés par section carrée de chaque lame, en prenant soin de ne pas déborder les anticorps d’un carré dans les carrés adjacents.
  9. Fermez la chambre humidifiée et laissez les lames incuber pendant 2 h à température ambiante.
  10. Lavez les lames 3 fois pendant 5 minutes chacune dans des pots de coloration Coplin contenant 0,4 % d’agent mouillant dans 1 PBS. Laver les lames pendant 5 min dans un pot de coloration Coplin contenant 0,4 % d’agent mouillant dans du H2O ultrapur.
  11. Appliquer une petite goutte (environ 10 μL) de milieu de montage anti-décoloration avec un colorant d’acide nucléique 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou équivalent. Placez une lamelle en verre n° 1,5 de 60 mm x 24 mm sur chaque lame et épongez soigneusement l’excès de liquide.
    REMARQUE : Les lames peuvent être scellées avec du vernis à ongles transparent ou du ciment en caoutchouc. En cas d’utilisation d’un produit de rodage, il n’est pas nécessaire de sceller les lames. Les diapositives doivent être stockées dans une boîte ou un dossier à 4 °C. Bien qu’il soit recommandé d’imager les lames peu de temps après la coloration, d’après notre expérience, les lames stockées dans l’obscurité à 4 °C peuvent conserver l’intensité de leur signal pendant plusieurs mois à un an. Pour un stockage à plus long terme, les lames de conservation peuvent être conservées à -20 °C pendant plusieurs années sans perte significative de qualité du signal.
  12. Imagez les cellules à 63x à l’aide de la microscopie à épifluorescence (voir le tableau des matériaux). Utilisez un logiciel d’analyse d’images (par exemple, Zen ou ImageJ, voir Tableau des matériaux) pour mesurer la longueur SC et l’intensité de fluorescence de tous les canaux le long de l’axe. Tracez la longueur de chaque axe chromosomique (SYCP3), en commençant par le centromère (région dense CREST ou DAPI).
    1. Pour l’analyse de HORMAD1 et de SYCP1, enregistrez les longueurs des pics de signal de fluorescence. Calculez la longueur totale des pics de HORMAD1 ou de SYCP1 et divisez-les par la longueur de l’axe chromosomique.
    2. Pour l’analyse de MSH4, quantifiez le nombre de pics de signal de fluorescence pour chaque mesure de SYCP3. Enregistrez à la fois le nombre total de pics MSH4 par noyau et le nombre de pics MSH4 chevauchant les pics MLH3. Confirmez le nombre de MSH4 en comparant les pics au nombre de foyers correspondants.

3. Préparations de diakinèse/prométaphase pour l’observation des chiasmes

  1. Pour maximiser le rendement d’ovocytes méiotiquement compétents, utilisez des souris femelles juvéniles (âgées de 25 à 28 jours).
    REMARQUE : Une stimulation par injection intrapéritonéale de 5 UI de gonadotrophine sérique de jument gestante (PMSG) 48 h avant le prélèvement d’ovocytes peut être effectuée pour améliorer le rendement. Cependant, pour les analyses des chiasmes, une quantité suffisante d’ovocytes de vésicules germinales (GV) peut être prélevée sur des femelles non stimulées.
  2. Avant de sacrifier des souris, préparez les réactifs et les solutions suivants.
    1. Laisser M2 (3 mL par souris) et KSOM (1 mL par souris) s’équilibrer dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO2) pendant au moins 1 h.
      REMARQUE : Les tubes d’aliquotes de milieu congelé peuvent être placés dans l’incubateur avec leurs couvercles desserrés la veille de la collecte des ovocytes, ce qui permet environ 14 h d’équilibre.
    2. Préparez le milieu M2 avec de la milrinone de 2,5 μM (un inhibiteur de l’isoenzyme de la phosphodiestérase qui empêche la reprise méiotique)36. Pipeter cinq gouttes de 20 μL de M2 + milrinone dans une boîte de Pétri de 35 mm et les recouvrir d’huile minérale légère (figure 2C).
    3. Pipette cinq gouttes de 20 μL KSOM dans une boîte de Pétri de 35 mm et recouvrir d’huile minérale légère (Figure 2C).
      ATTENTION : Le contrôle de la température et du pH est essentiel à la maturation in vitro des ovocytes. Le prélèvement des ovocytes doit être effectué sur une paillasse chauffée (37 °C). Tous les milieux doivent être conservés dans l’incubateur jusqu’à ce qu’ils soient utilisés, et les plats de milieux doivent être retirés un par un pour limiter les perturbations causées par l’exposition à l’air ambiant.
    4. Nettoyez les lames de microscope en verre avec 70 % d’éthanol et laissez-les sécher à l’air. Au dos des lames de microscope en verre, marquez légèrement (avec un stylo à pointe de diamant) ou dessinez (avec une encre résistante à l’eau) une grille 5 x 5 de carrés de ~ 4 mm x 4 mm (un exemple est illustré à la figure 2B et peut être utilisé pour tracer la grille).
  3. Prélevez les ovocytes d’une souris à la fois. Sacrifier une souris femelle par asphyxie au CO2 et luxation cervicale selon les directives de l’IACUC.
  4. Utilisez des ciseaux de dissection pour ouvrir la cavité abdominale. Utilisez des pinces fines pour déplacer les intestins.
  5. Suivez chaque corne utérine de la vessie vers le rein. Les ovaires et les oviductes seront associés à un petit coussinet adipeux près du rein.
  6. Utilisez des ciseaux de microdissection pour retirer les ovaires et placez-les dans un milieu M2 gazeux avec de la milrinone.
  7. Utilisez des ciseaux de microdissection pour enlever toute la graisse et les autres tissus (y compris la bourse) des ovaires. Utilisez des aiguilles de 25 g pour rompre les follicules antraux.
  8. À l’aide d’une pipette de transfert, étalez les ovocytes en M2 + milrinone en couche mince dans une boîte de Pétri de 100 mm, en prenant soin de ne pas laisser le milieu toucher les parois de la boîte (Figure 2C).
  9. Utilisez un microscope de dissection (grossissement 25x - 50x) pour visualiser les ovocytes GV (Figure 2F). Les ovocytes GV peuvent être associés à des cellules cumulus dans un complexe cumulus-ovocytes (COC). Retirez les cellules des cumulus par pipetage répété.
  10. Prélever les ovocytes GV à l’aide d’une pipette en verre à bouche (100 à 150 μm de diamètre ; Figure 2A). Transférez les ovocytes GV dans une goutte de 20 μL de M2 + milrinone recouverte d’huile minérale légère (Figure 2C). Ne mettez pas plus de 30 ovocytes dans une seule goutte.
  11. Lorsque tous les ovocytes GV ont été prélevés, passez-les dans deux ou trois gouttes de 20 μL de M2 + milrinone recouvertes d’huile minérale légère pour éliminer les cellules somatiques.
  12. Transférez les ovocytes GV (avec le moins de milieu possible) dans une goutte de 30 μL de KSOM. Lavez la milrinone en faisant passer les ovocytes dans cinq gouttes de KSOM (Figure 2C).
  13. Transférez tous les ovocytes GV dans des gouttes de 20 μL de KSOM recouvertes d’huile minérale légère, soit un maximum de 30 ovocytes par goutte de KSOM (Figure 2C). Placez les ovocytes dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO2).
  14. Incuber les ovocytes pendant environ 5 h.
    NOTE : Rupture du GV (marquant la disparition de l’enveloppe nucléaire et la reprise méiotique ; Graphique 2G) se produit généralement après 2 h de culture, mais le taux de maturation des ovocytes peut varier en fonction de la souche de souris ou de la stimulation hormonale. D’après notre expérience, un total de 5 h en culture permet d’optimiser la propagation des chiasmes chez la plupart des souches de souris. Si on le laisse mûrir trop longtemps, la première division méiotique et l’extrusion du corps polaire peuvent se produire (figure 2H).
  15. Transvasez 5 à 10 ovocytes (avec le moins de KSOM possible) dans une goutte de 30 μL de solution hypotonique (citrate de sodium à 0,9 % dans du H2O ultrapur). Incuber les ovocytes dans la solution hypotonique pendant 5 à 10 min.
  16. Pipeter une petite goutte (~ 1 μL) d’eau acidifiée (8 gouttes d’acide acétique glacial dans 50 mL de H2O ultrapur) sur l’un des carrés des lames préparées (figure 2B).
  17. À l’aide d’une pipette en verre à bouche de 100 à 150 m de diamètre, on peut transférer rapidement un ovocyte de la goutte d’eau acidifiée. Transférez le moins de solution hypotonique possible avec l’ovocyte. Utilisez la même pipette pour prélever une partie du liquide jusqu’à ce que l’ovocyte adhère à la lame.
    REMARQUE : Le volume de liquide autour de l’ovocyte est critique. Il doit y avoir suffisamment de liquide pour que l’ovocyte ne se dessèche pas avant la fixation, mais pas au point que l’ovocyte ne puisse pas adhérer à la lame.
  18. Passez rapidement à une pointe de pipette en verre de 150 m de diamètre. Ajoutez une goutte de fixateur de Carnoy frais (trois parties de méthanol absolu pour une partie d’acide acétique glacial) à l’ovocyte. Laissez le fixateur se disperser sur la lame. L’ovocyte doit sembler devenir moins distinct et fondre à mesure que l’acide du fixateur dissout la zone pellucide et que les cellules éclatent.
  19. Lorsque l’avant du fixateur commence à se contracter, ajoutez rapidement 2 à 3 gouttes supplémentaires de fixateur. Soufflez doucement sur la glissière pour accélérer le séchage.
  20. Répétez les étapes 3.16 à 3.19 avec des ovocytes supplémentaires de la solution hypotonique.
  21. Répétez les étapes 3.15 à 3.20 jusqu’à ce que tous les ovocytes aient été fixés. Vérifiez l’étalement des chromosomes à l’aide d’un microscope à contraste de phase.
  22. Lorsque la lame a complètement séché à l’air, placez-la dans un bocal de coloration Coplin avec 50 ml de Giemsa à 4 % (v/v) dans ddH2O. Taches de lames dans Giemsa pendant 6 min à température ambiante.
  23. Lavez les lames 3 fois pendant 3 minutes chacune dans ddH2O à température ambiante. Laissez les lames sécher complètement.
  24. Appliquer une fine couche (~60 μL) de Permount sur une lamelle en verre n° 1,5 de 60 mm x 24 mm. Montez les glissières en les inversant sur les lamelles et en épongeant soigneusement l’excès de liquide. Laissez les lames sécher pendant la nuit avant d’obtenir une image à 63x en fond clair.

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Résultats

Évaluation des défauts de synapse dans les cellules de type pachytène
Cette expérience évalue les défauts de synapse dans les ovocytes de pachytène et surveille la progression de la prophase I (Figure 3A). L’immunomarquage pour SYCP3 (éléments SC axial/latéral), SYCP1 (élément SC central) et HORMAD1 (axes chromosomiques non synapsés/désynapsés) permet l’évaluation de la stadification et de la synapse. HORM...

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Discussion

Les ovocytes de mammifères sont particulièrement sujets aux erreurs par rapport aux spermatocytes. Alors que le point de contrôle d’assemblage du fuseau (SAC) moins efficace de l’ovocyte contribue à cette vulnérabilité 14,52,53, Hassold et Hunt proposent que plusieurs coups conduisent à l’aneuploïdie, la recombinaison défectueuse étant un facteur primaire 54. Des études h...

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Déclarations de divulgation

L’auteur n’a aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Le financement de ce projet a été fourni par une bourse K99 de l’Institut national Eunice Kennedy Shriver pour la santé et le développement de l’enfant (HD112986 à TH).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,45 & mu ; Filtre à seringue mMillipore SigmaSLHAR33SBpour fabriquer une pipette à commande buccale
0,5 M EDTA, pH 8,0Corning46-034-CI  ;pour HEB
1 mL de seringue stérile avec aiguille de calibre 25, aiguille de 16 mmFisher Scientific14-817-125  ;pour la rupture des ovaires
Boîte de Petri de 100 x 15 mmVWR25384-302  ;
Pipets jetables en verre Pasteur en borosilicate de 14,6 cmFisher Scientific13-678-20B  ;pour fabriquer une pipette à commande buccale
Boîte de Petri de 35 x 10 mmCorning351008
Broches en acier inoxydable #3 de 40 mm x 0,45 mm pour l’entomologieAmazonB0CSSPW5S7pour immobiliser les souris fœtales pour la dissection
Acide acétique, glaciaireFisher ScientificA38-212pour le fixateur de Carnoy
Ensembles de tubes aspirateurs pour pipettes microcapillaires calibréesMillipore SigmaA5177-5EApour fabriquer une pipette à commande buccale
Verre de montre B.P.I.NDS Technologies & nbsp ;1580-00Sinon, utiliser une boîte embryonnaire de 30 mm de diamètre x 12 mm de profondeur (Electron Microscopy Sciences SKU : 70543-30)
Acide boriqueFisher ScientificBP168-1pour ajuster le pH du HEB, PFA
Albumine sérique bovineMillipore SigmaA7906-100Gpour ADB
Réservoir de CO2pour incubateur
Lames de microscope de CorningMillipore SigmaCLS294875X25L x F 75 mm x 25 mm, givré d’un côté
Lames de microscope Corning, givrées d’un côté, d’une extrémitéVWR294875X25
Couvrez le verre, rectangulaire. 60 x 24 mm, #1,5VWR48393-251
Plat de dissectionSciences de la microscopie électronique70540
Dissection MicroscopeTout modèle standard
Ciseaux de dissection, pointe tranchante, 4,5"VWR82027-578
Pinces à pointe ultra fine et pointuesVWR76548-836
Giemsa StainMillipore SigmaGS500-500Pour colorer les étalements de chiasmates
Stylo PAP barrière hydrophobe ImmEdgeLaboratoires VectorH-4000
IncubateurTout modèle standard avec technologie CO2 et chemise d’eau
Station de travail FIVK-SystemsN’importe quel modèle avec un plan de travail chauffant
Kodak Photo-Flo 200 SolutionPhoto & BH Vidéo1464510pour les lavages à coulisse
MéthanolFisher ScientificA412-4pour le fixateur de Carnoy
Pot de coloration Coplin de MP BiomédicalsFisher ScientificICN17006201
Sérum de chèvre normalGibco16210-072pour ADB
Paraformaldéhyde, grade EM, prill purifiéSciences de la microscopie électronique19200
PermountFisher ScientificSP15-100for  ; Lames de montage pour les écartements de chiasmates
Fixation antidécoloration en verre ProLong avec teinture NucBlueThermo ScientificP36985pour monter des lames immunocolorées
Tube en silicone, diamètre intérieur : 0,125 », diamètre extérieur : 0,25 »VWR89068-474pour fabriquer une pipette à commande buccale
Sodium Citrate DihydrateFisher ScientificS279-500pour HEB, solution hypotonique
Système de coloration par lame StaintraySciences de la microscopie électronique71396-BPour une utilisation comme chambre humidifiée. Il faut utiliser le couvercle noir pour la coloration par immunofluorescence. On peut aussi tapisser le fond d’une boîte à glissière opaque ou de la vaisselle de papier absorbant humide pour les utiliser comme chambre humidifiée et ;
Conseils pour strip-teaseuses - 100Cooper SurgicalMXL3-100pour pipette à commande buccale
Conseils pour strip-teaseuses - 150Cooper SurgicalMXL3-150pour pipette à commande buccale
SaccharoseMillipore SigmaS-8501pour HEB, solution hypotonique au saccharose
Tris BaseFisher ScientificBP152-5pour HEB
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100  ;pour PFA, ADB et Triton-PBS
Pot de coloration Coplin de United ScientificFisher ScientificS17495APlastique blanc opaque pour les lavis et les lames de blocage après ajout d’anticorps secondaires photosensibles
Lames de concavité en verre de United ScientificFisher ScientificS1395331,3 mm d’épaisseur, comptage à 2 puits
Ciseaux de microdissection Vannas 5mm droitsVWR76457-358
Zeiss Axio Imager.Z2, Colibri 7Carl Zeiss000000-2624-307
Zen Blue 3.11 LogicielCarl ZeissLogiciels d’acquisition et d’analyse d’images
Anticorps
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab') ? Fragment Goat Anti-Mouse IgG, spécifique au fragment FcJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-546-071dilution utilisée 1:1 000
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab') ? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG, Fc spécifique au fragmentJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-546-046dilution utilisée 1:1 000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab') ? Fragment de IgG, Fc&gamma Anti-Humains de Chèvre ; Spécifique au fragmentJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.109-606-170dilution utilisée 1:1 000
Alexa Fluor 647 AffiniPure Anti-Cobaye de chèvre IgG, Fc fragment specifiJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.106-605-008dilution utilisée 1:1 000
Bandea Pig anti-MLH3 pAbFabriqué sur mesure avec Thermo-Fisher, avec dilution 1:500
Cobaye anti-SYCP1 pAbde Christer Hö ; ö ; g (Kouznetsova et al. 2005), utilisé en dilution 1:200
Protéine anti-centromère humaine pAbAntibodies Inc.15-234dilution utilisée 1:1 000
Souris anti-MLH1 mAbBD Biosciences550838dilution 1:100 utilisée
Anti-SYCP3 mAb de sourisAbcamab97672dilution utilisée 1:1 000
Rabbit anti-HORMAD1 pAbProteintech13917-1-APDilution 1:500 utilisée
Rabbit anti-MSH4 pAbAbclonalA8556dilution 1:100 utilisée
Rabbit anti-RAD51 pAbMilliporePC130Dilution 1:500 utilisée
Rabbit anti-SYCP3 pAbAbcamab15093dilution utilisée 1:1 000
Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab') ? Fragment Goat Anti-Mouse IgG, spécifique au fragment FcJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-296-071dilution utilisée 1:1 000
Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab') ? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG, Fc spécifique au fragmentJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-296-046dilution utilisée 1:1 000

Références

  1. Gray, S., Cohen, P. E. Control of Meiotic Crossovers: From Double-Strand Break Formation to Designation. Annu Rev Genet. 50, 175-210 (2016).
  2. Hunter, N. Meiotic Recombination: The Essence of Heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7, a016618(2015).
  3. Kudo, N. R., et al. Resolution of Chiasmata in Oocytes Requires Separase-Mediated Proteolysis. Cell. 126, 135-146 (2006).
  4. Murdoch, B., et al. Altered Cohesin Gene Dosage Affects Mammalian Meiotic Chromosome Structure and Behavior. PLoS Genet. 9, 1003241(2013).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1β-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37, 1351-1355 (2005).
  6. Zickler, D., Kleckner, N. Meiosis: Dances Between Homologs. Ann Rev Genet. 57, 1-63 (2023).
  7. Billmyre, K. K., et al. SYCP1 head-to-head assembly is required for chromosome synapsis in mouse meiosis. Sci Adv. 9, eadi1562(2023).
  8. Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171, 447-458 (2005).
  9. Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31, 385-390 (2002).
  10. Oh, S. D., Lao, J. P., Taylor, A. F., Smith, G. R., Hunter, N. RecQ Helicase, Sgs1, and XPF Family Endonuclease, Mus81-Mms4, Resolve Aberrant Joint Molecules during Meiotic Recombination. Mol Cell. 31, 324-336 (2008).
  11. Holloway, J. K., Booth, J., Edelmann, W., McGowan, C. H., Cohen, P. E. MUS81 generates a subset of MLH1-MLH3-independent crossovers in mammalian meiosis. PLoS Genet. 4, e1000186(2008).
  12. Edelmann, W., et al. Mammalian MutS homologue 5 is required for chromosome pairing in meiosis. Nat Genet. 21, 123-127 (1999).
  13. Kneitz, B., et al. MutS homolog 4 localization to meiotic chromosomes is required for chromosome pairing during meiosis in male and female mice. Genes Dev. 14, 1085-1097 (2000).
  14. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13, 493-504 (2012).
  15. Capalbo, A., Hoffmann, E. R., Cimadomo, D., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Human female meiosis revised: new insights into the mechanisms of chromosome segregation and aneuploidies from advanced genomics and time-lapse imaging. Hum Reprod Update. 23, 706-722 (2017).
  16. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365, 1466-1469 (2019).
  17. Gruhn, J. R., Hoffmann, E. R. Errors of the Egg: The Establishment and Progression of Human Aneuploidy Research in the Maternal Germline. Ann Rev Genet. 56, null(2022).
  18. Soygur, B., et al. Intercellular bridges coordinate the transition from pluripotency to meiosis in mouse fetal oocytes. Sci Adv. 7, eabc6747(2021).
  19. Bowles, J., et al. Retinoid Signaling Determines Germ Cell Fate in Mice. Science. 312, 596-600 (2006).
  20. Bullejos, M., Koopman, P. Germ cells enter meiosis in a rostro-caudal wave during development of the mouse ovary. Mol Reprod Dev. 68, 422-428 (2004).
  21. Borum, K. Oogenesis in the mouse: A study of the meiotic prophase. Exp Cell Res. 24, 495-507 (1961).
  22. Grive, K. J., Freiman, R. N. The developmental origins of the mammalian ovarian reserve. Development. 142, 2554-2563 (2015).
  23. Hu, M., et al. PRC1-mediated epigenetic programming is required to generate the ovarian reserve. Nat Commun. 13, 4510(2022).
  24. Drabent, B., Bode, C., Bramlage, B., Doenecke, D. Expression of the mouse testicular histone gene H1t during spermatogenesis. Histochem Cell Biol. 106, 247-251 (1996).
  25. Goetz, P., Chandley, A. C., Speed, R. M. Morphological and temporal sequence of meiotic prophase development at puberty in the male mouse. J Cell Sci. 65, 249-263 (1984).
  26. Solari, A. J. The spatial relationship of the X and Y chromosomes during meiotic prophase in mouse spermatocytes. Chromosoma. 29, 217-236 (1970).
  27. Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
  28. Tarkowski, A. K. An Air-Drying Method for Chromosome Preparations from Mouse Eggs. Cytogenetics. 5, 394-400 (2008).
  29. Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
  30. Sun, X., Cohen, P. E. Studying Recombination in Mouse Oocytes. Mammalian Oocyte Reg Meth Protoc. , 1-18 (2013).
  31. Evans, C. W., Robb, D. I., Tuckett, F., Challoner, S. Regulation of meiosis in the foetal mouse gonad. Development. 68, 59-67 (1982).
  32. Horan, T. S., et al. The DNA helicase FANCJ (BRIP1) functions in double strand break repair processing, but not crossover formation during prophase I of meiosis in male mice. PLoS Genet. 20, e1011175(2024).
  33. Wood, A. J., et al. CNTD1 is crucial for crossover formation in female meiosis and for establishing the ovarian reserve. J Cell Biol. 224, e202401021(2025).
  34. Horan, T. S., et al. Replacement Bisphenols Adversely Affect Mouse Gametogenesis with Consequences for Subsequent Generations. Curr Biol. 28, 2948-2954.e3 (2018).
  35. Lee, C., Oh, J. S. Novel BRCA1-PLK1-CIP2A axis orchestrates homologous recombination-mediated DNA repair to maintain chromosome integrity during oocyte meiosis. Nuc Acid Res. 53, gkae1207(2025).
  36. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biol Reprod. 71, 1142-1149 (2004).
  37. Wojtasz, L., et al. Mouse HORMAD1 and HORMAD2, Two Conserved Meiotic Chromosomal Proteins, Are Depleted from Synapsed Chromosome Axes with the Help of TRIP13 AAA-ATPase. PLoS Genet. 5, e1000702(2009).
  38. Kogo, H., et al. Differential phosphorylation of two serine clusters in mouse HORMAD1 during meiotic prophase I progression. Exp Cell Res. 440, 114133(2024).
  39. Jiao, X., et al. Aberrant activation of chromosome asynapsis checkpoint triggers oocyte elimination. Nat Commun. 16, 2260(2025).
  40. Cloud, V., Chan, Y. L., Grubb, J., Budke, B., Bishop, D. K. Rad51 Is an Accessory Factor for Dmc1-Mediated Joint Molecule Formation During Meiosis. Science. 337, 1222-1225 (2012).
  41. Lan, W. H., et al. Rad51 facilitates filament assembly of meiosis-specific Dmc1 recombinase. Proc Natl Acad Sci. 117, 11257-11264 (2020).
  42. Hinch, A. G., et al. The Configuration of RPA, RAD51, and DMC1 Binding in Meiosis Reveals the Nature of Critical Recombination Intermediates. Mol Cell. 79, 689-701.e10 (2020).
  43. Snowden, T., Acharya, S., Butz, C., Berardini, M., Fishel, R. hMSH4-hMSH5 recognizes Holliday Junctions and forms a meiosis-specific sliding clamp that embraces homologous chromosomes. Mol Cell. 15, 437-451 (2004).
  44. Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. The DNA Damage Checkpoint Eliminates Mouse Oocytes with Chromosome Synapsis Failure. Mol Cell. 67, 1026-1036.e2 (2017).
  45. Premkumar, T., et al. Genetic dissection of crossover mutants defines discrete intermediates in mouse meiosis. Mol Cell. 83, 2941-2958.e7 (2023).
  46. Polani, P. E., Crolla, J. A., Seller, M. J., Moir, F. Meiotic crossing over exchange in the female mouse visualised by BUdR substitution. Nature. 278, 348-349 (1979).
  47. Imai, H. T., Moriwaki, K. A re-examination of chiasma terminalization and chiasma frequency in male mice. Chromosoma. 85, 439-452 (1982).
  48. Kanda, N., Kato, H. Analysis of crossing over in mouse meiotic cells by BrdU labelling technique. Chromosoma. 78, 113-121 (1980).
  49. Hultén, M., Lawrie, N. M., Laurie, D. A. Chiasma-based genetic maps of chromosome 21. Am J Med Genet. 37, 148-154 (1990).
  50. Lawrie, N. M., Tease, C., Hultén, M. A. Chiasma frequency, distribution and interference maps of mouse autosomes. Chromosoma. 104, 308-314 (1995).
  51. Speed, R. M. The effects of ageing on the meiotic chromosomes of male and female mice. Chromosoma. 64, 241-254 (1977).
  52. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139, 1941-1946 (2012).
  53. Sebestova, J., Danylevska, A., Dobrucka, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11, 3011-3018 (2012).
  54. Hassold, T. J., Hunt, P. A. Missed connections: recombination and human aneuploidy. Prenatal Diagnos. 41, 584-590 (2021).
  55. Oliver, T. R., et al. New Insights into Human Nondisjunction of Chromosome 21 in Oocytes. PLoS Genet. 4, e1000033(2008).
  56. Ghosh, S., Feingold, E., Dey, S. K. Etiology of Down syndrome: Evidence for consistent association among altered meiotic recombination, nondisjunction, and maternal age across populations. Am J Med Genet A. 149A, 1415-1420 (2009).
  57. Wang, S., et al. Inefficient crossover maturation underlies elevated aneuploidy in human female meiosis. Cell. 168, 977-989.e17 (2017).
  58. Shin, Y. H., McGuire, M. M., Rajkovic, A. Mouse HORMAD1 Is a Meiosis I Checkpoint Protein That Modulates DNA Double-Strand Break Repair During Female Meiosis. Biol Reprod. 89, 29(2013).
  59. Kogo, H., et al. HORMAD1-dependent checkpoint/surveillance mechanism eliminates asynaptic oocytes. Genes Cells. 17, 439-454 (2012).
  60. Ward, J. O., et al. Mutation in Mouse Hei10, an E3 Ubiquitin Ligase, Disrupts Meiotic Crossing Over. PLoS Genet. 3, e139(2007).
  61. Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
  62. Hodges, C. A., Hunt, P. A. Simultaneous analysis of chromosomes and chromosome-associated proteins in mammalian oocytes and embryos. Chromosoma. 111, 165-169 (2002).
  63. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome Spreads with Centromere Staining in Mouse Oocytes. Mammal Oocyte Regul Method Protoc. , 203-212 (2013).
  64. Yun, Y., Ito, M., Sandhu, S., Hunter, N. Cytological Monitoring of Meiotic Crossovers in Spermatocytes and Oocytes. Homologous Recomb Method Protoc. , 267-286 (2021).

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Réimpressions et autorisations

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Complexe synapton malrecombinaison m iotiquemarquage par immunofluorescencesynapsis chromosomiqueformation de crossoversmaturation des ovocytesvaluation de l aneuplo diedynamique chromosomique
Préparation de la propagation des chromosomes méiotiques à partir d’ovocytes de souris pour l’évaluation de la synapse et de la recombinaison
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