Article de méthode

Développement de lignées organoïdes dérivées de souris à partir de cellules épithéliales de trompes de Fallope pour la modélisation du carcinome de l’ovaire séreux de haut grade

DOI :

10.3791/68753

⸱

6 août 2025

 ,  , 
1Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center, NYU Grossman School of Medicine, NYU Langone Health

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole détaille le développement de modèles murins de carcinome séreux de l’ovaire séreux de haut grade (HGSOC) in vitro et in vivo. De la dérivation d’organoïdes murins de trompes de Fallope, leur modification génétique pour récapituler la génétique HGSOC humaine, et leur introduction dans la bourse ovarienne de souris syngéniques pour le développement in vivo de tumeurs.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une modélisation efficace des maladies dans des environnements réalistes est cruciale pour améliorer notre compréhension de diverses pathologies. À cet égard, les organoïdes offrent un environnement plus fidèle que leurs homologues bidimensionnels classiques in vitro. De même, les modèles murins syngéniques permettent également aux chercheurs d’étudier des interactions tumeur-hôte plus complètes, comme avec le système immunitaire, in vivo. Nous présentons ici un protocole complet sur l’extraction de cellules épithéliales des trompes de Fallope, la cellule d’origine des carcinomes de l’ovaire séreux de haut grade (HGSOC), à partir d’une souris et les dérivons en tant que cultures organoïdes primaires, ainsi que leur culture in vitro et leur entretien. Ensuite, nous décrivons comment utiliser des techniques de génie génétique, telles que la surexpression de gènes lentiviraux ou rétroviraux, ainsi que la délétion du gène CRISPR-Cas9, pour modifier ces lignées et les transformer en tumoroïdes précancéreux. Nous expliquons également comment les utiliser pour la validation in vitro , via l’extraction de matériel génétique et la coloration par immunofluorescence. Enfin, nous indiquons comment injecter efficacement ces tumoroïdes dans la bourse ovarienne, le site autochtone de HGSOC, pour l’initiation tumorale.

Introduction

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Le carcinome séreux de l’ovaire de haut grade (HGSOC) reste une maladie mal comprise et très mortelle. Historiquement, le manque de modèles in vitro et in vivo fidèles qui représentent la biologie du HGSOC et la réponse thérapeutique a été un obstacle majeur au progrès. Par exemple, plusieurs études (sinon la plupart) ont utilisé des lignées cellulaires qui ne partagent pas les principales caractéristiques génomiques/génétiques du HGSOC, ce qui rend discutable la pertinence de leurs résultats 1,2,3,4. Par exemple, le modèle commun de souris syngénique ID8 est dérivé de l’épithélium de surface ovarienne (OSE) et est Trp53-wild de type5. En revanche, la plupart, sinon la totalité, du HGSOC apparaît dans l’épithélium des trompes de Fallope (FTE)6, et le HGSOC est presque universellement mutant ou silencieux TP537. Les chercheurs ont depuis tenté de rectifier cette lignée en y intégrant des mutations de Trp53 5, mais comme la mutation de Trp53 est un événement précoce de la pathogenèse de HGSOC, cette modification arrive peut-être trop tard dans la transformation de cette lignée cellulaire et ne représente probablement pas un développement normal de HGSOC.

Au cours de la dernière décennie, des tentatives ont été faites pour remédier à cet état de choses en générant des modèles plus réalistes de HGSOC. Par exemple, des modèles de souris génétiquement modifiés (GEMM) qui hébergent des mutations pertinentes sur les cellules de la lignée du tractus müllérien, souvent sous un système de cré-recombinase pour contrôler la pathogenèse, permettent aux chercheurs de mieux imiter la maladie in vivo 8,9,10. Malheureusement, ces modèles sont souvent compliqués à générer et peuvent présenter d’autres problèmes tels que la fuite de Cre, l’effet Cre ou les « effets de champ"11,12,13. À cet égard, les modèles organoïdes syngéniques apparaissent comme un compromis solide pour les chercheurs qui souhaitent mieux imiter la maladie à la fois in vitro et in vivo 14,15,16,17,18,19. En effet, si la plupart des modèles HGSOC disponibles et utilisés à l’heure actuelle sont des modèles bidimensionnels, ils ne peuvent malheureusement pas simuler correctement la complexité de la matrice extracellulaire (MEC), un élément crucial affectant la biologie cellulaire. Les organoïdes sont des tissus 3D auto-organisés, souvent générés à partir de cellules souches, qui peuvent recréer la complexité structurelle et fonctionnelle précoce d’un organe dans la boîte de Pétri20. Leur génération fonctionne généralement en suspendant des cellules uniques, qui sont pluripotentes, dans une matrice de membrane basale (BMM), telle que Matrigel21. In vitro, ces modèles sont comparativement plus précis pour récapituler les conditions in vivo que les modèles 2D. De même, en raison de leur nature syngénique, ces modèles sont capables d’être transplantés dans une souris dont le système immunitaire fonctionne pleinement, ce qui permet une reconstruction plus fidèle de la pathogenèse et du développement14,15. Il s’agit d’un avantage évident par rapport aux xénogreffes dérivées de patients, qui, tout en ayant la génétique tumorale la plus réaliste, nécessitent une greffe dans des modèles murins immunodéprimés.

Dans ce protocole, nous décrivons comment développer des modèles organoïdes syngéniques HGSOC. De la génération de la culture originale d’organoïdes FTE de type sauvage extraite d’une souris, leur génie génétique pour générer des génotypes informés de la maladie, jusqu’à leur transplantation dans la bourse ovarienne pour générer des tumeurs entièrement développées. Nous avons également inclus quelques protocoles supplémentaires pour faciliter les expériences courantes, telles que la coloration par immunofluorescence (IF) d’organoïdes in vitro et la conversion 2D de lignées cellulaires pour la production à grande échelle de cellules, comme pour les injections. Ce protocole s’adresse aux chercheurs qui souhaitent développer des modèles syngéniques organoïdes de HGSOC avec contrôle sur leur constitution génétique, avec l’intention particulière d’étudier la biologie de HGSOC dans des conditions in vitro plus réalistes ainsi que les interactions présentes dans le microenvironnement tumoral in vivo.

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Protocole

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Tous les prélèvements et procédures de tissus animaux ont été effectués de manière éthique sous l’approbation du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centre d’Alexandrie pour les sciences de la vie et du Centre de cancérologie Perlmutter de NYU Langone Health, New York, New York.

1. Préparation des matériaux

  1. Préparation des organoïdes murins (MOM)
    1. Préparez le milieu de base en combinant les éléments du tableau 1.
      REMARQUE : Le support est stable jusqu’à un mois à 4 °C.
  2. Préparation des supports 2D
    1. Combinez de l’EGF murin recombinant 50 ng/mL, de l’insuline-transferrine-sélénium (concentrations finales de 10 mg/L d’insuline, 5,5 mg/L de transferine, 6,7 μg/L), de sérum de veau fœtal inactivé à 3 % (FBS) et de pénicilline-streptomycine (100 U/mL), dans du DMEM (avec du pyruvate et une glycémie élevée).
  3. Préparation du mélange de digestion
    1. Combinez la collagénase/hyaluronidase (3000 U/mL de collagénase, 1000 U/mL d’hyaluronidase) avec le DMEM (avec pyruvate et glucose élevé) dans un rapport de 1:10. Préparez des aliquotes de 1 mL dans des microtubes de 1,5 mL. Conservez les aliquotes à -20 °C et décongelez-les sur de la glace.
    2. Préparez des aliquotes à usage unique de DNAse I (10 000 U/mL) et de Dispase (5 U/mL).
    3. Une fois qu’une aliquote de collagénase/hyaluronidase dans le DMEM est décongelée, ajoutez de l’ADN (10 μL, 100 unités) et de la dispase (25 μL, 0,1 unités).
      REMARQUE : Cette solution de digestion est également utile pour digérer jusqu’à 0,5 g de tumeur.
  4. Gestion BMM
    1. Stockez BMM à -80 °C à long terme. Pour éviter la congélation et la décongélation du BMM, préparer des aliquotes de 1 mL dans des tubes de 1,5 mL. Décongelez une aliquote en la plaçant sur de la glace pendant 2 h, ou toute la nuit à 4 °C.
      REMARQUE : BMM se solidifiera à température ambiante (RT). Par conséquent, il est recommandé de toujours conserver le tube de BMM sur de la glace ou sur un support de tube froid. Utilisez des pointes de pipette pré-refroidies dans un congélateur à -20 °C pendant au moins 2 h.

2. Isolement des cellules de l’ETP de souris

  1. Décongelez une aliquote de BMM, de l’enzyme TrypLE Express préchauffée et une plaque à 24 puits à 37 °C (conservez la plaque dans l’incubateur pendant 24 h pour de meilleurs résultats). Ensuite, préparez la zone d’opération : outils pour la dissection et le nettoyage des tissus sur le microscope de dissection, plaque avec PBS + P/S froid et mélange de digestion tiède.
  2. Euthanasier des souris femelles C57BL/6J par asphyxie au dioxyde de carbone. Effectuer la méthode d’euthanasie secondaire (luxation cervicale) comme l’exige l’IACUC.
  3. Disséquez et retirez l’ovaire et la trompe de Fallope et transférez-les dans une boîte de Pétri stérile contenant DMEM + P-S à 4 °C. À l’aide d’un microscope à dissection, une fine paire de pinces et de ciseaux permet d’éliminer la quantité résiduelle de graisse de l’ovaire et d’isoler la trompe de Fallope (infundibulum et partie de l’ampoule distale) de l’ovaire et de l’utérus.
    REMARQUE : Veillez à ne pas toucher la peau ou les cheveux de la souris avec les outils pour éviter la contamination microbienne.
  4. Transférez le tissu dans le tube contenant le mélange de digestion complet et utilisez des ciseaux fins pour hacher la trompe de Fallope en petits morceaux (<0,5 mm). Incuber pendant 40-50 min à 37 °C.
  5. Après dissociation, centrifuger les cellules à 350 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Ajouter 500 μL de TrypLE Express préchauffé. Incuber pendant 15 min à 37 °C.
  6. Trypsinisation de trempe avec 500 μL de FBS à 3 % dans DMEM (milieu 2D). Filtrez le mélange à travers une passoire de 70 μm dans un nouveau microtube. Essorer pendant 5 min à 350 g et jeter le surnageant.
  7. Remettre en suspension la pastille cellulaire (à peine visible selon le nombre de FT utilisés) dans 12,5 μL de milieu murin organoïde et incuber brièvement sur de la glace. Mélangez avec 37,5 μL de BMM glacé et ensemencez tout le volume (50 μL) au fond d’un puits d’une plaque préchauffée à 24 puits.
  8. Placez la plaque à 37 °C pendant au moins 20 min, mais pas plus de 48 h, pour régler le BMM. Attention à ne pas déranger les dômes lors du transfert de la plaque dans l’incubateur.
  9. Ajoutez 500 μL de MOM préchauffé dans chaque puits en pipetant doucement le milieu sur le côté du puits. N’ajoutez jamais de support directement sur le dôme, car cela pourrait causer des dommages ou un détachement. Placez le couvercle sur la plaque de culture et incubez à 37 °C et 5 % de CO2.

3. Entretien des organoïdes murins dérivés de l’ETP

  1. Changement de support
    1. À l’aide d’une pointe stérile non filtrée de 10 μL, aspirez le média par le fond du puits pendant que la plaque est maintenue à une inclinaison de 45°. Si le dôme se détache de la plaque, aspirez soigneusement le média par le haut du puits tandis que le dôme détaché se trouve par le bas.
    2. Ajouter lentement 750 μL de MOM, préchauffé à 37 °C, avec l’embout pressé contre la paroi latérale du puits.
    3. Changez de support tous les 2 à 3 jours ou jusqu’à ce qu’il passe du rose au jaune. Si le milieu jaunit moins de 24 h après l’avoir changé, les organoïdes sont prêts à être passés.
  2. Organoïdes en train de passer
    1. Retirer le support et bien laver chaque produit avec 500 μL de PBS froid (4 °C). Aspirez le PBS et ajoutez 500 μL de solution de récupération cellulaire froide (4 °C) directement dans le dôme BMM pour le dissoudre. Continuez à pipeter jusqu’à ce que le BMM soit entièrement dissous et transférez-le dans un tube de 1,5 ml.
    2. Placez le tube sur de la glace pendant 30 min et remettez la plaque dans l’incubateur pour qu’elle reste chaude. Si vous utilisez une nouvelle plaque, assurez-vous qu’elle est préchauffée à 37 °C pendant 24 h.
      REMARQUE : Si vous passez plus de 2 dômes de 50 μL, comme lors des expansions décrites ci-dessous, l’incubation sur glace peut devoir être prolongée pendant plus de 30 minutes pour de meilleurs résultats.
    3. Centrifuger à 350 g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant avec précaution sans aspirer la pastille et laver avec 500 μL de PBS froid. Répétez cette étape trois fois.
      REMARQUE : Si une centrifugeuse froide n’est pas disponible, laissez le tube refroidir entre les lavages en le plaçant sur de la glace ou une grille froide.
    4. Après le dernier lavage, centrifuger à 350 g pendant 5 min, retirer le surnageant et ajouter 500 μL d’enzyme TrypLE Express préchauffée (37 °C). Pour éviter de perdre des cellules lors du pipetage, faites glisser le tube contre la grille de la grille d’aération dans le capot de culture tissulaire pour homogénéiser les cellules.
    5. Incuber le tube à 37 °C pendant 30 à 60 min.
      REMARQUE : Le temps peut être adapté en fonction du génotype des organoïdes et du temps de passage, car certains peuvent nécessiter une trypsinisation plus longue pour produire des suspensions unicellulaires.
    6. Arrêtez le processus de dissociation cellulaire en ajoutant 500 μL de DMEM + 3 % HI FBS et mélangez en pipetant de haut en bas jusqu’à ce que la solution soit homogénéisée.
    7. Centrifuger à 350 × g pendant 5 min et aspirer le surnageant jusqu’à ce qu’il reste ~20 μL de volume. Retirez manuellement le surnageant restant à l’aide d’une pipette P20 plutôt qu’à l’aide d’un aspirateur, car il est courant d’aspirer la pastille à cette étape.
    8. Remettez les cellules en suspension dans 100 μL de MOM froid (4 °C) et mesurez la concentration cellulaire. Préparez les dilutions cellulaires comme vous le souhaitez et conservez-les sur de la glace. Ensuite, mélangez avec du BMM glacé à l’aide d’embouts de pipette préalablement stockés à -20 °C.
      REMARQUE : Il est recommandé de préparer deux dômes de 50 μL à 2 × 105 cellules/mL, où le rapport MOM / BMM est de 1:4. Par conséquent, vous devriez avoir ; 25 μL de cellules dans MOM à 8 × 105 cellules/mL, et 75 μL de BMM pour un total de 100 μL, répartis en 2 dômes. De cette façon, on ensemencera effectivement 1 × 104 cellules par dôme.
    9. Ensemencez chaque dôme de 50 μL au milieu du puits d’une plaque préchauffée de 24 puits. Placez la plaque dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant au moins 30 min pour permettre au BMM de se solidifier. Ajouter 500 μL de MOM à 37 °C comme indiqué précédemment à l’étape 3.1.2 et remettre la plaque dans l’incubateur.
  3. Expansion
    1. Pour étendre la culture de cellules organoïdes à une plaque (préchauffée) à 6 puits, préparer cinq dômes de 50 μL à 8 × 105 cellules/mL. Remettez les cellules en suspension dans un total de 62,5 μL de MOM et mélangez-les avec 187,5 μL de BMM glacé et ensemencez les 5 dômes dans le même puits.
    2. Déplacez la plaque dans l’incubateur pendant 30 minutes pour permettre au BMM de se solidifier. Ajouter 2 mL de MOM à 37 °C comme indiqué précédemment à l’étape 3.1.2 et remettre la plaque dans l’incubateur. Changez de milieu si nécessaire jusqu’à ce que les cellules soient confluentes.
      REMARQUE : Pour prélever des cellules en vue de leur transfutation, utilisez 1 mL de solution de récupération cellulaire au lieu de 500 μL et incubez sur de la glace pendant 45 min au lieu de 30 min.
  4. Cryoconservation
    1. Pour le stockage à long terme des organoïdes, passage comme décrit aux étapes 3.2.1 à 3.2.7. Ensuite, remettre en suspension dans 250 μL de milieu de congélation organoïde (80 % de MOM, 10 % de FBS et 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO)) et transférer dans un cryotube. Congeler 1 × 105 cellules par flacon cryogénique.
    2. Conservez le tube dans un récipient de congélation cryogénique (par exemple, Mr. Frosty) et laissez-le refroidir dans un congélateur à -80 °C. Pour un stockage à long terme, conservez les cellules dans un stockage d’azote liquide ou dans un congélateur à -150 °C.

4. Modification génétique d’organoïdes murins dérivés d’ETP pour développer de nouvelles lignées cellulaires

  1. Transduction par spinoculation (lentivirale ou rétrovirale)
    1. Préparez un mélange de 25 μL de MOM et de 75 μL de BMM et ajoutez-le à un puits d’une plaque froide (4 °C, permet au BMM de « mouiller » complètement le puits) à 48 puits. Incuber à 37 °C pendant 30 à 60 min pour permettre au BMM de se solidifier avant d’ensemencer les cellules.
    2. Obtenez des cellules uniques dérivées d’organoïdes (étape 3.2.5) et ensemencez environ 2 × 104 sur le BMM. Ajouter 200 μL de MOM chaud (37 °C) et incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 48 h.
    3. Ajoutez le virus à la concentration souhaitée. Déterminer le MOI à titre expérimental ; un moment d’inertie approximatif inférieur à 30 % est suggéré.
      REMARQUE : Les organoïdes sont particulièrement difficiles à infecter par rapport aux lignées cellulaires 2D, et s’attendent à de faibles MOI, même à des titres viraux élevés. Cellules de centrifugation à 600 × g pendant 60 min à 32 °C. Remettez la plaque dans l’incubateur une fois la spinoculation terminée.
    4. Après 8 h, retirez le milieu et ajoutez un mélange de 25 μL de MOM et 75 μL de BMM sur le dessus des cellules pour les « prendre en sandwich » dans du BMM, permettant aux organoïdes de se développer naturellement en 3 dimensions. Laissez le BMM se solidifier en plaçant la plaque dans l’incubateur pendant 30 à 60 min. Ajoutez ensuite 250 μL de MOM chaud (37 °C).
    5. Une fois que les cellules sont confluentes, procédez à leur passage comme détaillé à l’étape 3.2, en élargissant tout le volume des cellules en 2 dômes dans une plaque à 24 puits.
      REMARQUE : Si vous utilisez une sélection d’antibiotiques, il est recommandé d’effectuer la sélection directement dans le puits de 48 puits, à partir de 48 heures après la spinoculation initiale. Si vous effectuez un tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), il est recommandé d’étendre davantage sur une plaque à 6 puits comme décrit ci-dessus pour acquérir suffisamment de cellules. Des temps de trypsinisation plus longs (1 h) sont également recommandés pour garantir l’unicité des cellules avant de filtrer les échantillons pour l’écoulement.
  2. Transformation par CRISPR-Cas9 basé sur l’électroporation
    REMARQUE : Pour les concentrations et la préparation du complexe ribonucléoprotéique (RNP), reportez-vous au Guide de réparation dirigé par homologie IDT (pp. 9-11)22. Cependant, omettez le HDR Enhancer V2 pour les knock-outs, car il n’est recommandé que pour l’édition du génome nécessitant une recombinaison homologue.
    1. Préparer une suspension unicellulaire dérivée d’organoïdes (étape 3.2.7). Lavez avec du PBS et mesurez la concentration cellulaire. Transvaser une suspension cellulaire contenant une quantité de l’ordre de grandeur 104 (1 × 104 à 9 × 104 cellules) dans un tube de 1,5 mL.
    2. Centrifuger à 350 × g pendant 5 min. Retirer le surnageant et le remettre en suspension dans 10 μL de tampon d’édition du génome. Si >1 × 104 cellules sont nécessaires pour l’électroporation, préparer un volume suffisant pour les électroporations en série, en veillant à ce que chaque 10 μL contienne 1 × 104 à 9 × 104 cellules.
    3. À l’aide d’un système de pipette d’électroporation, prélever 10 μL de la suspension de la cellule, en veillant à ce qu’aucune bulle ne soit introduite. Électroporat dans les conditions suivantes : tension de 1200 V, durée d’impulsion de 20 ms, 4 impulsions au total. Placez les cellules dans un tube avec du MOM froid.
    4. Une fois les cellules électroporées, centrifuger toute la suspension à 350 × g pendant 5 min. Remettez la pastille en suspension dans du MOM et du BMM glacés (rapport 1:4), en préparant suffisamment pour ensemencer un dôme par cycle d’électroporation (1 dôme pour 1 104 cellules).
    5. Placez la plaque dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant au moins 30 min pour permettre au BMM de se solidifier. Ajouter 500 μL de MOM à 37 °C comme indiqué précédemment à l’étape 3.1.2 et remettre la plaque dans l’incubateur.
  3. Sélection de clones uniques
    1. Pour obtenir un clone provenant d’une seule cellule, il faut acheminer les cellules comme décrit ci-dessus, mais ensemencer 50 à 100 cellules par dôme (4 × 103 à 8 × 103 cellules/mL en suspension cellulaire avant de mélanger avec du BMM).
    2. Changez de MOM tous les 3 jours. Vérifiez que les organoïdes poussent correctement et notez ceux qui sont bien séparés des autres.
    3. Lorsque les organoïdes atteignent une taille discernable (environ 500 μm), utilisez un microscope optique pour identifier 4 à 5 grands organoïdes suffisamment séparés.
      REMARQUE : Ils doivent être visibles à l’œil nu, mais il est utile de marquer le bas de la plaque avec un marqueur à pointe fine en dessinant un cercle autour de la zone de la plaque où se trouve l’organoïde.
    4. À l’aide d’une pipette de 20 μL dans le capot stérile, insérez délicatement l’embout dans le BMM et aspirez l’organoïde unique (aspirez un volume d’environ 12,5 μL). Placez l’organoïde dans un tube de prélèvement de 1,5 mL contenant 500 μL de MOM.
    5. Centrifuger à 350 × g pendant 5 min. Retirer le surnageant et le remettre en suspension dans 500 μL de TrypLE Express Enzyme. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
    6. Tremper la réaction de dissociation cellulaire avec 500 μL de FBS à 3 % dans du DMEM (milieu 2D) et centrifuger à 350 × g pendant 5 min. Retirez très soigneusement le surnageant, remettez-le en suspension dans 12,5 μL de MOM froid, mélangez-le avec 37,5 μL de BMM glacé et ensemencez toute la suspension en un seul dôme de 50 μL dans une plaque de 24 puits, comme décrit ci-dessus.
    7. Placez la plaque dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant au moins 30 min pour permettre au BMM de se solidifier. Ajouter 500 μL de MOM à 37 °C comme indiqué précédemment à l’étape 3.1.2 et remettre la plaque dans l’incubateur.
    8. Changement de média tous les 3-4 jours et passage lorsque le dôme est confluent.

5. Dérivation de lignées cellulaires 2D à partir d’organoïdes

  1. Culture cellulaire de transition
    1. Commencer à partir d’une suspension unicellulaire, comme après le passage d’organoïdes.
    2. Procédez comme vous le feriez pour ensemencer une plaque à 6 puits (étape 3.3), mais en utilisant une plaque pré-refroidie (4 °C pendant 24 h) à la place. Ensemencez les dômes sur une plaque à 6 puits conservée à 4 °C pendant la nuit et laissez reposer la plaque dans le capot stérile pendant 5 à 10 minutes avant de l’introduire dans l’incubateur.
      REMARQUE : Cette étape permettra aux cellules de se déposer doucement au fond de la plaque pour s’adapter à une condition de croissance 2D tout en ayant accès aux composants ECM de BMM.
    3. Incuber la plaque à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 30 min, puis ajouter 2 mL de MOM à 37 °C. Changez de support si nécessaire.
    4. Lorsque les organoïdes atteignent la confluence, le passage est décrit aux étapes 3.2.1 à 3.2.7. Après le dernier lavage PBS du puits pour éliminer les restes de BMM, ajoutez 2 ml de média 2D préchauffé dans le puits.
      REMARQUE : La suppression du BMM ne supprimera pas les cellules attachées au puits, et celles-ci peuvent désormais envahir librement le reste du puits tout en s’adaptant aux conditions/supports 2D.
    5. Une fois qu’une suspension unicellulaire a été obtenue avec les cellules qui sont restées dans le BMM, ensemencez la moitié du volume de cellules, en répétant l’étape 5.1.2. Ajoutez l’autre moitié du puits d’origine, en laissant plus de cellules s’ensemencer, ce qui accélérera la confluence.
    6. Changez de support 2D après 24 h pour supprimer les cellules non attachées.
      REMARQUE : Il doit y avoir beaucoup de cellules non attachées, car les cellules cultivées dans le BMM ne sont pas habituées aux substrats en plastique et ne se fixent pas facilement.
    7. Répétez l’étape 5.1.4. Ensuite, mettez en suspension tout le volume des cellules dans 4 ml de milieu 2D et ensemencez 2 ml dans chacun des puits précédemment utilisés. Changez de média 2D tous les 3-4 jours.
  2. Culture cellulaire 2D pour l’expansion
    1. Une fois que les cellules atteignent environ 80 % de confluence, procédez au premier passage.
    2. Pour le passage, aspirez le milieu, lavez une fois avec 1 mL de PBS et ajoutez 1 mL de trypsine à 0,25 %. Incuber les cellules à 37 °C pendant 5 à 10 min.
      REMARQUE : Différentes lignées cellulaires peuvent avoir des propriétés adhérentes différentes, ce qui fait varier la durée de trypsinisation. Vérifiez au microscope si les cellules se sont détachées avant de passer à l’étape suivante. Un léger tapotement de la plaque de culture cellulaire avec la main peut aider à détacher les cellules.
    3. Une fois que toutes les cellules se sont détachées, tremper la dissociation avec DMEM + 10 % FBS et centrifuger à 350 × g pendant 5 min.
    4. Pour la première expansion (lorsque 80-100 % de confluent), réensemencez à un rapport de 1:1. Répétez l’étape 5.1.6 et changez de support 2D tous les 2-3 jours.
    5. Lors de la deuxième expansion (80-100 % de confluence), ensemencer toutes les cellules dans une boîte de 100 mm en les remettant en suspension dans 10 mL de milieu 2D à 37 °C. Répétez l’étape 5.1.6 et changez de support tous les 2 à 3 jours.
      REMARQUE : Ce processus prend beaucoup de temps et peut prendre jusqu’à un mois complet. Si vous travaillez avec des lignées cellulaires qui ont des gènes intégrés viraux pour la surexpression des protéines, il est recommandé de garder des antibiotiques de sélection présents dans le milieu de croissance tout au long du processus. Si le marqueur est une protéine fluorescente, effectuez le tri cellulaire activé par fluorescence dès que possible (c.-à-d. à la fin de l’expansion de la boîte de 100 mm).
  3. Cryoconservation
    1. Pour le stockage de ces cellules, passage comme décrit aux étapes 5.2.1 à 5.2.3. Ensuite, mettez en suspension ~1 × 106 cellules dans 1 mL de milieu de congélation 2D, composé de 80 % de milieu 2D, 10 % de FBS et 10 % de DMSO, et transférez-les dans un cryotube. Stockez les cellules en suivant l’étape 3.5.2.

6. Validation des lignées d’organoïdes

  1. Isoler le matériel génétique des organoïdes
    1. À partir d’une suspension unicellulaire, ensemencez deux dômes au double de la densité cellulaire habituelle (1 × 106 cellules/mL). Changez de maman le jour 3.
    2. Le 5e jour, retirez le support, lavez-le une fois avec du PBS et ajoutez 350 μL de tampon de lyse préféré directement sur les dômes. Après 5 min d’incubation à RT-ou jusqu’à ce que le BMM soit dissous, transférez le lysat dans un tube de 1,5 mL.
    3. Pour une utilisation à long terme, conservez le lysat à -80 °C. Sinon, procédez au protocole d’extraction de l’ADN et/ou de l’ARN en utilisant la technique d’extraction préférée ou un kit commercial.
  2. Coloration par immunofluorescence (FI)
    1. Pour préparer les cellules, passage comme décrit aux étapes 3.2.1 à 3.2.5. Remettre en suspension dans un mélange de 37,5 μL de MOM et de 112,5 μL de BMM glacé (assez pour trois dômes de 50 μL qui agiront comme des réplicats biologiques). Suivez l’étape 3.2.6 et changez de support le jour 3 et le jour 5.
    2. Le jour 7, aspirez le MOM et lavez les cellules avec 500 μL de PBS. Fixez chaque dôme séparément en ajoutant 500 μL de solution de paraformaldéhyde (PFA) préchauffée (37 °C) à 4 % dans du PBS directement sur le dôme. Incuber à 37 °C pendant 60 min jusqu’à ce que le BMM soit dissous.
    3. À l’aide d’une pointe de pipette P1000 à alésage large (si vous n’en avez pas, coupez simplement une pointe P1000 ordinaire à environ 0,5 cm de l’extrémité fine), prélevez les organoïdes dans 4 % de PFA et transférez le volume dans un tube de 1,5 ml.
      REMARQUE : L’utilisation d’une pointe de pipette standard entraînera la rupture des organoïdes.
    4. Attendre 2 à 3 min que les organoïdes coulent au fond du tube. Aspirez 4 % de PFA (tout en laissant une quantité de volume sûre pour ne pas aspirer les organoïdes) et ajoutez 500 μL de PBS pour laver les organoïdes. Répétez cette étape deux fois de plus, pour un total de 3 lavages.
      REMARQUE : Il est préférable d’attendre que les organoïdes coulent au fond plutôt que la centrifugation pour préserver la forme de l’organoïde.
    5. Pour un stockage à long terme (4 à 6 semaines), conserver les organoïdes dans du PBS à 4 °C. Pour procéder à la coloration, perméabiliser avec du PBS + 1 % de Triton-X pendant 30 min à RT. Laver une fois avec du PBS.
    6. Bloc avec PBS + 0,2 % Triton-X + 4 % FBS + 1 % sérum de souris pendant 60 min à RT. Laver une fois avec du PBS et laisser 100 μL de volume dans le tube.
    7. Préparez le tampon de travail pour la coloration des anticorps : PBS + 0,2 % Triton-X, 0,4 % FBS, 0,1 % sérum de rat. Ce tampon fonctionnera pour les anticorps primaires et secondaires.
    8. Pour préparer la coloration primaire de l’anticorps, calculez que la dilution soit deux fois plus concentrée que la dilution réelle nécessaire. Préparez suffisamment de solution pour ajouter 100 μL d’anticorps aux 100 μL de PBS restants dans chaque tube. Par exemple, pour une dilution initiale de 1:1000, préparer 100 μL de solution 1:500.
    9. Incuber toute la nuit à 4 °C. Ensuite, laver trois fois avec 500 μL de PBS.
    10. Préparez la coloration secondaire de l’anticorps comme expliqué à l’étape 6.2.8. Incuber pendant 1 h à RT.
      REMARQUE : À partir de cette étape, assurez-vous de couvrir la zone de travail avec du papier d’aluminium/une boîte sombre préférée pour éviter le photoblanchiment des anticorps fluorescents.
    11. Une fois la coloration secondaire terminée, laver trois fois avec 500 μL de PBS. Retirez autant de liquide que possible du tube après le dernier lavage pour préparer l’échantillon au montage. Utilisez une pipette de 20 μL pour éviter d’aspirer les organoïdes.
    12. À l’aide d’une pointe de pipette à alésage large ou coupée, ajoutez 20 μL de support de montage de votre choix et homogénéisez bien la solution, tout en évitant les bulles.
    13. Placez une goutte d’organoïdes dans la solution de montage sur une lamelle rectangulaire. À l’aide d’une pince, placez une lamelle circulaire sur le dessus de la goutte, tout en évitant les bulles, et laissez sécher toute la nuit dans l’obscurité à RT. Répétez cette étape sur la même lame si plus d’un échantillon par lame doit être placé.
    14. Ajoutez 20 μL supplémentaires de support de montage directement sur la lamelle de recouvrement circulaire. Maintenant, créez un « sandwich » de montage en retournant la lamelle rectangulaire à 180° et en la plaçant sur la lame de microscope. Laisser sécher à l’obscurité à RT pendant au moins 8 h.
      REMARQUE : La lame doit être dans l’ordre suivant de bas en haut : lame de microscope, feuille de couverture circulaire, organoïdes, lame de couverture rectangulaire. Cela crée des conditions d’imagerie optimales.

7. Développement de modèles tumoraux chez la souris

  1. Préparation des cellules
    1. Décongelez un flacon de cellules 2D de votre choix dans un milieu 2D. Laissez ces cellules croître et s’étendre jusqu’à une plaque de 150 mm. Si les cellules ont des marqueurs de sélection d’antibiotiques, sélectionnez-les avant l’injection pour assurer une population pure des cellules souhaitées.
    2. Pour 5 injections chez la souris, élargissez les cellules en deux plaques de 150 mm. Lorsque les plaques sont confluentes à 80 %, prélevez les cellules en suivant les étapes 5.2.2 à 5.2.3. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu sérique réduit Opti-MEM I et mesurer la concentration cellulaire.
      REMARQUE : Chaque injection contient 4 × 106 cellules ; Cependant, il est recommandé de se préparer à une injection supplémentaire pour tenir compte du volume mort des seringues. Dans ce cas, préparez 24 × 106 cellules au lieu de 20 × 106 cellules.
    3. Placez tout le volume cellulaire pour toutes les injections dans un tube de 1,5 ml. Préparez un total de 44 μL par injection, composé de 1 partie de cellules dans de l’Opti-MEM I non supplémenté et de 1 partie de BMM glacé. Par exemple, pour 24 × 106 cellules (6 injections), remettre en suspension dans 132 μL d’Opti-MEM I et 132 μL de BMM.
    4. Mélangez soigneusement les cellules et maintenez-les sur de la glace jusqu’à ce que l’injection soit effectuée.
  2. Préparation à l’intervention
    1. Expulsez les bulles d’air du volume mort de la seringue (insuline U-100 28 G) avec du PBS froid.
    2. À l’aide des cellules du tube de 1,5 ml, préparez cinq injections de 40 μL en chargeant lentement la seringue pour éviter de lyser les cellules en raison des forces de cisaillement à l’intérieur de l’aiguille. Garder sur la glace jusqu’à ce que les souris soient sous sédation.
    3. Une fois que tout est prêt pour les injections, placez les seringues à côté de la lampe chauffante afin que le BMM puisse se réchauffer et devenir visqueux, facilitant ainsi l’injection et la greffe. Ne les placez pas directement sous la lampe chauffante, car le BMM trop solidifié ne traversera pas la seringue de manière appropriée. En général, travaillez vite pour éviter que cela ne se produise.
  3. Injection intrabursive (IBI) dans l’ovaire
    1. Anesthésie une souris C57BL/6J à l’aide de kétamine (100 mg/mL). Administrer 0,1 mL pour 10 g de poids corporel par injection intrapéritonéale.
      REMARQUE : Les jeunes souris femelles n’ont souvent besoin que d’injections de 0,2 ml, mais peuvent en avoir besoin de plus si elles sont plus âgées. Cela fournira une anesthésie d’une durée de 20 à 40 minutes, mais ne fournira aucune analgésie.
    2. Placez la souris dans une cage qui a été réchauffée par la lampe chauffante.
      REMARQUE : Ne placez pas les souris directement sous la lampe chauffante, car cela peut provoquer une nécrose de la queue et une hyperthermie, qui peuvent être mortelles.
    3. Une fois la première souris complètement anesthésiée, à l’aide d’une technique aseptique, faites une incision de <1 cm le long du flanc d’une souris C57BL/6J au niveau de la région de l’abdomen et au-dessus de la cuisse. Assurez-vous de passer par l’épiderme et l’hypoderme avant d’atteindre la région de la bourse.
    4. Retirez délicatement l’ovaire (facilement trouvé par le coussinet adipeux qui y est attaché). Prenez l’une des seringues préparées et injectez lentement les cellules à travers le coussinet adipeux juste derrière l’ovaire, à travers l’ovaire lui-même, dans le sac de l’oviducte.
      REMARQUE : Une injection réussie verra le ballon de sac d’oviducte avec BMM. Le mélange risque également de s’écouler sur tout le coussinet adipeux, ce qui est normal.
    5. Remettez soigneusement l’ovaire dans la bourse et fermez l’incision à l’aide d’agrafes chirurgicales ou en cousant.
    6. Remettez la souris dans la cage. Utilisez une lampe chauffante pour garder les souris au chaud pendant qu’elles récupèrent après l’opération jusqu’à ce qu’elles soient semi-conscientes (>15 min). Le lendemain, vérifiez la souris pour vérifier qu’aucune septicémie ne s’est produite pendant la nuit.

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Résultats

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La figure 1 présente un schéma résumant le flux de travail pour la génération et la validation du cancer de l’ovaire HGSOC. Ce processus commence par l’extraction du tissu de la trompe de Fallope d’une souris femelle de type sauvage C57BL/6J (figure 2A). Il est recommandé de commencer avec un généreux morceau de tissu pour assurer une bonne collecte. L’utilisation d’un microscope à dissection permet d’isoler avec précision la tr...

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Discussion

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Malgré des progrès significatifs dans la recherche en oncologie, le HGSOC reste le type le plus agressif de malignité gynécologique et la principale cause de mortalité parmi tous les cancers de l’ovaire23,24. Au fur et à mesure que la recherche en oncologie gynécologique a évolué, les modèles utilisés devraient également évoluer. En effet, de nombreuses lignées cellulaires modèles historiques de cancer de l’ovaire se sont révélée...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été soutenue par les National Institutes of Health sous le numéro de bourse R01(CA257507). Les schémas des figures ont été créés à l’aide de BioRender. Nous tenons à remercier le Dr Benjamin Neel pour son soutien tout au long de ce projet, le Dr Shuang Zhang pour le développement du protocole original et le Dr Kiyomi Araki pour son aide dans son optimisation.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,25 % de trypsina, 0,1 % d’EDTA dans le HBSS sans calcium, magnésium et bicarbonate de sodiumCorning25053CI
A83-01Tocris Bioscience2939
DMEM avancé/F12Gibco12-634-028
Âgée C57BL/6J (femme)Le laboratoire Jackson000664
Mini kit AllPrep ADN/ARNQIAGEN80204Pour l’extraction d’ADN/ARN
Alt-R S.p. Cas9-GFP V3Technologies ADN intégrées10008100
Anticorps anti-Ki67Abcamab15580
Système AutoClipOutils scientifiques finement12020-00Pour la fermeture de plaie après l’IBI
Complément de B-27 (50 fois), sans sérumGibco17-504-001
Blasticidine HCl (10 mg/mL) 50 mgInvivoGenANT-BL-05
Albumine sérique bovineSigma AldrichA9647
Buffer RLT PlusQIAGEN1053393Lyser les cellules avant l’extraction de l’ADN/ARN
Solution de récupération cellulaireCorning354253
Collagénase/HyaluronidaseSTEMCELL Technologies07912
CoraLite 594-Phalloidin (rouge)ProteintechPF00003
Verre de couverture 15CIR-1Fisherbrand12-545-83
Verre de couverture 24 mm & aigu ; 40 mm-1Fisherbrand12-544-12
Supplément N-2 CTS (Cell Therapy Systems)GibcoA1370701
DAPIRoche10236276001
Désoxyribonucléase I (DNAse I) provenant du pancréas bovinSigma AldrichD5025
Lait écrémé DifcoBecton Dickinson232100
DispaseSTEMCELL Technologies07913
DMEM avec L-glutamine, 4,5 g/L de glucose et pyruvate de sodiumCorning10013CV
DNase I recombinante, sans RNaseRoche04716728001
La solution tamponnée phosphate de DulbeccoSigma AldrichD8537
Dumont #5 - Pinces recouvertes de céramiqueOutils scientifiques finement11252-50Pour la dissection des trompes de Fallope
Sérum fœtal bovinCorning35-010-CVInactivation thermique à 56 °C ; C pendant 60 min.
Ciseaux fins - ToughCutOutils scientifiques finement14058-09Pour la prélèvement de trompes de Fallope et l’incision IBI
Antibiotique sélectif à la génétiqueine (G418 Sulfate) (50 mg/mL)Gibco10131027
Supplément GlutaMAX (100x)Gibco35-050-061
Anticorps secondaire adsorbé croisé contre l’IgG de lapin (H+L) de chèvre, Cyanine3InvitrogenA10520
Pince GraefeOutils scientifiques finement11053-10Pour la manipulation de tissus
Tampon HEPESCorning25060CI
Protéine recombinante R-Spondine 1 humainePeproTech120-38
Seringue à insuline, U-100 0,5 mL 0,36 mm (28 G)x 12,7 mm (1/2")BDBD329461
Insuline-Transferrin-Sélénium (ITS -G) (100x)Gibco41-400-045
L-Glutamine 200 mM (100x)Gibco25-030-081
Matrice membranaire de socle GFR MatrigelCorning356231BMM
Protéine recombinante EGF de sourisPeproTech315-09
Protéine recombinante FGF-base de la sourisPeproTech450-33
Protéine recombinante de Noggin de sourisPeproTech250-38
Protéine recombinante Wnt-3a de la sourisPeproTech315-20
Supplément N2Gibco17502048
Amide de N-acétylcystéineSigma AldrichA0737
Système d’électroporation Neon NxTInvitrogenNEON1SPour l’électroporation CRISPR-Cas9
Système d’électroporation Neon NxT 10-&mu ; Kit L avec tubes à un canalInvitrogenN1025Consommables pour l’électroporation, y compris le tampon d’édition du génome
NicotinamideSigma AldrichN3376
Sérum normal pour sourisInvitrogen10410
Sérum normal pour ratsSTEMCELL Technologies13551
Médium sérique réduit Opti-MEM IGibco31985070
Anticorps polyclonal PAX8Proteintech10336-1-AP
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)Gibco15-140-122
PuromycineSigma AldrichP8833
Selectfrost 25 mm & aigu ; 75 mm et aigu ; 1,0 mmFisherbrand12-550-003
Triton X-100Bioréactifs de FisherBP151
TrypLE Express Enzyme (1x), sans phénol rougeGibco12-604-013
Ciseaux à ressort Vannas - Tranchant de 4 mmOutils scientifiques finement15019-10Pour la dissection des trompes de Fallope
Y27632STEMCELL Technologies72304Inhibiteur de la rho-kinase (ROCK)   ;

Références

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Organo des de trompes de Fallopemod le tumoral murinculture d organo desg nie g n tiqued l tion par CRISPR Cas9surexpression lentiviraleinteraction avec le syst me immunitaireinjection dans la bourse ovarienne

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