Un flux de travail vérifié pour le traitement des données MiRNA-Seq et l’analyse bioinformatique à l’aide de R

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour analyser les données de miRNA-Seq à l’aide de R. Le flux de travail permet aux chercheurs d’explorer les réseaux régulés par les miARN et leur importance dans diverses questions biologiques et cliniques. Ce travail vise à servir de guide pratique pour les chercheurs novices et expérimentés dans le domaine de la bioinformatique des miARN.

Abstract

Les microARN (miARN) sont des régulateurs post-transcriptionnels critiques qui influencent un large éventail de processus physiologiques et pathologiques. Avec l’avancement des technologies de séquençage à haut débit, miRNA-Seq est devenu un outil puissant pour profiler les modèles d’expression des miARN. Cependant, l’interprétation fiable de ces données nécessite un pipeline d’analyse standardisé et reproductible. Ici, nous présentons un flux de travail vérifié pour le traitement des données miRNA-Seq et l’analyse bioinformatique à l’aide de R. Ce protocole englobe toutes les étapes essentielles, y compris le prétraitement des données brutes, le contrôle qualité, l’alignement, la quantification, la normalisation, l’analyse d’expression différentielle, la prédiction de cibles, l’enrichissement fonctionnel et la construction de réseaux réglementaires. Conçu pour la flexibilité et la transparence, le flux de travail intègre des packages R largement adoptés et prend en charge l’annotation spécifique à l’espèce et la personnalisation modulaire. De plus, les utilisateurs sont guidés pour effectuer une interprétation biologique en aval en exploitant des bases de données organisées et des outils de visualisation tels que Cytoscape. Ce protocole permet non seulement une analyse statistique robuste, mais aussi des informations significatives sur les interactions miARN-ARNm et leurs rôles dans les mécanismes de la maladie. Il est particulièrement bien adapté aux chercheurs novices et expérimentés qui mènent des études de biomarqueurs de miARN, de modélisation de maladies ou d’études multi-omiques intégratives.

Introduction

Les microARN (miARN) sont de courtes molécules d’ARN non codantes qui influencent significativement l’expression des gènes en agissant au stade post-transcriptionnel¹. Ils fonctionnent généralement en se liant à des séquences complémentaires dans les régions 3' non traduites (UTR) des ARN messagers cibles (ARNm), conduisant à la dégradation de l’ARNm ou à la répression traductionnelle¹. Au cours des deux dernières décennies, les miARN ont été de plus en plus reconnus comme des régulateurs centraux de divers processus biologiques, notamment la prolifération cellulaire, la différenciation,....

Protocol

REMARQUE : Les matériaux avec des liens vers des logiciels sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparer des échantillons d’ARN et des banques de séquences

REMARQUE : Effectuez l’extraction et le séquençage de l’ARN en dehors de ce flux de travail informatique. Il existe plus d’une façon d’analyser les données de séquençage des miARN. Cette section fournit le contexte d’une pratique.

1. Extraire l’ARN total : Extraire l’ARN total des échantillons biologiques à l’aide d’un kit optimisé pour l’isolement de petits ARN (par exemp....

Results

Nous avons téléchargé la matrice d’expression des microARN à partir de GSE133530 et effectué directement une analyse d’expression différentielle. Nous avons fourni un exemple de script R analytique pour l’ensemble de données dans le fichier supplémentaire 1. L’ensemble de données a effectué un profilage global des miARN sur 16 kystes rénaux de différentes tailles (kystes minimes : moins de 1 à 5 ml, n = 10 ; kystes moyens : entre 10 et 25 ml, n = 4 ; gros kystes : supérie.......

Discussion

L’analyse des données miRNA-Seq présente des défis distincts en raison de la petite taille et de la redondance des lectures, ce qui rend essentiel un contrôle qualité rigoureux et un prétraitement. L’une des étapes les plus importantes du flux de travail est le découpage de l’adaptateur. Étant donné que les miARN ont une longueur d’environ 22 nucléotides, les séquences adaptatrices peuvent facilement dominer les lectures si elles ne sont pas correctement éliminées. L’absence d’un réglage.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent-021827 Microréseau de miARN humain	Agilent	/	Une puce commerciale pour le profilage des microARN d’échantillons humains
Nœud papillon	Université Johns Hopkins	http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml	Un outil logiciel pour aligner les lectures de séquençage sur les longues séquences de référence
clusterProfiler (package R)	Bioconducteur	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	Un package R conçu pour l’analyse d’enrichissement fonctionnel et la visualisation de données biologiques à haut débit.
Cutadapt	Libre	https://cutadapt.readthedocs.io	Outil en ligne de commande qui supprime les séquences d’adaptateur, les amorces, les queues poly-A et autres fragments indésirables des lectures de séquençage à haut débit.
Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	Une plate-forme logicielle open-source conçue pour la visualisation et l’analyse de réseaux biologiques complexes.
DESeq2 (package R)	Bioconducteur	https://bioconductor.org/packages/DESeq2/	Un package R conçu pour l’analyse différentielle de l’expression génique des données de comptage
EnhancedVolcano (forfait R)	Bioconducteur	https://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/	; Un package R conçu pour créer des graphiques de volcans de qualité publication.
FastQC	Babraham Bioinformatique	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/	Un outil de contrôle qualité open source pour les données de séquençage à haut débit.
featureCounts	Sous-lecture / SourceForge	http://subread.sourceforge.net/	Programme utilisé pour compter les lectures associées à des caractéristiques génomiques
Nombre de HTSeq	Paquet Python	https://htseq.readthedocs.io	Outil en ligne de commande qui compte le nombre de lectures de séquençage à haut débit alignées qui chevauchent des caractéristiques génomiques telles que des gènes ou des exons. Je
Puce d’expression de microARN Illumina Human v2	Illumina  ;	/	Une puce commerciale pour le profilage des microARN d’échantillons humains
multiMiR (package R)	Bioconducteur	https://bioconductor.org/packages/multiMiR/	Un package R qui fournit la plus grande collection intégrée de microARN prédits et validés expérimentalement. Cibler les interactions ainsi que leurs associations avec des maladies et des médicaments.
Org. Hs.eg.db (package R)	Bioconducteur	https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/	Un progiciel d’annotation conçu pour la recherche en génomique humaine (Homo sapiens).
Logiciel R	Projet R	https://www.r-project.org/	Un projet open-source pour le calcul statistique
Rstudio	Posit PBC	/	Un environnement de développement intégré permet d’être plus productif avec R et Python
SAMtools	Libre	http://www.htslib.org/	Progiciel de manipulation des données de séquençage de nouvelle génération (NGS).