Article de méthode

Moules imprimés en 3D personnalisés pour l’imagerie et le développement cardiaque du poisson-zèbre

775 vues

⸱

DOI :

10.3791/68768

⸱

15 août 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Mississippi

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici une méthode utilisant une imprimante 3D stéréolithographique peu coûteuse pour créer des moules afin de faciliter le montage reproductible d’embryons de poisson-zèbre pour des études d’imagerie. En utilisant cette méthode, nous avons créé des moules pour l’imagerie de la morphogenèse cardiaque chez les embryons de poisson-zèbre.

Résumé

Le montage d’embryons est l’un des défis techniques auxquels sont confrontés les chercheurs lorsqu’ils entreprennent un projet d’imagerie. Les embryons doivent être orientés de manière reproductible de sorte que le tissu d’intérêt soit accessible à un objectif de microscope pendant toute la période d’imagerie. Pour surmonter ce défi, les chercheurs peuvent intégrer des embryons dans des milieux visqueux ou créer des boîtes et des moulages spécialisés pour maintenir les embryons dans l’orientation souhaitée pendant l’imagerie. Ici, nous décrivons une méthode d’utilisation d’une imprimante 3D stéréolithographique (SLA) peu coûteuse pour fabriquer des moules réutilisables qui créent des puits d’agarose dans lesquels les embryons peuvent être montés pour l’imagerie. Ces puits d’agarose constituent un moyen fiable d’orienter plusieurs embryons pour l’imagerie. Cette méthode comprend un cadre de conception qui peut être facilement personnalisé pour une variété de tissus, d’organismes et de défis d’imagerie. En utilisant cette méthode, nous avons créé des moules pour l’imagerie du développement cardiaque chez le poisson-zèbre pour les microscopes droits et inversés. En utilisant des matériaux et des équipements accessibles, cette méthode permet aux chercheurs de créer facilement des moules spécifiques à leurs besoins de montage.

Introduction

La visualisation de la dynamique cellulaire au sein d’un animal intact est essentielle pour comprendre les pathologies des maladies congénitales et les processus fondamentaux de développement et d’homéostasie. Cette visualisation englobe l’imagerie à plusieurs échelles spatiales pour identifier la dynamique physiologique dans l’ensemble d’un organisme ainsi qu’aux niveaux tissulaire, cellulaire et subcellulaire. Les modalités d’imagerie utilisées pour visualiser la dynamique cellulaire vont de l’étude d’immunofluorescence d’échantillons fixes à l’imagerie en accéléré d’échantillons vivants. Ces modalités d’imagerie nécessitent de maintenir les échantillons intacts dans des orientations spécifiques, de sorte qu’une région d’intérêt soit accessible à l’objectif du microscope.

Les embryons de poisson-zèbre sont un organisme modèle idéal pour les études d’imagerie en raison de leur transparence optique, de leur traçabilité génétique, de leur fécondation externe et de leur origine vertébrée. Cependant, le montage d’embryons de poisson-zèbre dans une orientation spécifique de manière cohérente et reproductible a représenté un défi permanent. Le montage est particulièrement difficile pour la visualisation du développement cardiaque chez les embryons de poisson-zèbre, car la morphogenèse cardiaque se produit dans différents plans1.

De multiples approches ont été développées pour relever les défis du montage d’embryons pour l’imagerie. L’une des méthodes les plus simples consiste à monter des embryons de poisson-zèbre entre deux lamelles avec des couches de ruban adhésif entre les lamelles pour éviter l’écrasement. Cette méthode permet d’obtenir des images à la fois sur des microscopes inversés et droits2. Les embryons de poisson-zèbre peuvent également être montés dans un milieu ou un gel très visqueux, tel que la méthylcellulose ou l’agarose à basse température de fusion 0,1-0,8 %, pour maintenir les embryons dans des orientations spécifiques 2,3,4. Ces approches à faible débit fonctionnent bien pour de nombreux projets d’imagerie. Cependant, il peut être difficile d’assurer l’intégrité de l’embryon et d’obtenir de manière reproductible des orientations spécifiques. Pour augmenter le débit d’imagerie et faciliter le montage, des puits régulièrement espacés peuvent être créés à partir d’agarose solidifiée dans une boîte d’imagerie 5,6,7,8. Pour faciliter la création de ces puits d’agarose, des moules en plastique ont été créés 9,10,11. Bien que ces moules puissent être appliqués à l’imagerie le long des axes dorsal-ventral-latéral standard10,12, ils sont souvent conçus pour des défis d’imagerie spécifiques, tels que l’utilisation dans des plaques à 96 puits13 ou pour la détection du premier battement cardiaque14. Dans des cas spécialisés, des boîtes d’imagerie entières ont été créées 5,15,16. Par exemple, une chambre microfluidique (nommée ZEBRA) en PDMS facilite à la fois l’imagerie et l’exposition des embryons à des produits chimiques17. Ces moules sont souvent fabriqués à partir de silicone ou usinés à partir de lucite 10,18,19. Cependant, l’avènement d’imprimantes tridimensionnelles (3D) relativement peu coûteuses a démocratisé la création de moules personnalisés qui sont utilisés pour créer des puits d’imagerie d’agarose.

L’impression 3D, également appelée fabrication additive ou en couches, consiste à produire un objet 3D à partir d’une conception numérique par l’addition et la fusion séquentielles de couches individuelles20,21. La stéréolithographie (SLA) utilise la lumière ultraviolette (UV) pour durcir une résine liquide sensible à la lumière en couches séquentielles22. Les imprimantes SLA sont économiques, rapides et très précises et peuvent être utilisées avec une variété de résines, y compris celles qui offrent une surface lisse16. Le processus commence avec un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO), où les modèles numériques de l’objet peuvent être conçus de novo ou modifiés à partir de conceptions préexistantes. Le modèle numérique est ensuite virtuellement découpé en couches imprimables. À l’aide de ces couches numériques, une imprimante 3D construit l’objet, couche par couche. Ici, nous présentons une méthode et un cadre pour la conception et la création personnalisées de moules d’imagerie à l’aide d’une imprimante 3D SLA à faible coût disponible dans le commerce. De plus, nous utilisons ce cadre pour créer des moules permettant d’imager les différentes étapes du développement cardiaque du poisson-zèbre sur des microscopes inversés ou verticaux et pour imager les embryons de poisson-zèbre le long de leurs axes latéraux, dorsaux ou ventraux.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Les protocoles, les expériences et les résultats décrits ici ont été menés conformément aux réglementations et aux directives sur le bien-être animal, ainsi qu’au Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Mississippi (protocole #24-008).

Pour créer des puits d’agarose de différentes formes dans lesquels les embryons peuvent être orientés pour l’imagerie, nous avons développé une conception qui utilise une base attachée à des chevilles (Figure 1A). La forme de ces chevilles (voir la flèche pointant vers les chevilles en violet sur la figure 1A) peut être personnalisée pour orienter les embryons de différents stades de développement et pour se concentrer sur différents tissus. Ci-dessous, nous décrivons un protocole permettant de personnaliser ces chevilles et d’utiliser ce système pour créer des puits d’agarose.

1. Création d’un moule d’imagerie sur mesure

  1. Créez un croquis préliminaire de l’échantillon ou de l’embryon positionné dans l’orientation souhaitée. Tenez compte de l’orientation souhaitée de l’embryon et si le microscope à utiliser contient des objectifs droits ou inversés. Tenez également compte de la taille de la boîte, du nombre d’embryons à monter et de l’espacement entre eux.
  2. Mesurez les dimensions de l’embryon (p. ex., longueur, largeur et hauteur) à l’aide d’un microscope combiné à un outil logiciel tel que FIJI23. Utilisez ces dimensions pour vous assurer que les embryons s’insèrent dans les puits créés par les chevilles.
  3. Identifiez une forme qui correspond à la géométrie de l’embryon. À l’aide des mesures de l’étape 1.2 en combinaison avec un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO), créez un ancrage qui se rapproche de la forme et de la taille de l’échantillon.
    REMARQUE : Cette forme peut être créée dans un logiciel de CAO de base en combinant et en superposant différentes formes prédéfinies, ou la forme peut être créée de novo à l’aide d’un logiciel de CAO avancé. De plus, il est possible de modifier l’une de nos chevilles prédéfinies (voir le fichier supplémentaire 1). L’effilement de la cheville, comme dans la figure 1A, peut aider à orienter les embryons pour s’assurer que le tissu d’intérêt est le plus proche de l’objectif.
  4. Combinez la conception de la cheville avec la conception de la base :
    1. Dans un logiciel de CAO, ajoutez une cheville conçue sur mesure à l’une des bases prédéfinies (Fichier supplémentaire 1). Ensuite, dupliquez et placez uniformément les chevilles dans toute la base pour une imagerie à haut débit à l’aide des outils d’un programme de CAO avancé. Assurez-vous que toutes les chevilles atteignent la même hauteur loin de la base.
  5. Préparez le design pour l’impression 3D :
    1. Transférez la conception de moule personnalisée ou l’un des moules préconçus (fichier supplémentaire 2) vers un logiciel de découpage, qui convertit la conception en commandes pour l’imprimante 3D.
    2. Dans le logiciel de trancherie, assurez-vous de faire pivoter la conception de manière à ce que les composants critiques tels que les chevilles soient positionnés à l’écart de l’étage de l’imprimante. Pour le support de lamelle, qui est imprimé sur une imprimante FDM (Fused Deposition Modeling), positionnez l’impression horizontalement.
      REMARQUE : La rotation du motif empêchera le gauchissement, ce qui peut se produire lorsque des pièces délicates sont positionnées près de l’étape d’impression.
    3. Ajoutez des supports dans le logiciel de découpe pour vous assurer que les aspects délicats du moule ne se cassent pas pendant l’impression. La fonction de placement automatique des supports dans le logiciel, associée à la conservation manuelle, assure une bonne répartition des supports sans grands espaces. Une stratégie de remplissage à 100 % est utilisée pour créer un moule solide.
    4. Imprimez plusieurs pièces simultanément en utilisant un seul fichier STL contenant tous les moules ou en organisant des fichiers STL individuels à l’aide du logiciel de découpage.
  6. Impression
    REMARQUE : Les imprimantes SLA sont notre type d’imprimante 3D préféré pour les moules d’imagerie en raison de leur faisabilité, de leur précision et de leur création de surfaces lisses. Une imprimante FDM est utilisée pour fabriquer le support de lamelle car elle crée des impressions légères et plus rigides que les imprimantes SLA.
    1. Commencez par les paramètres d’impression suivants et optimisez à partir de là : hauteur de couche de 0,05 mm ; 5 Nombre de couches inférieures ; temps d’exposition de 2,5 s ; Temps d’exposition du fond de 35 s ; Levage inférieur de 5 mm et distance de levage ; vitesse de levage par le bas de 60 mm/min ; vitesse de levage de 80 mm/min ; et vitesse de rétraction de 210 mm/min.
      REMARQUE : Les paramètres d’impression devront probablement être optimisés par l’utilisateur car ils dépendent du type de résine, de la température ambiante et du modèle d’imprimante.
  7. Après l’impression, lavez les moules à l’eau, retirez les supports et placez les moules sous lumière UV dans une hotte de culture tissulaire pour assurer la solidification de la résine.
    REMARQUE : Il est important de laver et de durcir soigneusement les moules pour éviter que la résine ne s’écaille et que le moule ne se déforme.
    Des gants et une blouse de laboratoire doivent être portés lors de la manipulation de la résine non polymérisée et du nettoyage des moules, car la résine non polymérisée peut être un irritant cutané. Les imprimantes SLA utilisent la lumière UV pour durcir la résine, ce qui peut être nocif pour les yeux et la peau. Assurez-vous que la chambre d’impression est bien fermée et évitez de regarder directement la source de lumière UV.

2. Une procédure d’utilisation de moules imprimés en 3D pour créer des puits d’agarose

  1. Fabrication de puits d’agarose
    1. Réaliser des puits d’agarose en dissolvant 2 % (g/mL) d’agarose dans un milieu E3 (1,578 mM NaCl, 0,169 mM KCl, 0,249 mM CaCl2*2H2O, 0,161 mM MgSO4*7H2O). Placez un moule au centre d’un plat inférieur à lamelles avec la flèche pointant vers le bas vers le puits (voir Figure 2A,B). Pipeter 750 μL d’agarose/E3 fondu à 2 % le long de la moitié du périmètre du moule d’imagerie (voir Figure 2C).
      REMARQUE : L’agarose fondue doit être non visqueuse mais suffisamment froide pour être pipetée sans créer de bulles. Nous utilisons des plats de 60 mm avec un puits inférieur de 30 mm, tandis que pour les moules conçus pour les microscopes verticaux, un plat standard de 60 mm peut être utilisé. Un protocole légèrement différent est utilisé pour le moule de criblage (voir ci-dessous).
    2. Pipeter une autre quantité de 750 μL d’agarose/E3 fondu à 2 % le long de l’autre moitié du périmètre du moule d’imagerie (voir la figure 2D).
    3. Attendez 5 à 7 min que l’agarose se solidifie, en observant la transition d’un liquide clair à un gel bleu opaque (voir Figure 2E).
    4. Ajouter une fine couche d’agarose fondue autour du périmètre de l’agarose centrale solidifiée.
      REMARQUE : Bien qu’elle ne soit pas strictement requise, cette étape permet d’ancrer l’agarose solidifié à la boîte et d’éviter le détachement induit par le support.
    5. Placez l’anneau extérieur (figure supplémentaire S1B) sur l’ensemble du moule à agarose avec la flèche pointée vers l’agarose (voir figure 2F).
    6. Tout en maintenant doucement l’anneau extérieur vers le haut, tirez doucement vers le haut sur le moule intérieur pour le détacher de l’agarose (voir Figure 2G).
      REMARQUE : Pour éviter de casser ou d’endommager les puits d’agarose, n’appuyez pas trop fort sur la bague extérieure et ne tournez pas ou ne déplacez pas le moule intérieur lorsque vous tirez vers le haut.
    7. Retirez l’anneau extérieur, révélant les puits d’agarose dans le plat inférieur de la lamelle (Figure 2H).
    8. Inspectez les puits d’agarose au microscope pour confirmer la bonne taille et la bonne production.
      REMARQUE : Pour l’imagerie sur un microscope inversé, une fine pellicule d’agarose doit souvent être soulevée du fond du puits. Cela peut être fait avec des pinces.
  2. Protocole modifié pour l’utilisation du moule de criblage
    1. Versez de l’agarose fondu à 2 % / E3 dans la boîte de Pétri jusqu’à ce qu’elle soit à peu près à moitié pleine.
    2. Tenez le moule avec les chevilles vers le haut et pipetez de l’agarose/E3 fondu à 2 % sur les chevilles, jusqu’à ce qu’elles soient couvertes (~3 ml).
      REMARQUE : Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles en ne libérant que 90 % de l’agarose fondue qui a été aspirée dans la pipette.
    3. À l’aide d’un mouvement d’inclinaison, placez une extrémité, puis l’ensemble du moule avec les chevilles face vers le bas dans la boîte de Pétri contenant de l’agarose fondue (figure supplémentaire S2).
    4. Laisser l’agarose se solidifier pendant 5 à 7 min.
    5. Retirez délicatement le moule en utilisant la poignée pour soulever une extrémité, puis l’autre extrémité.

3. Montage d’embryons dans des puits d’agarose avec et sans agarose à basse température de fusion

  1. Déchorionner et anesthésier les embryons dans une solution de tricaïne de 200 μg/mL avant le montage.
    REMARQUE : Une solution de tricaïne de ~400 μg/mL est nécessaire pour arrêter les battements du cœur.
    1. Sans utiliser d’agarose à basse température de fusion : Remplissez la boîte d’imagerie avec 1x E3 et de la tricaïne (200 μg/mL), ajoutez des embryons anesthésiés déchorionnés dans la boîte d’imagerie, utilisez une pince pour placer et orienter les embryons dans les puits d’agarose, puis imagez (voir Figure 2I, J).
      REMARQUE : Étant donné que les pinces peuvent facilement endommager un embryon, un tisonnier embryonnaire dans lequel une ligne de pêche de 0,41 mm de diamètre est insérée dans un tube capillaire ou une pointe de pipette et fixée avec de la superglue peut êtreutilisée à la place.
    2. Utilisation d’agarose à basse température de fusion :
      REMARQUE : Bien que les moules soient conçus pour placer les embryons dans des orientations spécifiques, l’utilisation d’agarose à basse température de fusion pour maintenir les embryons en place peut garantir que les embryons ne dérivent pas pendant l’imagerie ou lors du transport de la boîte d’imagerie avec les embryons montés au microscope. Les étapes ci-dessous sont dérivées de notre précédent protocole6.
      1. Créez des tubes d’agarose à basse température en dissolvant 0,1 à 0,8 % d’agarose à basse température de fusion dans 5 mL de milieu E3 et en chauffant à 65-70 °C dans un bain-marie. De temps en temps, retournez le tube jusqu’à ce que l’agarose à basse température de fusion soit dissoute. Aliquote la solution d’agarose à basse température de fusion dans des tubes microfuges et placez-les sur un bloc thermique réglé à 42 °C. Laisser la solution s’équilibrer à 42 °C pendant au moins 1 h.
        REMARQUE : Il est généralement conseillé d’utiliser une solution d’agarose à basse température de fusion fraîchement préparée.
      2. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre de gros calibre, transférez un seul embryon dans un tube contenant la solution d’agarose à basse température de fusion. Pour éviter d’ajouter un excès de liquide à la solution d’agarose à basse température de fusion, ne transférez que l’embryon et le liquide qui l’entoure immédiatement. Transférez immédiatement l’embryon, qui est maintenant dans de l’agarose à bas point de fusion, dans l’un des puits d’agarose. Retournez la solution d’agarose à basse température de fusion dans le bloc chauffant pour la réutiliser.
      3. À l’aide d’une pince ou d’un tisonnier pour embryons (voir l’étape 3.1.1), placez l’embryon dans le puits pour l’imagerie.
      4. Répétez les étapes 3.1.2.2 à 3.1.2.3 pour les autres puits. Si les puits précédents commencent à s’assécher, utilisez une pipette p200 pour ajouter une petite quantité de E3 (~50-100 μL) sur le dessus du puits.
  2. Une fois que les embryons ont été montés dans tous les puits et que l’agarose à basse température de fusion s’est solidifiée, à l’aide d’une pipette, ajoutez lentement la solution de tricaïne/E3 dans la boîte d’imagerie.
  3. Après l’imagerie, extrayez soigneusement les embryons des puits à l’aide de pinces et laissez-les se développer davantage pour s’assurer que l’imagerie n’a pas causé de défauts de développement.
    REMARQUE : Les puits d’agarose peuvent être retirés de la boîte d’imagerie, qui peut être rincée et réutilisée. Le rinçage avec un nettoyant pour vitres disponible dans le commerce, puis plusieurs fois avec du ddH2O aide à éliminer les dépôts de sel sur les lamelles. Bien que nous n’ayons pas constaté de toxicité due à des traces résiduelles de nettoyant pour vitres, il est conseillé au chercheur de confirmer ces résultats en utilisant ses propres conditions de laboratoire.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Le protocole ci-dessus a été utilisé pour concevoir des moules pour l’imagerie de différents stades du développement cardiaque chez le poisson-zèbre, y compris la fusion cardiaque, la formation d’un tube cardiaque, l’orbite cardiaque et la formation d’une chambre. Étant donné que le développement cardiaque ne se produit pas le long des grands axes anatomiques de l’embryon, la forme des chevilles a été adaptée aux différents stades de développement afin de positionner correctement les embryons. Par exemple, le placement i...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de conception de moules imprimés en 3D qui créent des puits d’agarose qui peuvent faciliter le montage d’embryons ou de tissus pour des études d’imagerie. Ces moules peuvent être fabriqués pour l’imagerie avec des microscopes droits ou inversés, et les puits d’agarose fabriqués à l’aide de ces moules personnalisés peuvent être utilisés pour des applications d’imagerie allant des études d’immunofluorescence d’embryons fixes à l’imagerie timela...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Bloomekatz, en particulier Sasmitha Singh et Allison Holmes, ainsi que le noyau d’imagerie GlyCORE (soutenu par P20GM130460), le laboratoire IDEA de l’Université du Mississippi, le Dr Yiwei Han et le laboratoire Han, ainsi que les membres des communautés de glycoscience et de biologie du développement de l’Université du Mississippi. Ce travail est soutenu par un financement des NIH (R15HD108782 P20GM130460).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Imprimante 3D SLAELEGOOMARS 2 PRO
Agarose  ;Apex Bioresearch ; Genesee Scientific  ;20-102QD N’importequelle marque peut être remplacée par
Autodesk Fusion 360Autodesk Inc.https://www.autodesk.com/products/fusion-360/  ;Logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO) - plus avancé
Microscope droit Axio-ZoomZeissAxio Zoom.V16
ChituboxCBD-Techhttps://www.chitubox.com/Logiciel de trancheuse
Couverture Plat inférieur (plat de 60 mm avec puits inférieur de 30 mm)CellvisD60-30-1.5N
F59 Chaîne lourde de myosine (toutes les isoformes rapides)DHSBF59Dilution 1:50
Filaments FDMBambuPLA filaments
Imprimante FDMBambu BambuX1 Carbone FDMBuse d’extrudeuse 0,4 mm
ForcepsFisher16-100-121D’autres marques sont susceptibles de convenir
Chèvre anti-souris Alexa 488 ThermoFisher#A28175Dilution 1:300
ImarisAndor10.2Logiciel
Microscope confocal inverséLeicaLeica SP8 X
Agarose à basse température de fusionBiotechnologie d’orN° de catalogue : A-204-25D’autres marques sont susceptibles de convenir
Pompe à pipetteBel-ArtF37898
Résine pour imprimante SLAElegooElegoo P05BB028Photopolymère lavable à l’eau Résine V2.0
Ricinus communis agglutinine (RCA-120)Vector labs#RLK-2200 (kit de lectine)Dilution de 1:300
TinkerCADAutodesk Inc.  ;https://www.tinkercad.com/Logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO) -
TricaïneWestern Chemical, Inc.  ;ANADA #200-226
Injectinine de germe de blé (WGA)Vector labs#RLK-2200 (kit de lectine)Dilution 1:300
Pipette Pasteur en verre de gros calibre  ;Duran Wheaton Kimble (DWK)63A53WT
de base

Références

  1. Shrestha, R., Lieberth, J., Tillman, S., Natalizio, J., Bloomekatz, J. Using zebrafish to analyze the genetic and environmental etiologies of congenital heart defects. Adv Exp Med Biol. 1236, 189-223 (2020).
  2. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).
  3. Upadhyay, S., et al. A layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos. J Vis Exp. (155), e60321(2020).
  4. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  5. Cooper, M. S., D'Amico, L. A., Henry, C. A. Confocal microscopic analysis of morphogenetic movements. Methods Cell Biol. 59, 179-204 (1999).
  6. McCann, T., Shrestha, R., Graham, A., Bloomekatz, J. Using live imaging to examine early cardiac development in zebrafish. Methods Mol Biol. 2438, 133-145 (2022).
  7. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. J Vis Exp. (119), e55210(2017).
  8. Kleinhans, D. S., Lecaudey, V. Standardized mounting method of zebrafish embryos using a 3D-printed stamp for high-content, semi-automated confocal imaging. BMC Biotechnol. 19 (1), 68(2019).
  9. Alessandri, K., et al. All-in-one 3D printed microscopy chamber for multidimensional imaging, the universlide. Sci Rep. 7, 42378(2017).
  10. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. 546, 317-332 (2009).
  11. Wühr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W. III, Mitchison, T. J. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
  12. Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2013).
  13. Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnol. 14, 36(2014).
  14. Jia, B. Z., Qi, Y., Wong-Campos, J. D., Megason, S. G., Cohen, A. E. A bioelectrical phase transition patterns the first vertebrate heartbeats. Nature. 622 (7981), 149-155 (2023).
  15. Ellett, F., Irimia, D. Microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae. J Vis Exp. 130, e56498(2017).
  16. Tan, S., Zhu, X., Zartman, J. J., Deng, Q. Low-cost polyethylene terephthalate lamination microfluidics designs for multiplexed zebrafish imaging. J Vis Exp. (211), e67313(2024).
  17. Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish entrapment by restriction array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
  18. Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50 (5), 319-324 (2011).
  19. Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A four-well dish for high-resolution longitudinal imaging of the tail and posterior trunk of larval zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
  20. Bozkurt, Y., Karayel, E. 3D printing technology; methods, biomedical applications, future opportunities and trends. J Mater Res Technol. 14, 1430-1450 (2021).
  21. Murr, L. E. Frontiers of 3D printing/additive manufacturing: from human organs to aircraft fabrication. J Mater Sci Technol. 32 (10), 987-995 (2016).
  22. Gu, Z., Fu, J., Lin, H., He, Y. Development of 3D bioprinting: from printing methods to biomedical applications. Asian J Pharm Sci. 15 (5), 529-557 (2020).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. Dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development. J Vis Exp. (84), e50703(2014).
  25. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228 (1), 30-40 (2003).
  26. Bloomekatz, J., et al. Platelet-derived growth factor (PDGF) signaling directs cardiomyocyte movement toward the midline during heart tube assembly. eLife. 6, (2017).
  27. Cummings, R. D., et al. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. Ch 48, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 645-661 (2022).
  28. Gallagher, J. T., Morris, A., Dexter, T. M. Identification of two binding sites for wheat-germ agglutinin on polylactosamine-type oligosaccharides. Biochem J. 231 (1), 115-122 (1985).
  29. Yamamoto, K., Tsuji, T., Matsumoto, I., Osawa, T. Structural requirements for the binding of oligosaccharides and glycopeptides to immobilized wheat germ agglutinin. Biochemistry. 20 (20), 5894-5899 (1981).
  30. Wright, C. S., Jaeger, J. Crystallographic refinement and structure analysis of the complex of wheat germ agglutinin with a bivalent sialoglycopeptide from glycophorin A. J Mol Biol. 232 (2), 620-638 (1993).
  31. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
  32. Isogai, S., Lawson, N. D., Torrealday, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. Angiogenic network formation in the developing vertebrate trunk. Development. 130 (21), 5281-5290 (2003).
  33. Illi, J., et al. Translating imaging into 3D printed cardiovascular phantoms: a systematic review of applications, technologies, and validation. JACC Basic Transl Sci. 7 (10), 1050-1062 (2022).
  34. George, E., Liacouras, P., Rybicki, F. J., Mitsouras, D. Measuring and establishing the accuracy and reproducibility of 3D printed medical models. Radiographics. 37 (5), 1424-1450 (2017).
  35. Elegoo Mars 2 Pro Mono LCD 3D Printer. , https://us.elegoo.com/products/elegoo-mars-2-pro-mono-lcd-3d-printer (2025).
  36. Shrestha, R., et al. The myocardium utilizes a platelet-derived growth factor receptor α (PDGFRα)-phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signaling cascade to steer toward the midline during zebrafish heart tube formation. ELife. 12, e85930(2023).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Moules imprim s en 3Dmontage d embryonspuits d agaroseimpression st r olithographiquemicroscopes droitsmicroscopes invers sorientation tissulairemoules r utilisables
Vidéo bientôt disponible

Articles connexes