Ici, nous présentons un protocole pour préserver l’architecture artérielle humaine en infusant un gel stabilisateur tissulaire dans la lumière du vaisseau avant la sectionnement pour une analyse moléculaire ou histopathologique.
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Article de méthode
In vitro Perfusion intraluminale de gel : une approche avancée pour l’analyse microscopique des artères de résistance humaine
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les artères de résistance, qui comprennent les petites artères et les artérioles, jouent un rôle essentiel dans la régulation de la pression artérielle et de la perfusion tissulaire. Le dysfonctionnement de ces artères peut entraîner diverses affections cardiovasculaires telles que l’hypertension, l’athérosclérose et l’insuffisance cardiaque, ainsi que des affections neurovasculaires. L’examen des artères de résistance humaine est crucial pour comprendre les mécanismes des maladies cardiovasculaires et développer des stratégies thérapeutiques ciblées. Cette étude présente une méthode innovante pour préparer des artères de résistance humaines isolées en infusant un gel stabilisateur tissulaire dans la lumière, préservant ainsi leur architecture native et leur intégrité cellulaire. Des tissus omentaux humains ont été obtenus de patients subissant des chirurgies abdominales, et de petites artères de résistance (100 à 300 m de diamètre) ont été isolées par micro-dissection minutieuse. Les artères ont ensuite été canulées, pressurisées dans une chambre de culture et fixées avec du formol tamponné à 10 %. Un gel stabilisateur tissulaire a été infusé dans la lumière de l’artère canulée, qui a été laissée se solidifier pour préserver la structure tridimensionnelle. Des analyses histologiques, immunohistochimiques et d’expression génique ont été effectuées pour évaluer la préservation des artères. Les coupes histologiques ont révélé l’intégrité structurelle bien préservée et l’architecture naturelle des artères, maintenant des couches endothéliales et musculaires lisses bien définies. La coloration immunohistochimique a montré une localisation distincte de marqueurs tels que CD31 et l’actine musculaire α-lisse. L’hybridation in situ a révélé des modèles d’expression génique spécifiques, fournissant des informations sur les mécanismes moléculaires. Cette méthode avancée de perfusion intraluminale de gel offre des avantages significatifs, permettant une imagerie avancée et une analyse complète de la structure artérielle, du remodelage et des interactions cellulaires dans les états sains et malades. Cette méthode a le potentiel d’améliorer les diagnostics cliniques et les stratégies thérapeutiques pour les maladies vasculaires, fournissant ainsi un outil précieux pour faire progresser la recherche en biologie vasculaire.
Introduction
Les artères de résistance régulent le flux sanguin et la pression et subissent des changements significatifs dans des conditions telles que l’hypertension, le diabète et l’athérosclérose 1,2,3,4,5. L’examen des artères de résistance humaines est essentiel pour comprendre les pathologies cardiovasculaires et développer des thérapies ciblées 6,7,8,9,10. Les méthodes traditionnelles d’étude des vaisseaux sanguins ont souvent conduit à des artefacts et à une perte d’intégrité tridimensionnelle 10,11,12,13,14,15. Pour remédier à ces limitations, nous présentons une méthode innovante pour préparer des artères de résistance humaines isolées en infusant un gel dans la lumière, préservant ainsi leur structure approximative ex vivo et/ou in vivo.
Cette technique d’infusion intraluminale de gel maintient l’architecture naturelle des artères, permettant une représentation plus précise de leur état physiologique. En stabilisant la structure des vaisseaux, cette méthode facilite l’examen détaillé du remodelage artériel, de la structure cellulaire, des microdomaines, des jonctions hétérocellulaires et de l’expression des gènes/protéines à travers différentes couches cellulaires. Cette technique est particulièrement avantageuse pour l’étude des composants spécifiques au type de cellule dans les états sains et malades.
Cette technique a été appliquée avec succès dans notre récente étude16, démontrant son efficacité à préserver l’intégrité structurelle et moléculaire des artères de résistance humaine, facilitant l’imagerie avancée et l’analyse complète. Le succès de cette application nous a incités à documenter ce protocole détaillé pour que d’autres puissent l’utiliser.
Dans cet article de méthode, nous décrivons le protocole de préparation des artères de résistance humaines isolées et de leur perfusion d’un gel stabilisateur tissulaire biocompatible (Tissue Guard Gel). Ici, nous décrivons la méthode expérimentale et illustrons ses applications pour l’évaluation de la structure artérielle et l’étude des modèles d’expression des gènes et des protéines dans différentes couches cellulaires. En fournissant une technique complète et reproductible pour la préparation des artères de résistance humaines, nous visons à faire progresser la recherche en biologie cardiovasculaire, à améliorer la reproductibilité des résultats et à contribuer à de nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques pour les maladies cardiovasculaires.
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Protocole
Avant de mener les expériences suivantes, assurez-vous que l’utilisation de tissus humains et les procédures suivantes sont approuvées par le Conseil d’examen institutionnel (IRB). Le prélèvement de tissu omental chez des patients subissant des opérations abdominales cliniquement indiquées au National Institutes of Health (NIH) Clinical Center a été effectué avec l’approbation du NIH Institutional Review Board (NCT01915225). Tous les participants ont fourni un consentement éclairé écrit.
1. Matériaux et équipements
- Reportez-vous à la table des matériaux pour obtenir des informations sur tous les réactifs et matériaux requis pour ce protocole. Pour plus de détails, les manuels et les sites Web associés aux fournisseurs respectifs peuvent être consultés au besoin.
2. Prélèvement de tissus omentaux humains
- Prélever des tissus omentaux humains auprès de l’équipe chirurgicale.
- Placez immédiatement les tissus dans un récipient d’échantillon pré-réfrigéré contenant un tampon Krebs Henseleit (KH) froid (composition : 118 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl, 1,2 mM de MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM de NaHCO3, 10 mM de HEPES, 2,0 mM de CaCl2 et 11,1 mM de glucose) sur de la glace.
- Assurez-vous que les mouchoirs sont complètement immergés dans le tampon, puis fermez bien le couvercle.
- Transporter les tissus dans le contenant fermé sur de la glace jusqu’au laboratoire dans les 30 minutes suivant le prélèvement pour assurer la viabilité des tissus.
REMARQUE : Assurez-vous d’ajuster le pH à 7,4 en utilisant du NaOH lors de la préparation du tampon.
3. Microdissection de petites artères de résistance humaines
- À l’arrivée au laboratoire, rincez les tissus omentaux avec un tampon KH froid pour éliminer l’excès de sang.
- Sélectionnez un morceau de la région la plus vascularisée du tissu pour la dissection dans un tampon froid dans une boîte de Pétri sur glace.
- À l’aide d’un microscope de dissection, identifiez les petites artères de résistance (de 100 à 300 m de diamètre) en fonction de leur emplacement et de leur ramification.
- Isolez soigneusement les artères identifiées des tissus adipeux et conjonctifs environnants. À l’aide d’une pince fine et de micro-ciseaux, coupez et retirez les tissus environnants sans endommager l’artère.
- Conservez les artères isolées dans un tampon froid tout au long de la procédure de dissection pour maintenir la viabilité et prévenir toute dégradation enzymatique.
REMARQUE : Avant la dissection, assurez-vous que la zone de dissection est propre. Vérifiez que l’échelle de l’objectif du microscope et/ou le logiciel de la caméra sont correctement calibrés pour mesurer avec précision le diamètre à différents grossissements. Habituellement, les veines sont clairement visibles et les artères sont situées juste à côté ou autour des veines. Les parois des artères sont plus épaisses que celles des veines. Lorsqu’elles sont isolées des tissus environnants, les artères conservent leur structure sous forme de tubes de vaisseaux intacts. En revanche, les veines ont des parois plus minces, apparaissent souvent plus brillantes en raison du sang dans leur lumière et ont tendance à être plus fragiles une fois séparées des tissus.
4. Préparation de la chambre de myographe de culture
- Préparez une chambre de myographie de culture avec deux canules en verre pour la canulation et la pressurisation des artères disséquées.
- Préparez une seringue de 5 ml avec un tube capillaire propre et remplissez-la d’un tampon KH frais. Connectez le tube à une extrémité de la canule et remplissez-le avec le KH, sans laisser de bulles d’air.
- Remplissez la chambre d’un tampon froid et placez-la sur de la glace pour maintenir une température basse.
REMARQUE : Un petit plat sur mesure avec deux canules, conçu pour imiter la chambre myographique, peut être utilisé.
5. Canulation et pressurisation des artères
- Transférez soigneusement l’artère disséquée dans la chambre myographique à l’aide d’une pince fine ou d’une pipette de transfert d’un diamètre supérieur à celui de l’artère.
- Préparez quatre nœuds ouverts avec la suture en nylon (suture 11/0, 7 plis) et placez-en deux sur chaque canule avant de canuler l’artère.
- Canulez l’extrémité proximale de l’artère en la glissant sur une canule en verre à l’aide d’une pince fine et fixez-la avec les deux sutures en nylon.
- Utilisez le tampon KH dans la seringue pour rincer doucement l’artère canulée afin d’éliminer tout sang restant.
- Canulez l’extrémité distale de l’artère et fixez-la de la même manière.
- Placez la chambre sur l’unité myographe reliée au régulateur de pression et de température.
- Réglez la température à 37 °C.
- Réglez la pression intraluminale initiale à 10 mmHg.
- Augmentez la pression intraluminale par incréments de 10 mmHg toutes les 10 minutes jusqu’à atteindre 60 mmHg. Assurez-vous que la pression est maintenue de manière constante à l’aide du régulateur de pression connecté au système de myographe de culture.
- Utilisez le micro-positionneur pour redresser longitudinalement l’artère pressurisée au besoin afin d’amener la longueur approximativement à son niveau physiologique.
- Exécutez MyoVIEW ou un autre logiciel approprié sur l’écran de l’ordinateur pour suivre les diamètres artériels internes et externes avec des pieds à coulisse numériques.
- Laisser l’artère s’équilibrer pendant 45 minutes pour obtenir un diamètre stable, en veillant à ce qu’elle conserve ses dimensions physiologiques et sa tonicité.
- Testez la viabilité de l’artère à l’aide d’un vasoconstricteur (par exemple, 60 mM de KCl ou de phényléphrine) ou d’un vasodilatateur (par exemple, l’acétylcholine) et notez les changements dans le diamètre artériel.
REMARQUE : L’application d’une pression excessive avec une seringue peut endommager l’artère, il est donc important de faire preuve de prudence lors de la chasse d’eau. Utilisez une quantité minimale de tampon et procédez doucement. Alternativement, le sang artériel peut être évacué en utilisant le tampon de perfusion tout en pressurisant l’artère. Les artères peuvent être pressurisées à 80 mmHg et le temps d’équilibre peut aller jusqu’à 1 h.
6. Fixation des artères
- Après l’équilibre, fixez les artères luminiquement et abluminiquement pendant la nuit avec 10 % de formol tamponné neutre. Maintenir une pression constante de 60 mmHg pour s’assurer que le processus de fixation préserve l’intégrité structurelle de la paroi artérielle et des composants cellulaires.
- Après la fixation, rincez les artères lumino-facialement et abluminement avec du PBS pour éliminer tout fixateur résiduel de l’artère et de la chambre.
REMARQUE : En fonction de l’objectif de l’étude et de la région d’intérêt pour l’analyse, le récipient monté peut être fixé en présence d’agents pharmacologiques tels qu’un vasodilatateur ou un vasoconstricteur. À ce stade, l’artère peut être stockée dans du PBS à 4 °C jusqu’à 48 h. Le paraformaldéhyde à 4 % peut également être utilisé pour fixer les artères.
7. Préparation du gel stabilisant des tissus
- Liquéfier le gel stabilisateur tissulaire dans son tube en le chauffant à 60 ± 5 °C avant utilisation.
- Placez le tube à température ambiante (RT) pendant 3 à 5 minutes pour que le gel liquide baisse la température, puis placez-le sur un bloc chauffant à 40 °C pour maintenir le gel liquide pendant 10 à 15 minutes.
- Utilisez une seringue stérile de 3 ml reliée à un tube capillaire de 10 à 15 pouces de long pour prélever le gel liquide. Passez immédiatement aux étapes d’infusion ci-dessous.
REMARQUE : Le gel peut être liquéfié en utilisant différentes méthodes. Il est essentiel de suivre les instructions du fabricant.
8. Infusion et enrobage de gel intraluminal
- Maintenir les artères fixes canulées dans la chambre avec PBS à 37 °C.
- Connectez l’extrémité distale de la tubulure capillaire remplie de gel liquide à la canule proximale.
- Pour éviter que des bulles d’air ne traversent la lumière pendant la perfusion du gel, retirez l’extrémité proximale de l’artère de la première canule pour laisser sortir les bulles d’air et permettre au gel de remplir la canule.
- Remontez l’artère sur la canule et infusez doucement le gel dans la lumière de l’artère jusqu’à ce qu’il sorte de la canule distale.
- Remplacez immédiatement le PBS dans la chambre par un volume égal de gel liquide pour remplir la chambre jusqu’au niveau supérieur.
- Laissez la chambre avec les artères reposer à RT en déconnectant l’appareil du contrôleur de température pendant environ 10 minutes pour permettre au gel de se solidifier à l’intérieur de la lumière ainsi qu’à l’extérieur de la lumière dans la chambre. Cela garantit que l’artère est entièrement intégrée dans le gel, préservant ainsi sa structure tridimensionnelle.
- À l’aide d’une pince fine, desserrez les sutures en nylon et retirez doucement les canules de la chambre.
- Transférez tout le gel solidifié contenant l’artère de la chambre dans un récipient rempli d’éthanol à 70 %. L’éthanol sert de solution de rétention pour conserver l’échantillon jusqu’à un traitement ultérieur.
REMARQUE : Une valve à trois voies peut faciliter l’élimination des bulles d’air avant d’infuser le gel. La solidification du gel peut être confirmée en touchant doucement le gel dans la chambre à l’aide d’une pointe de pipette propre.
9. Histopathologie
- Coupez l’artère transversalement alors qu’elle est encore dans le gel et placez ces échantillons dans la machine de traitement des tissus pour le traitement selon les instructions du fabricant.
- Par la suite, enfoncez le tissu pour faire un bloc de paraffine. Assurez-vous que les échantillons sont encastrés « à l’extrémité » de sorte que les sections transversales soient orientées vers le bas sur le bloc.
- Découper des sections axiales à 5 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome. Transférez les sections coupées sur des lames adhésives.
- Cuire les sections à 60 °C pendant 1 h, puis daffiner avec du xylène, puis réhydrater avec des lavages à l’alcool gradués.
- Colorer les coupes avec de l’hématoxyline et de l’éosine (HE) pour l’histopathologie de routine et différencier dans de l’alcool acide à 1 %. Examinez les coupes au microscope optique à l’aide d’un microscope approprié et prenez des photos à l’aide d’un appareil photo compatible.
10. Immunohistochimie
- Réalisez la coloration à l’aide d’un système automatisé avec le système de détection de l’affinage des polymères selon le protocole du fabricant.
- Daffinez les sections de tissu à 72 °C pendant 30 s avec une solution de déparaffinage, puis réhydratez les sections avec des lavages à l’alcool gradués et une solution de lavage.
- Effectuer le prélèvement d’épitopes induit par la chaleur en chauffant les sections à 100 °C pendant 20 minutes dans la solution de récupération d’épitopes 1 et appliquer un bloc de peroxyde pendant 5 minutes pour éteindre l’activité endogène de la peroxydase.
- Appliquer des anticorps primaires (p. ex., anti-CD31 ou anti-actine musculaire lisse) à des concentrations appropriées diluées dans un diluant anti-anti-réducteur de fond. Incuber les sections avec un polymère de peroxydase de raifort pendant 8 min et coloriser les sections avec une solution chromogène pendant 10 min. Contre-colorez les lames avec de l’hématoxyline pendant 5 min.
11. Hybridation chromogène in situ RNAScope
- Effectuer la coloration à l’aide d’un système automatisé avec un kit approprié et le kit de détection du rouge Polymer Refine selon le protocole du fabricant.
- Cuire les sections pendant 30 min à 60 °C, puis déparaffiner les sections pendant 30 s dans une solution de daffirage chauffée à 72 °C.
- Réhydratez les tissus avec des lavages à l’éthanol absolu et une solution de lavage.
- Traitez les sections avec la solution de récupération d’épitopes 2 pendant 15 min à 95 °C et incubez les sections avec une solution enzymatique pendant 15 min à 40 °C.
- Hybridez les échantillons avec les sondes RNAScope appropriées pour les gènes cibles.
- Utiliser une sonde génétique d’entretien à expression moyenne (p. ex., peptidylprolyl isomérase B) pour confirmer l’abondance et l’intégrité adéquates de l’ARN.
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Résultats
Des tissus omentaires humains ont été prélevés sur des patients subissant des chirurgies abdominales cliniquement indiquées. De petites artères de résistance (100 à 300 m de diamètre) ont été méticuleusement isolées des tissus adipeux et conjonctifs environnants à l’aide d’un microscope de dissection (figure 1A-C). Les artères isolées ont été nettoyées, canulées avec succès, puis montées sur les canules en verre de la chambre de myographe de culture pour la ...
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Discussion
Les progrès de l’imagerie médicale, des techniques chirurgicales et des méthodologies de recherche ont amélioré notre compréhension de l’architecture vasculaire 3D, révolutionnant le diagnostic, la planification chirurgicale et la recherche 17,18,19,20. Malgré ces innovations, la préservation de la structure 3D des artères de résistance humaines isolées reste u...
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Déclarations de divulgation
NIAID GenAI a été utilisé pour générer un plan initial et une ébauche du manuscrit, qui ont été soigneusement rédigés, révisés et édités par les auteurs humains pour garantir l’exactitude et la cohérence.
Remerciements
Cette recherche a été financée par la Division de la recherche intra-muros de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses, numéro de projet AI001150 à HCA. Nous remercions notre ancien membre du laboratoire, le Dr Steven Brooks, ainsi que nos membres actuels, Mohamed Ibrahim, Mary Jackson et Jian Wu de la Section de génomique fonctionnelle du paludisme, pour leur aide dans la capture d’images au cours du processus.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Concentration 1 % d’alcool acide | StatLab | ; SL89-1 | |
| 10 % NBS | Leica Biosystems | 3800598 | |
| Caméra HDMI 4K Microscopy | Hitech Instruments, Inc. | HT-XP4K8MA | |
| Diluant d’anticorps - Réduction de fond | Dako | S3022 | |
| Processeur tissulaire automatisé ; | Leica Biosystems | HistoCore PEGASUS/Cat# 14048858005 | |
| Bond Dewax Solution | Leica Biosystems | AR9222 | |
| Solution de récupération d’épitope lié 1 | Leica Biosystems | AR9961 | |
| Solution de récupération d’épitope de liaison 2 | Leica Biosystems | AR9640 | |
| Détection du raffinage des polymères liants | Leica Biosystems | DS9800 | |
| Détection de rouge raffiné par polymère liant | Leica Biosystems | DS9390 | |
| Solution de lavage de liaison (10 fois) | Leica Biosystems | AR9590 | |
| Pack de canules (verre), 80 et ndash ; 100 & mu ; m | DMT | Code produit : 300407 | |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Plats de dissection, grands (verre pyrex), 93 mm | Instrumentation des systèmes vivants | SKU : DD-90 | |
| Plats de dissection, petits | Instrumentation des systèmes vivants | SKU : DD-50 | |
| Dissection Microscope | Hitech Instruments, Inc. | ZEISS SteREO Discovery.V8 ; | |
| Pinces Dumont #5 | Outils scientifiques finement | Article n° 11295-10 | |
| Pinces Dumont #5SF | Outils scientifiques finement | Article n° 11252-00 | |
| EcoMount | BioCare Medical | EM897L | |
| Éosine | IHC Monde | IW-3100B | |
| Hématoxyline | BioCare Medical | Cathe-MM | |
| Caméra de jamging | Olyumpus | DP28 | |
| Microscope d’imagerie | Olyumpus | BX51 | |
| Tampon de Krebs Henseleit (avec 2 mM de chlorure de calcium) | Boston BioProducts, Inc. | SKU : C-10625N-200mL | |
| Tampon Krebs-Henseleit (sans calcium) | Boston BioProducts, Inc. | SKU : C-9906W-200mL | |
| Médias de montage | ThermoFisher Scientific | 4111 | |
| Chambre et unité à myographe | DMT | 202/204CM | |
| PBS (solution sésale tamponnée phosphate) | Thermofisher Scientific | 10010023 | |
| PPIB | ; ACDBio | 313908 | |
| Kit de réactifs RNAscope 2,5 LS-RED | ACDBio | 322150 | |
| Stainer | Leica | Système automatisé Leica Bond RX | |
| Goupilles de dissection en acier inoxydable | Instrumentation des systèmes vivants | SKU : PIN-0,1MM | BROCHE 0,2MM | NIP-#3 | PIN-VP-1 | |
| Paraplaste Surgipath | Leica Biosystems | 39601006 | |
| Gel de protection tissulaire | StatLab | ; TissueGuard/SKU : TG12 | |
| Ciseaux à ressort Vannas - tranchant de 2 mm | Outils scientifiques finement | Article n° 15000-03 | |
| Ciseaux à ressort Vannas - Tranchant de 2,5 mm | Outils scientifiques finement | Article n° 15000-08 | |
| Ciseaux à ressort Vannas - tranchant tranchant 3 mm | Outils scientifiques finement | Article n° 15000-00 | |
| &alpha ;-SMA | Abcam | ab5694 |
Références
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Réimpressions et autorisations
