Injection guidée par échocardiographie pour une administration ciblée et fiable de cellules souches intramyocardiques dans un modèle d’infarctus du myocarde chez le rat

Résumé

Cet article détaille un protocole optimisé pour les injections intramyocardiques guidées par échocardiographie dans des modèles d’infarctus du myocarde chez le rat à l’aide d’une aiguille de 29 G x 88 mm. Cette technique garantit une administration robuste, précise et reproductible d’agents thérapeutiques directement dans la zone péri-infarctus.

Résumé

L’injection intramyocardique (EGI) guidée par échocardiographie est une technique peu invasive pour administrer des thérapies à base de cellules souches dans des modèles précliniques d’infarctus du myocarde (IM). Par rapport aux approches traditionnelles à poitrine ouverte, l’EGI offre une meilleure traduisibilité clinique, une réduction de l’invasivité et un impact physiologique minimisé sur l’animal. Bien que l’EGI soit bien établie dans les modèles murins, son application chez le rat reste limitée en raison de défis anatomiques et techniques. En particulier, l’amincissement de la paroi antérieure ventriculaire gauche (LVAW) dans les régions infarctus et péri-infarctus complique l’administration myocardique sûre et précise, car l’épaisseur de la paroi peut tomber en dessous de la taille du biseau de l’aiguille des aiguilles de 27 G ou 28 G couramment utilisées, ce qui augmente le risque de perforation ventriculaire ou d’échec de l’accouchement. Pour remédier à cette limitation, nous avons optimisé un protocole pour EGI dans les modèles de MI de rat à l’aide d’aiguilles Spinocan de 29 G. L’aiguille de plus petit diamètre et plus longue permet de cibler avec précision les tissus myocardiques minces, minimisant les dommages et améliorant la précision de l’injection, indépendamment de l’épaisseur du LVAW. Cette technique est compatible avec les plateformes d’échocardiographie transthoracique standard et élimine le besoin de thoracotomie, permettant des études longitudinales chez le même animal. Notre méthode perfectionnée permet une administration robuste et reproductible d’agents thérapeutiques dans un myocarde viable adjacent à la zone d’infarctus, où les thérapies régénératives sont les plus efficaces. En améliorant la sécurité et la précision du ciblage, cette approche augmente la pertinence translationnelle de la recherche cardiaque préclinique et soutient le développement de protocoles standardisés dans tous les laboratoires.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires restent la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde, l’infarctus du myocarde (IM) étant un contributeur important aux affections cardiaques aiguës et chroniques¹. Malgré les progrès de la prise en charge pharmacologique et interventionnelle, la capacité de régénération du cœur humain adulte est limitée, ce qui entraîne souvent un remodelage indésirable et une progression vers l’insuffisance^cardiaque2,3. Par conséquent, les thérapies à base de cellules souches ont attiré l’attention en tant que stratégies potentielles pour réparer le myocarde endommagé, préserver la fonction cardiaque et améliorer les résultats cliniques⁴.

Des modèles précliniques robustes sont essentiels pour évaluer l’innocuité, l’efficacité et les stratégies d’administration de ces thérapies. Parmi les modèles de petits animaux, les rats offrent plusieurs avantages, notamment une taille cardiaque gérable, des techniques d’infarctus bien caractérisées et des réponses de remodelage cardiaque pertinentes sur le plan de la traduction⁵. Traditionnellement, l’administration intramyocardique de cellules souches dans les modèles d’IM chez le rat est réalisée par thoracotomie, ce qui permet une visualisation directe du site d’injection⁶. Cependant, cette approche est invasive, présente des risques procéduraux importants et entrave les interventions répétées dans les études longitudinales. De plus, il manque d’alignement avec les modalités d’administration cliniques, telles que l’injection par cathéter ou l’injection percutanée⁷.

L’injection intramyocardique guidée par échocardiographie (EGI) est une alternative peu invasive qui permet l’administration ciblée d’agents thérapeutiques sous guidage d’imagerie en temps réel. Bien qu’elle soit bien établie dans les modèles murins, l’utilisation de l’EGI dans les modèles de rat a été limitée. L’EGI est plus largement développée chez la souris que chez le rat, principalement parce que la plupart des recherches cardiovasculaires se sont historiquement concentrées sur les souris en tant que modèle préclinique dominant⁸. De plus, la taille et l’anatomie cardiaque plus petites des souris ont permis d’optimiser les procédures guidées par échographie⁹. En revanche, les rats ont une paroi thoracique plus épaisse et un mouvement respiratoire plus important, ce qui complique l’imagerie stable et à haute résolution pendant les procédures¹⁰.

Les progrès de la technologie des ultrasons à haute fréquence ont rendu possible l’EGI chez le rat, ce qui a renforcé la pertinence clinique de son utilisation. Pourtant, l’amincissement de la paroi antérieure du ventricule gauche (LVAW) dans les régions infarctus reste un défi majeur pour l’EGI chez les rongeurs. Chez le rat, l’épaisseur de la paroi diminue souvent à moins de 1 mm, alors que les aiguilles standard de 27 G ou 28 G ont des longueurs de biseau de 1,25 à 1,5 mm, ce qui augmente le risque de perforation ventriculaire ou d’administration de cellules mal dirigée. Pour remédier à cette limitation, nous avons affiné la technique EGI chez le rat en utilisant des aiguilles Spinocan de 29 G x 88 mm. Ces aiguilles ont une longueur de biseau de 1 mm, permettant une livraison précise et atraumatique des cellules dans le myocarde aminci des régions de l’infarctus et du péri-infarctus. La procédure est réalisée à l’aide d’une échocardiographie transthoracique à haute résolution, permettant de visualiser à la fois les repères anatomiques et la trajectoire de l’aiguille en temps réel.

Ce protocole EGI raffiné fournit une méthode peu invasive et reproductible pour l’administration ciblée d’agents thérapeutiques dans le myocarde péri-infarctus dans des modèles de rats d’IM aigu et chronique, indépendamment de l’épaisseur de la LVAW. Il facilite l’injection dans des zones frontalières viables - des sites critiques pour obtenir un bénéfice thérapeutique - tout en réduisant considérablement la charge chirurgicale et le temps de récupération par rapport aux approches à poitrine ouverte. De plus, il soutient les études longitudinales impliquant des injections répétées et des images de suivi, réduisant ainsi le nombre d’animaux conformément au principe des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement)¹¹. Le protocole est adaptable à l’administration d’agents pharmacologiques, de thérapies géniques, de biomatériaux et de divers types de cellules souches. En normalisant l’EGI dans les modèles de rats et en s’alignant sur les modalités d’administration clinique, cette approche améliore la reproductibilité entre les laboratoires et renforce la pertinence translationnelle de la recherche cardiaque préclinique.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité d’éthique local de UHasselt (Commission d’éthique pour l’expérimentation animale, UHasselt, Diepenbeek, Belgique, ID202308 et ID202497) et menées conformément à la directive européenne 2010/63/UE.

1. Configuration de l’équipement

1. Allumez la plate-forme d’imagerie par échographie, la plate-forme chauffante intégrée, l’unité de surveillance de la physiologie et le chauffe-gel.
   REMARQUE : Pour permettre une visualisation claire et suffisamment détaillée de la paroi antérieure du ventricule gauche pendant la procédure EGI, il est recommandé d’utiliser un système d’échographie haute fréquence équipé d’une sonde linéaire à réseau linéaire de 15 MHz de ≥ offrant une résolution axiale d’environ 75 μm.
2. Allumez le coussin chauffant pour maintenir la température corporelle du rat pendant l’épilation de la poitrine.
3. Sélectionnez le transducteur approprié et initialisez le moteur 3D pour garantir l’amplitude de mouvement complète du transducteur.
   REMARQUE : En plus d’utiliser le micromanipulateur du système de garde-corps de la plate-forme de l’animal, le moteur 3D permet des réglages très précis du transducteur, ce qui peut faciliter l’alignement avec l’aiguille d’injection si nécessaire. Si nécessaire, la procédure peut également être effectuée sans le moteur 3D.
4. Assurez-vous que le système est correctement aligné avant l’imagerie. Réglez le micromanipulateur de vis contrôlant la plate-forme de l’animal dans une position neutre (c’est-à-dire centré dans toute l’amplitude de mouvement). Centrez la plate-forme animale elle-même au milieu du système de garde-corps. Positionnez le système de montage de la sonde de manière à ce qu’elle soit alignée directement au-dessus du centre de la plate-forme de l’animal.

2. Préparation des animaux et anesthésie

1. Pesez le rat et calculez le volume requis de buprénorphine (0,04 mg/kg) à administrer pour soulager la douleur.
2. Placez le rat dans une chambre d’induction reliée à un appareil d’anesthésie. Induire l’anesthésie avec 2,5 % d’isoflurane complété par de l’oxygène à un débit de 2 L/min.
3. Une fois l’anesthésie induite, transférez le rat sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle à 37 0,5 °C. Maintenez une anesthésie adéquate en positionnant le museau du rat dans un cône nasal relié au système d’anesthésie, délivrant un débit constant de 1 à 3 % d’isoflurane complété par 1 à 1,5 L/min d’oxygène, ajusté au besoin pour assurer une sédation adéquate.
4. Rasez la poitrine du rat et éliminez les poils résiduels avec une crème dépilatoire. Après l’épilation, désinfectez le site d’injection en alternant un agent de gommage chirurgical approprié (par exemple, povidone iodée) avec de l’éthanol à 70 %, répété 3 fois. Appliquez du gel ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse.
5. Administrez la dose précalculée de buprénorphine par voie intramusculaire dans la patte arrière pour minimiser l’inconfort lié à l’EGI.
6. Transférez le rat du coussin chauffant à la plate-forme animale du système d’imagerie par échographie. Assurez une administration constante de l’anesthésie grâce au cône nasal intégré de la plate-forme, en maintenant un débit constant de 1 à 3 % d’isoflurane dans 1 à 1,5 L/min d’oxygène. Fixez les pattes du rat sur les électrodes de la plate-forme, en appliquant une petite quantité de gel d’électrode pour assurer une qualité de signal optimale. Insérez la sonde de température rectale pour une surveillance continue de la température corporelle.
   REMARQUE : La surveillance continue des paramètres physiologiques est essentielle tout au long des procédures d’imagerie et d’injection. La fréquence cardiaque (FC), la fréquence respiratoire (RR) et la température corporelle du rat doivent rester dans des limites acceptables pour éviter les complications liées à l’anesthésie. En règle générale, la FC doit être comprise entre 250 et 400 bpm, tandis que la RR doit être d’au moins 30 respirations par minute. Si la FC ou la RR tombe en dessous de ces seuils, diminuer immédiatement la concentration d’isoflurane (p. ex., de 2-3 % à 1-2 %) et vérifier que l’animal reste correctement positionné et ne devient pas hypothermique. Les ajustements doivent être effectués progressivement, avec une surveillance étroite jusqu’à ce que les paramètres reviennent aux niveaux cibles.
7. À ce stade, acquérez toutes les images de base ou de pré-injection souhaitées. En général, les images parasternales grand axe (PSLAX) et courtes (SAX) en mode B et en mode M, ainsi que les images à quatre chambres, sont recommandées pour l’évaluation fonctionnelle et anatomique de base.
   REMARQUE : L’imagerie générale peut être effectuée avec le système configuré comme illustré à la Figure 1A. Pour la procédure d’injection, la plate-forme animale devra être repositionnée et le transducteur ajusté en conséquence. Bien que l’imagerie en mode B de PSLAX soit utilisée pour le guidage pendant l’injection, ces images peuvent ne pas être optimales pour les analyses fonctionnelles post-hoc en raison de la nécessité d’un alignement précis des aiguilles.

3. Procédure d’injection intramyocardique guidée par échocardiographie

REMARQUE : À partir de ce moment, deux opérateurs sont nécessaires pour effectuer avec succès l’injection. L’opérateur A est responsable de la manipulation de la plate-forme animale et de la surveillance de l’image d’échocardiographie en direct, tandis que l’opérateur B doit se positionner derrière le support d’injection pour aligner avec précision l’aiguille et le transducteur.

1. Préparez le système d’injection en fixant une aiguille guide de 22 G à une seringue de 1 ml. Placez la seringue avec l’aiguille de guidage sur le support d’injection et fixez la pince d’injection.
   REMARQUE : L’aiguille de 29 G x 88 mm est trop souple pour perforer directement la peau et les couches musculaires ; L’aiguille de guidage est nécessaire pour faciliter l’injection.
2. Alignez le transducteur avec le support d’injection pour vous assurer que l’aiguille peut être visualisée. Ajustez la position de la sonde à l’aide du support de sonde et de la pince de maintien et, si nécessaire, faites pivoter le support d’injection le long de son rail pour obtenir un alignement approprié.
3. Sans déplacer le rat, faites pivoter la plate-forme de l’animal de manière à ce que l’encoche du transducteur pointe vers l’épaule droite du rat (figure 1B-D). Cette configuration permet l’acquisition d’une image claire du ventricule gauche en mode B PSLAX. Vérifiez que l’aiguille guide reste dans le champ de mouvement de la sonde. S’il n’est pas aligné, ajustez la position du transducteur via le système de moteur 3D plutôt que de modifier le support d’injection.
4. Une fois que l’alignement aiguille-transducteur est correct, affinez l’imagerie à l’aide des vis du micromanipulateur du rail de la plate-forme de l’animal. Maintenez la position du transducteur pour préserver l’alignement avec l’aiguille. Une rotation ou une translation supplémentaire de la plate-forme animale peut être nécessaire pour optimiser la qualité de l’image.
5. Visualisez la zone infarctus. Évaluez l’étendue de l’infarctus, le mouvement régional de la paroi et l’amincissement de la paroi, à l’aide de l’imagerie PSLAX en mode B et en mode M pour évaluer la faisabilité du site d’injection. Appliquez une approche de notation du mouvement de la paroi à 16 segments pour identifier les régions akinétiques ou gravement hypokinétiques, qui représentent le noyau de l’infarctus.
6. Identifiez la zone péri-infarctus et sélectionnez le site d’injection cible. Choisissez une zone hypocinétique adjacente au noyau de l’infarctus avec une épaisseur de paroi diastolique supérieure à 1 mm, ce qui permet l’insertion complète du biseau de l’aiguille 29 G à un angle peu profond.
7. À l’aide du système de rails, avancez le support d’injection vers la plate-forme de l’animal. Alignez avec précision l’aiguille avec le milieu exact du transducteur à l’aide des vis du micromanipulateur sur le support d’injection.
   REMARQUE : Un alignement précis est essentiel. Si l’aiguille n’est pas centrée sur le transducteur, elle ne sera pas visible lors de l’injection.
8. Faites avancer l’aiguille guide à l’aide de la vis du micromanipulateur d’injection sur le support d’injection jusqu’à ce que la peau soit perforée. Vérifiez que la pointe de l’aiguille est visible sur l’image de l’échographie. Si l’aiguille n’est pas visible, rétractez-la avec précaution à l’aide de la vis du micromanipulateur « injecter » et répétez l’étape 3.7 pour la réaligner.
9. Activez la fonction de guidage de l’aiguille dans le logiciel d’échographie pour confirmer la trajectoire de l’aiguille. Avancez l’aiguille guide vers la région cible prédéterminée, en positionnant le biseau de l’aiguille à environ 1 à 2 mm de la paroi antérieure ventriculaire gauche (VGAW) (Figure 2A).
   REMARQUE : Évitez de perforer le myocarde avec l’aiguille guide pour éviter des saignements excessifs ou des lésions cardiaques.
10. Une fois l’aiguille positionnée, demandez à l’opérateur A de stabiliser fermement l’aiguille guide à sa base, assurant une visualisation constante de l’aiguille sur l’écran d’échographie. En même temps, demandez à l’opérateur B de desserrer la pince fixant la seringue, de retirer la seringue et de préparer la seringue d’injection. Demandez à l’opérateur A de garder l’aiguille de guidage immobile.
11. Fixez l’aiguille de 29 G x 88 mm sur la seringue contenant l’injectat (opérateur B) et fixez la seringue sur le support d’injection. Guidez manuellement l’aiguille de 29 G x 88 mm à travers l’aiguille de guidage fixe, en effectuant de petits ajustements avec les vis du micromanipulateur dans le plan de l’axe des x (gauche ou droite de la sonde) si nécessaire. Avancez manuellement jusqu’à ce que le biseau de l’aiguille devienne visible dans la cavité thoracique à l’échographie.
    REMARQUE : En raison de la flexibilité de l’aiguille de 29 G, elle peut se plier lors de l’insertion dans la cavité thoracique. Pour minimiser cela, l’opérateur A peut stabiliser la partie externe de la tige de l’aiguille pendant que l’opérateur B fait avancer l’aiguille dans la cavité thoracique.
12. Une fois que l’aiguille de 29 G x 88 mm passe à travers l’aiguille guide et devient visible à l’échographie, faites-la pénétrer dans le myocarde de l’AVVG à l’aide des vis du micromanipulateur pour plus de précision et de sécurité. Confirmez que le biseau de l’aiguille est entièrement situé à l’intérieur du myocarde (Figure 2B).
    REMARQUE : En raison du biseau relativement long de l’aiguille de 29 G par rapport à l’épaisseur de la paroi myocardique, il est essentiel de s’assurer que tout le biseau est encastré dans le myocarde. Utilisez la fonction « Figer l’image » pour vérifier l’emplacement si nécessaire. Bien que l’étalonnage de la profondeur par ultrasons puisse aider à la précision, dans ce protocole, nous avons vérifié la profondeur en sélectionnant des sites d’injection avec une épaisseur de paroi diastolique finale >1 mm et en confirmant visuellement que la pointe de l’aiguille s’approchait, mais ne la franchissait pas, la bordure endocardique (Figure 2B).
13. Injectez lentement l’injectat dans le myocarde (opérateur B). La réussite de l’injection intramyocardique est confirmée visuellement par une tache échogène brillante/dense au site d’injection, qui doit se déplacer de manière synchrone avec le LVAW (Figure 2C). Pour minimiser le reflux de l’injecté, attendez environ 10 s après la fin de l’injection avant de rétracter l’aiguille.
14. Tout d’abord, retirez la seringue avec les aiguilles du support d’injection pour minimiser le risque de blessure par piqûre d’aiguille. Ensuite, retirez soigneusement le rat de la plate-forme de l’animal et laissez-le récupérer sur un coussin chauffant. Surveillez en permanence les paramètres vitaux jusqu’à ce qu’ils se rétablissent complètement de l’anesthésie.

Résultats

Validation de la précision d’injection par imagerie de bioluminescence in- et ex vivo (BLI)
Pour évaluer le succès et l’efficacité de l’EGI, des cellules souches ont d’abord été transduites pour exprimer la luciférase des lucioles (Fluc) via un vecteur lentiviral, permettant un suivi in vivo par imagerie par bioluminescence (BLI). L’IRB a confirmé une administration intramyo...

Discussion

Alors que la recherche préclinique axée sur les thérapies régénératives pour restaurer le cœur après un infarctus du myocarde progresse, les obstacles concernant l’administration optimale de l’agent thérapeutique restent¹². Les techniques d’EGI mini-invasives sont de plus en plus privilégiées par rapport aux approches à poitrine ouverte, car elles imitent mieux l’administration percutanée clinique, améliorent le bien-être des animaux et permettent des administrati...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
21? Sonde MHz MX250	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	Sonde à ultrasons haute fréquence compatible avec le système Vevo 3100
Ruban chirurgical 3M Transpore	3M	1527	Pour fixer les pattes de l’animal à la plate-forme animale
Aquasonic  ; 100 Gel de transmission d’ultrasons	Parker Laboratories BV	01-08	Assure un couplage acoustique correct entre le transducteur et la peau de l’animal pour une qualité d’image optimale
Bupaq 0,3 mg/mL solution injectable pour chiens et chats	Richter Pharma AG	57446/4008	Analgésique opioïde (buprénorphine) administré pour la gestion de la douleur
ISOFLUTEK  ; 1000	Alivira	/	Anesthésique par inhalation à base d’isoflurane  ;
Chauffe-gel multi-bouteilles 230 V	Parker Laboratories BV	83-03-20 CE (LCD)	Réchauffe le gel à ultrasons à la température corporelle pour prévenir l’hypothermie ou l’inconfort des animaux
Gel d’électrode Signagel	Parker Laboratories BV	15-25	Appliqué aux électrodes ECG pour améliorer la conduction du signal pour la surveillance physiologique
SPINOCANE 29 G X 88 MM	Bbraun	4501900	Aiguille fine pour une injection intramyocardique précise
Seringue Terumo en 3 parties avec aiguille hypodermique pré-connectée	Terumo Europe N.V.	MDSS01S2516E	Utilisé pour monter et fixer l’aiguille de guidage 22 G et l’aiguille d’injection 29 G pour une administration contrôlée dans le myocarde.
Unité de surveillance physiologique THM150	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	Surveille les signes vitaux tels que la fréquence cardiaque, la fréquence respiratoire et la température corporelle de l’animal pendant la procédure
Veet Minima Pure	Reckitt Benckiser	/	Crème dépilatoire
Vevo 3100	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	Système d’échographie haute résolution  ;
Vidisic carbomerum 980 2mg/g gel ophtalmique	Bausch + Lomb	/	Appliqué sur les yeux d’un animal anesthésié pour prévenir le dessèchement de la cornée