Ponction veineuse faciale pour le prélèvement de sang murin

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour une technique de collecte de sang optimisée chez des sujets murins par ponction veineuse faciale à l’aide d’une lancette. Nous utilisons cette technique parallèlement à l’évaluation par cytométrie en flux pour caractériser les phénotypes cellulaires des souches transgéniques, congéniques et rapporteures. Il convient également à l’analyse des cytokines sériques et aux études sur le diabète.

Résumé

Cet article présente un protocole optimisé pour la collecte de sang murin par ponction veineuse faciale à l’aide d’une lancette, offrant une alternative rapide, peu invasive et rentable à d’autres techniques courantes telles que la veine de la queue et l’échantillonnage rétro-orbitaire. Cette technique est particulièrement avantageuse pour les études nécessitant des prélèvements répétés, telles que le phénotypage de souris, l’analyse des cytokines sériques et la recherche sur le diabète. Le protocole est efficace, nécessite un minimum d’équipement spécialisé et est bien adapté à l’analyse cellulaire à haut débit chez la souris. Notre application principale est le phénotypage de souris transgéniques, congéniques et rapporteures à l’aide de la cytométrie en flux, démontrée ici avec la coloration des anticorps et les souris rapporteures tdTomato. Le document décrit l’ensemble de la procédure, de la préparation de l’animal à l’analyse des échantillons. Les étapes clés comprennent le prélèvement sanguin à l’aide d’une lancette de 3 mm, la lyse cellulaire, la coloration et le profilage cytométrique en flux. La ponction veineuse faciale améliore l’efficacité de la collecte tout en soutenant les pratiques de recherche éthiques. Cette méthode pratique et adaptable convient à un large éventail de protocoles expérimentaux impliquant des prélèvements sanguins murins et des analyses cellulaires.

Introduction

Un prélèvement sanguin efficace, reproductible et peu invasif est essentiel pour de nombreuses études sur les murins, en particulier celles nécessitant des prélèvements répétés. Ce protocole fournit une méthode simplifiée pour collecter de petits volumes de sang à l’aide de la ponction veineuse faciale, suivie d’une lyse des globules rouges, d’une coloration des anticorps et d’une analyse cytométrique en flux. Ce flux de travail est bien adapté aux applications à haut débit tout en minimisant les complexités techniques.

De nombreuses méthodes de prélèvement sanguin, comme les saignements rétroorbitaires ou l’incision de la veine caudale, peuvent nécessiter des procédures impliquant de la chaleur, une anesthésie¹ et des temps de manipulation prolongés, ce qui peut causer une détresse importante à l’animal². En revanche, la ponction veineuse faciale avec une lancette offre une alternative simple et rapide qui soutient une conception expérimentale éthique et reproductible. Cette méthode a été validée dans des études antérieures en tant qu’alternative humaine pour l’échantillonnage de sang de petit volume chez la souris³.

Nous illustrons cette méthode en phénotypage de cellules immunitaires de souris transgéniques et rapporteures, y compris les souris rapporteures TdTomato et les souris MD4-IgHEL. Ce dernier nécessite une coloration avec des anticorps contre CD19 et IgMa, un allotype IgM.

Bien que ce protocole soit développé pour le profilage cellulaire sanguin, il peut être facilement adapté à d’autres utilisations, notamment l’analyse des cytokines sériques, la détection d’anticorps spécifiques ou la mesure du glucose, en omettant l’étape de lyse des globules rouges. Dans l’ensemble, cette technique améliore la qualité des données et l’efficacité expérimentale tout en causant un minimum de détresse chez les animaux, ce qui la rend largement utile dans diverses applications de recherche.

Protocole

Les souris ont été hébergées dans un environnement spécifique exempt d’agents pathogènes au Dartmouth Hitchcock Medical College, une institution accréditée par l’AAALAC, et utilisées conformément à un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.

1. Collecte des matériaux

1. Préparez des tubes de culture de 5 mL, contenant chacun 1,5 mL de 1 tampon de lyse des globules rouges (10 fois lyse des globules rouges diluée avec de l’eau stérile). Utilisez un tube par souris.
2. Rassemblez une boîte de lancettes de 3 mm (une lancette par souris).
3. Rassemblez une boîte d’éponges de gaze (une éponge de gaze par souris).
4. Rassemblez des pipettes de transfert et un tube conique de 50 mL contenant 1x HBSS avec 0,5 mM d’EDTA (suffisant pour un maximum de 20 souris).
   REMARQUE : Ce tampon est utilisé pour arrêter la réaction de lyse. Si le tampon n’est nécessaire que pour le phénotypage et non pour une analyse ultérieure en aval, la plupart des tampons neutres avec un pH de 7,2 à 7,4 peuvent être utilisés à la place du HBSS.
5. Apportez un seau à glace, 1 tampon de lyse RBC supplémentaire, des tubes supplémentaires de 5 ml et des pipettes de transfert.

2. Étiquetage des souris et des tubes

1. Étiquetez chaque carte de cage et souris avec un identificateur de phénotype qui correspond aux étiquettes sur chaque tube pour aider à distinguer quels résultats correspondent à quelle souris. Les identificateurs couramment utilisés comprennent différentes couleurs de marqueurs permanents (par exemple, rouge, bleu, vert, noir) sur la queue des souris, qui correspondent aux marques sur le tube.
   REMARQUE : Incluez toujours une souris témoin pour le phénotypage. Pour les souris rapporteures, assurez-vous d’avoir un contrôle négatif du rapporteur. Pour les souris transgéniques, incluez une souris de type sauvage comme contrôle.
2. Rangez les tubes étiquetés dans un support avec un seau à glace à proximité pour stocker les tubes immédiatement après le prélèvement sanguin.
3. Ouvrez toutes les lancettes nécessaires à la procédure.
4. Ouvrez toutes les éponges de gaze nécessaires à la procédure.

3. Manipulation des souris et prélèvement d’échantillons

1. Utilisez la main dominante pour saisir la souris par la queue et placez-la sur une grille d’alimentation ou sur toute surface plane.
2. Utilisez l’index et le pouce non dominants pour ébouriffer la souris en manœuvrant de la queue vers la région cervicale.
3. Utilisez les doigts restants pour fixer la queue, minimisant ainsi les mouvements de la souris.
4. Utilisez la main dominante pour récupérer une lancette de 3 mm ouverte.
5. Localisez le petit point glabre juste au-delà de la bouche et tracez une ligne droite vers l’oreille. Arrêtez-vous à l’intersection de la ligne avec le coin externe de l’œil (Figure 1).
6. Insérez la lancette à cette intersection pour assurer un apport sanguin suffisant.
7. Utilisez le bord latéral plat de la lancette pour recueillir une seule goutte de sang.
8. Déposez la lancette entière, avec l’échantillon de sang, dans le tube étiqueté contenant le tampon de lyse des globules rouges.
9. Agitez doucement le tube pour vous assurer que tout l’échantillon est mélangé dans le tampon. Un mélange incomplet peut entraîner une coagulation et une mauvaise qualité des données.
10. À l’aide d’une éponge de gaze, appliquez une légère pression sur le site de ponction pendant 5 à 10 s.
11. Remettez la souris dans sa cage.
12. Maintenir un rapport tampon sang/lyse supérieur à 1:10.
13. Répétez les étapes de cette section pour chaque souris supplémentaire.

4. Lyse, préparation et analyse de l’échantillon

1. Attendre 7 à 10 minutes après le début de la lyse, ajouter environ 2 ml de 1x HBSS avec 0,5 mM d’EDTA (ou un autre milieu).
2. Tubes à centrifuger à 400 g pendant 5 min. Préparez des cocktails d’anticorps pendant ce temps.
3. Jetez le surnageant.
4. Retirez les lancettes des tubes à l’aide d’une pince.
5. Ajouter 30 μL d’un cocktail d’anticorps conçu pour identifier les populations cellulaires souhaitées.
   REMARQUE : Pour phénotyper les souris IgHEL MD4, notre cocktail était composé de 1 mL de HBSS, 25 μL d’IgMa PerCP cy-5.5 et 25 μL de CD19 APC.
6. Remettre les cellules en suspension par vortex pendant 2-3 s et incuber pendant 25-30 min à 4 °C.
7. Allumez le cytomètre en flux et configurez les diagrammes de flux en fonction des besoins de l’expérience.
   REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de faire tourner les cellules après la coloration si l’objectif est le phénotypage.
8. Ajouter 150 à 25 μL de HBSS ou d’un autre milieu à chaque échantillon à l’aide d’une pipette de transfert. Si nécessaire, le DAPI peut être ajouté à une concentration finale de 1,μg/mL (utiliser 10 μL de milieu contenant du DAPI).
9. Vortex chaque échantillon pendant 2-3 s juste avant l’acquisition.
10. Acquérir des données de 8 000 à 10 000 événements/s, en visant 100 000 cellules si la lyse était efficace.
11. Analysez les données acquises, illustrées à la figure 2 et à la figure 3.

Résultats

À l’aide de la cytométrie en flux, la figure 2 montre du sang lysé de souris rapporteures de type sauvage (WT) et PF4-Cre TdTomato, préparé selon le protocole décrit ci-dessus. Le premier ensemble de diagrammes de flux affiche la diffusion latérale (SSC), qui reflète la granularité de la cellule, par rapport à la diffusion directe (FSC), qui indique la taille de la cellule. Des débris cellulaires et des plaquettes sont observ...

Discussion

Ce protocole optimisé de prélèvement sanguin de la veine faciale offre une alternative simple et efficace à d’autres méthodes couramment utilisées, telles que la veine de la queue ou le saignement rétro-orbitaire. Bien que le protocole soit simple et direct, quelques étapes essentielles doivent être suivies attentivement. L’étape la plus importante à exécuter correctement est le placement correct du site de ponction⁴. Le ciblage de l’endroit approprié sur la joue ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps anti-souris de l’APC CD19	Biolégende	152410	CD19 APC
Centrifugeuse 5810 R, sans rotor, 120 V, 50/60 Hz	Eppendorf	22625501	Centrifugeuse
Éponges en gaze Dermacea 8 plis de 2 » x 2 »	Covidien	441211	Guaze Ponges
Pipettes jetables graduées à transfert	Fisherbrand	13-711-91am	Pipette de transfert
ErgoOne Single Channel Pipette (200 & micro ; L)	USA Scientific	7100-2200	Pipette
Acide éthylédiadiamine tétraacétique (solution 0,5 M/pH 8,0)	Fisherbrand	BP2482-100	EDTA 5 M  ;   ;
Analyseur de cellules FACSymphony A3	BD Biosciences	660937	Cytomètre en flux
Fisherbrand  ; Mélangeur à vortex analogique	Fisherbrand	02-215-414	Vortex
Goldenrod Animal Lancet 3 mm Stérile 5 plateaux de 200	Verge d’or	GR 3MM	Lancet 3 mm
Pince Graefe	Outils scientifiques finement	11051-10	Pinces
Hank' s Solution saline équilibrée, 1X sans calcium ni magnésium	Corning	21-021-CVR	HBSS
PerCP/Cyanine5.5 anti-souris IgMa  ; Anticorps	Biolégende	408612	IgMa PerCP cy-5.5
Tampon de lyse des globules rouges (10x)	Biolégende	420301	Tampon de lyse des globules rouges
Tubes à essai en polystyrène à fond rond sans bouchon	Fisherbrand	FB1496110	Tubes de culture
Marqueurs permanents au marqueur Sharpie, embout en ciseau	Sharpie	38254PP	Sharpies & nbsp ;
Testé pour l’eau stérile USP & nbsp ;	Corning	25-055-CI	Eau de qualité culture cellulaire
Recharges de pointes de pipette TipOne (200 & micro ; L Biseauté naturelle)	USA Scientific	1111-1730	Pointes de pipette