Article de méthode

Optimisation rapide d’un système inductible par la lumière pour contrôler l’expression génique de mammifères

DOI :

10.3791/68779

⸱

4 novembre 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of California, Davis, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Davis

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude décrit une méthode pour des expériences à haut débit utilisant un réseau de LED imprimées en 3D pour optimiser l’expression génique inductible par la lumière dans HEK293T cellules.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les outils d’expression génique inductibles peuvent ouvrir de nouvelles applications en santé humaine et en biotechnologie, mais les options actuelles sont souvent coûteuses, difficiles à inverser et ont des effets indésirables hors cible. Les systèmes optogénétiques utilisent des protéines sensibles à la lumière pour contrôler l’activité des régulateurs, de sorte que l’expression est contrôlée en appuyant sur un interrupteur. Cette étude optimise un système d’effecteur CRISPR simplifié activé par la lumière (2pLACE), qui fournit un contrôle réglable, réversible et précis de l’expression des gènes des mammifères. L’OptoPlate-96 permet un criblage à haut débit par cytométrie en flux pour l’analyse de cellules uniques et l’optimisation rapide de 2pLACE. Cette étude montre comment utiliser le système 2pLACE avec l’OptoPlate-96 dans HEK293T cellules pour identifier les rapports de composants optimaux afin de maximiser la plage dynamique et de trouver la courbe de réponse de l’intensité de la lumière bleue. Des flux de travail similaires peuvent être développés pour d’autres cellules de mammifères et pour d’autres systèmes optogénétiques et longueurs d’onde de la lumière. Ces avancées améliorent la précision, l’évolutivité et l’adaptabilité des outils optogénétiques pour les applications de biofabrication.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les outils de biologie synthétique tels que les systèmes d’expression génique inductibles ont apporté des contributions importantes à la recherche biologique. Leur capacité à réguler l’expression des gènes de manière réglable, réversible et précise peut améliorer le contrôle de la production de protéines 1,2,3,4,5,6, de la morphologie cellulaire 7,8,9,10,11,12, des voies métaboliques 13,14,15,16,17,18, et d’autres cibles pour la biofabrication et les applications thérapeutiques. Les systèmes inductibles chimiques peuvent avoir des effets résiduels19,20 ou hors cible. Les additifs chimiques peuvent également être très coûteux et difficiles à mettre à l’échelle industriellement en raison de processus de purification supplémentaires en aval 21,22,23. Les systèmes d’expression génique inductibles par la lumière peuvent offrir une méthode évolutive et précise pour les pratiques de biofabrication 24,25,26,27.

De nombreux systèmes d’expression génique inductibles par la lumière ont été développés comme outils de biologie synthétique utiles dans une variété d’applications 28,29,30,31,32,33,34,35,36 et les longueurs d’onde du bleu 35,37,38, rouge/rouge lointain12,39,40, ou vert41 clair. Dans le cas de la régulation des gènes optogénétiques basée sur CRISPR, la modification de la quantité d’ARN guides individuels (ARNg) délivrés peut affecter l’expression de l’ARNm des gènes endogènes42 et devra être optimisée pour différentes lignées cellulaires. Des protéines de transactivation telles que VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p6544, ou des fusions de ceux-ci 47 peuvent également être utilisées, augmentant ainsi la modularité des systèmes optogénétiques. Afin d’étudier des voies biologiques complexes et entrelacées 12,40,48,49,50,51,52,53, différentes combinaisons de ces composants connus peuvent être testées. De plus, différentes lignées cellulaires peuvent présenter des différences d’induction avec le même système52. Différents niveaux d’induction peuvent conduire à une expression génique insuffisante ou à une sensibilité insuffisante dans le contrôle précis de l’expression génique, nécessitant des tests rigoureux pour trouver un système optogénétique optimal dans des lignées cellulaires nouvelles ou plus pertinentes sur le plan biologique. Avec un rythme croissant et une applicabilité croissante de la régulation des gènes optogénétiques, il est impératif de caractériser rapidement ces différents systèmes.

Les méthodes actuelles de caractérisation des outils optogénétiques utilisent l’expression stable ou transitoire des gènes12,54. La génération de lignées cellulaires exprimant de manière stable et l’optimisation de la dynamique du système pour une expression maximale peuvent prendre du temps et donc être coûteuses. L’expression transitoire permet d’obtenir des informations rapides et précieuses, en particulier lors du test de systèmes optogénétiques à plusieurs composants. Ici, nous avons utilisé le système effecteur CRISPR-dCas9 activé par la lumière bleue (LACE)37, composé de cryptochrome 2 (CRY2) et de CIBN (basic-helix-loop-helix N-terminal) interagissant avec le cryptochrome. Il a été utilisé pour contrôler l’expression génique dans des cellules de mammifères telles que HEK293T (cellules rénales embryonnaires humaines)37,38, CHO-DG44 (cellules ovariennes de hamster chinois)55 et C2C12 (cellules myoblastiques de souris)38. Sa nature modulaire est idéale pour caractériser rapidement les performances du système par des méthodes d’expression transitoire et à haut débit. Par exemple, les systèmes à plusieurs composants comme LACE peuvent nécessiter une optimisation des rapports de masse pour améliorer l’induction, une étape qui n’est généralement pas utilisée dans la caractérisation des systèmes optogénétiques.

Ce protocole détaille l’optimisation et la caractérisation rapides du système LACE à deux plasmides (2pLACE)38. Dans cette configuration, 2pLACE contrôle l’expression d’un rapporteur fluorescent, eGFP (enhanced green fluorescent protein), dans HEK293T cellules. L’activation est effectuée dans des plaques à 96 puits à fond de verre noir à l’aide d’une OptoPlate-96, un réseau de LED imprimé en 3D conçu et construit par Lukasz Bugaj et ses collègues 56,57,58,59. Ce protocole optimise spécifiquement l’expression maximale avec différents rapports de masse du système à deux plasmides. Il comprend également un code convivial permettant de contrôler différentes intensités lumineuses afin d’étudier l’accordabilité du système et sa plage dynamique complète. La cytométrie en flux est utilisée pour la collecte et l’analyse des données. Les protocoles de génération de constructions plasmidiques et de matériaux d’impression 3D pour le réseau de LED peuvent être trouvés dans des publications précédentes54,56. Ces méthodes mettent en évidence un pipeline rapide et à haut débit pour caractériser les systèmes d’expression génique inductibles par la lumière.

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Protocole

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1. Placage HEK293T cellules dans un format de 96 puits

  1. Dans une enceinte de biosécurité, récupérez un contenant de déchets d’eau de Javel, des pipettes sérologiques, un aide-pipette, une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS), un milieu d’aigle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS) et un flacon de culture cellulaire T-75 avec des cellules de HEK293T confluentes. Préchauffez le milieu à 37 °C.
  2. Dans une fiole T-75, vérifiez que la confluence est d’environ 80 à 100 % confluente à l’aide d’un microscope inversé.
  3. Dans l’enceinte de biosécurité, à l’aide d’une pipette sérologique, aspirer le milieu usagé de la fiole de culture cellulaire. Évitez de toucher la surface ou le plastique de la fiole. Jetez le support usagé et l’aspirateur dans le conteneur à déchets.
  4. Lavez délicatement les cellules avec environ 10 ml de DPBS en l’aspirant dans un coin du ballon et en le faisant tourner doucement sur la surface. Aspirez le DPBS de la fiole et jetez le produit de lavage et l’aspirateur dans le conteneur à déchets.
  5. Ajouter 1,5 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % pour couvrir la surface du ballon et incuber à température ambiante pendant 1 min. Tapotez doucement le ballon pour détacher les cellules de la surface.
  6. Ajouter 8,5 ml de DMEM frais dans la fiole. Remettre les cellules en suspension et mélanger à l’aide d’une pipette sérologique jusqu’à ce que tous les agrégats aient été brisés par aspiration vers le haut et vers le bas.
  7. Prélever 9 mL de suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL.
    1. Ajouter 9 mL de DMEM frais dans la fiole et la placer dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2
  8. À l’aide d’un hémocytomètre, mélangez 10 μL de cellules en suspension avec 10 μL de colorant bleu de trypan dans un rapport de 1:1 pour calculer la concentration des cellules. Utilisez cette valeur pour préparer suffisamment de cellules à ensemencer sur la plaque.
  9. Ensemencez ~35 000 cellules dans 100 μL pour chaque puits d’une plaque inférieure en verre noir haute performance #1,5 à 96 puits et placez-les dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h.

2. Optimisation de la transfection 2pLACE

  1. Pour un puits et un excédent de 10 %, aliquote 11 μL de DMEM chaud sans sérum (SFM) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
  2. À l’aide d’un rapport de masse plasmidique CRY2-eGFP : CIBN-gRNA égal à 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 et 9:1, aliquote 110 ng pour chaque puits d’ADN total aux aliquotes de SFM (Tableau 1).
  3. En tant que témoin positif, aliquote la même masse de plasmide CMV-eGFP à différentes aliquotes de SFM.
  4. Pour chaque puits, aliquote 11 μL de SFM pour la dilution du réactif de transfection.
  5. Préparez le réactif de transfection selon un rapport masse/volume (μL) de 1:3 entre l’ADN et le réactif de transfection.
  6. Ajoutez un réactif de transfection dilué à l’ADN dilué et incubez pendant 12 minutes à température ambiante pour créer les complexes de transfection.
  7. Ajouter ~20 μL du complexe de transfection dans chaque puits. Assurez-vous qu’il ne touche pas les parois du puits.
  8. Enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium et placez-la dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h.

3. Activation de 2pLACE

  1. Modifiez le code d’entrée du microcontrôleur pour éclairer les puits souhaités à l’aide de ces paramètres (Fichier de codage supplémentaire 1, lignes 147 - 158).
    1. Intensité des LED : 9,27 mW/cm2 (fichier de codage supplémentaire 1, lignes 200 - 215).
    2. Durée de l’impulsion : 1 s (Fichier de codage supplémentaire 1, lignes 280 à 290).
    3. Fréquence d’impulsion : 0,067 Hz (toutes les 15 s) (Fichier de codage supplémentaire 1, lignes 264 à 278).
      REMARQUE : Les paramètres de longueur d’onde sont déterminés par les types de LED installées.
  2. Vaporisez le couvercle imprimé en 3D de l’OptoPlate avec de l’éthanol à 70 % et laissez-le sécher dans une enceinte de biosécurité.
  3. Allumez une lampe à lumière rouge dans une chambre noire et placez la plaque à 96 puits dans une enceinte de biosécurité, puis remplacez le couvercle par le couvercle séché imprimé en 3D.
    REMARQUE : On peut éventuellement visualiser les cellules CMV-eGFP à l’aide de la microscopie à fluorescence pour estimer l’efficacité de la transfection.
  4. Prenez la plaque de 96 puits et placez-la sur le réseau de LED pour construire l’appareil du réseau de LED. Assurez-vous que la plaque s’enclenche.
  5. Connectez les ports du microcontrôleur, de la LED et du ventilateur à une source d’alimentation.
  6. Vaporisez soigneusement les fils avec de l’éthanol à 70 % et essuyez-les.
  7. Placez l’appareil à LED dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h. Assurez-vous que les LED s’allument comme prévu et que les fils ne sont pas tendus lorsque l’incubateur est scellé.

4. Préparation de la cytométrie en flux

  1. Dans un environnement chaud, retirez l’OptoPlate et placez-la dans une enceinte de biosécurité
    REMARQUE : On peut éventuellement visualiser les cellules par microscopie à fluorescence pour confirmer visuellement l’induction de la lumière.
  2. Aspirez soigneusement tous les fluides de chaque puits.
  3. Détachez les cellules à l’aide de 30 μL de trypsine-EDTA à 0,05 % et incubez pendant 1 min à température ambiante.
  4. Mélangez chaque puits avec 100 μL de tampon FACS froid (1 % FBS dans PBS) jusqu’à ce qu’ils soient unicellulaires.
  5. Transférez chaque échantillon dans une plaque à fond en V de 96 puits.
  6. Centrifuger la plaque à 96 puits à fond en V à 164 x g pendant 10 min à température ambiante.
  7. Aspirer 80 μL de surnageant sans perturber la pastille.
  8. Ajouter 200 μL de tampon FACS froid pour remettre la pastille en suspension.
  9. Enveloppez la plaque à fond en V de 96 puits dans une feuille d’aluminium pour une isolation légère.
  10. Placez l’assiette dans une boîte en polystyrène avec de la glace pour le transport.

5. Cytométrie en flux, contrôle et collecte de données

  1. Allumez le cytomètre en flux à l’aide de l’interrupteur situé à l’arrière et ouvrez le logiciel de cytométrie en flux correspondant sur l’ordinateur.
  2. Exécutez le programme de démarrage du système et chargez 2 ml d’eau DI dans le chargeur d’échantillons (Figure supplémentaire 1A).
  3. Effectuez le contrôle de la qualité (CQ) à l’aide des billes de CQ fournies (Figure supplémentaire 1B).
  4. Assurez-vous que le cytomètre en flux est en mode d’échantillonnage sur plaque (figure supplémentaire 1C).
  5. Configurez et spécifiez les puits d’échantillonnage (figure supplémentaire 1D).
  6. Créez les diagrammes de dispersion et les tableaux suivants (Figure supplémentaire 2A).
    1. Diffusion latérale (SSC-A) vs diffusion directe (FSC-A).
    2. SSC-H contre SSC-A.
    3. SSC-A contre FITC-A.
    4. Tableau des statistiques FITC-A (figure supplémentaire 2B).
  7. Enclenchez la plaque à fond en V dans le chargeur de plaques du cytomètre.
  8. Sélectionnez un puits non transfecté et cliquez sur Initialiser, puis sur Exécuter.Assurez-vous que la fréquence d’échantillonnage volumique est de 10 μL/min (Figure supplémentaire 2C).
  9. Ajustez les tensions SSC et FITC pour centrer la population d’intérêt sur le graphique SSC-A vs FSC-A (Figure supplémentaire 2C).
    1. Créez un polygone pour contrôler la population de cellules saines d’intérêt (figure supplémentaire 2D).
    2. Créez un polygone à contrôler pour la discrimination des doublets sur le tracé SSC-H vs SSC-A.
    3. Ajustez la tension FITC pour placer les cellules non transfectées vers la gauche du tracé SSC-A vs FITC-A (Figure supplémentaire 2D).
  10. Répétez l’opération pour les puits non transfectés restants et enregistrez les données FITC-A moyennes.
  11. Sélectionnez un CMV-eGFP bien transfecté et cliquez sur Exécuter.
  12. Ajustez la tension FITC pour capturer à la fois les cellules autofluorescentes et fluorescentes dans le tracé SSC-A vs FITC-A.
    1. Créez un polygone pour comparer les cellules fluorescentes aux cellules non fluorescentes tout en faisant référence à la porte initiale dans les cellules non transfectées (figure supplémentaire 2E).
  13. Enregistrer automatiquement les échantillons à 60 μL/min jusqu’à ce que 200 s aient été atteintes et/ou que les événements aient atteint 10 000 (figure supplémentaire 2F).
  14. Exportez Mean FITC sous forme de fichier CSV et analysez les données.
  15. Nettoyez le cytomètre en flux à l’aide de l’option de nettoyage quotidien (Figure supplémentaire 2G).

6. Optimisation de l’intensité des LED

  1. Modifiez le script du microcontrôleur pour tester les intensités de LED souhaitées (Fichier de codage supplémentaire 1, lignes 200-215).
    REMARQUE : Les intensités de LED équivalentes par rapport aux valeurs dans le script du microcontrôleur sont signalées ailleurs38. L’auto-étalonnage peut être nécessaire lors de l’utilisation de différentes LED.
  2. Assurez-vous que le script contient les valeurs suivantes dans (Fichier de codage supplémentaire 1, lignes 200-215) comme indiqué dans le Tableau 2, et téléchargez le code sur le microcontrôleur.
  3. Répétez les étapes 1 à 5.

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Résultats

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En reprenant des éléments de flux de travail de la littérature précédente 37,38,55, nous avons ajouté un éclairage simultané à haut débit de l’OptoPlate-96 et démontré un pipeline permettant d’optimiser rapidement un système d’expression génique inductible par la lumière dans les cellules de mammifères (Figure 1).

Pour les systèmes d’expr...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole démontre le contrôle optogénétique de l’expression d’un gène transitoire à plusieurs composants dans les cellules de mammifères, permettant à d’autres chercheurs de caractériser rapidement et simultanément des systèmes optogénétiques modulaires avec un rapporteur fluorescent.

Dans ce cas, un système inductible par la lumière à deux plasmides a été optimisé pour l’expression de l’eGFP dans HEK293T cellules. Pour une co-transfection réussie, il est ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail est soutenu par l’Institut de recherche translationnelle par le biais de l’accord de coopération de la NASA NNX16AO69A et par le Good Foods Institute. Ce projet a été soutenu par le Flow Cytometry Shared Resource Laboratory de l’UC Davis avec l’assistance technique de Bridget McLaughlin, Jonathan Van Dyke et Ashley Karajeh, avec le financement du NCI P30 CA093373 (Comprehensive Cancer Center) et du S10OD018223 (cytomètre Beckman Coulter « Cytoflex »).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes microcentrifugeuses de 1,5 mLVWR10025-724
Réservoirs de réactifs de 10 mLVWR77395-252
Pipettes sérologiques de 10 mLVWR75816-100
1000 & mu ; Embouts du filtre en LVWR76322-154
15 mL  ; Tubes centrifugeuses haute performance, bouchon platVWR89039-664
Mesureur de puissance optique 1931-CNewport1931-C
Pipettes sérologiques de 2 mLVWR75816-104
20 & mu ; Embouts du filtre en LVWR76322-134
200 & mu ; Embouts du filtre en LVWR76322-150
Tubes centrifugeuses haute performance de 50 mL, bouchon platVWR89039-656
Plaques à fond en V à 96 puitsPLAQUES DE MARQUE781661
A21, ampoule LED rougeAmpoules BluexN/ASource lumineuse rouge
Logiciel IDE ArduinoArduinoN/A
Armoire de biosécurité, classe IINuAireN/A
Hémocytomètre à ligne claireHausser Scientific3110
Diapositives de comptage cellulaireBioRad1450016
Plaque de culture cellulaire à 96 puits, plaque inférieure en verre #1,5HCellvisP96-1.5H-N
CytExpert SoftwareBeckman CoulterN/A
CytoFLEX Prêts à utiliser les fluorosphères QC quotidiennesBeckman CoulterC657194 & deg ; C
Cytomètre de flux CytoFLEX-S (4 canaux violet, 2 bleus, 4 jaune-vert, 3 rouges)Beckman CoulterC09766
Sauve sésale tamponnée phosphate de Dulbecco, sans calicum, sans magnésiumFisher Scientific21600069Température ambiante
Centrifugeuse Eppendorf 5804Eppendorf  ; 022622501Étape centrifugeuse à plaque en V
Centrifugeuse Eppendorf 5810REppendorf22625501
Eppendorf Research plus, 8 canaux, volume variable, 30 - 300 & mu ; LEppendorf3125000052
Eppendorf Research plus, mono-canal, volume variable, 100 - 1000 & mu ; LEppendorf3123000063
Eppendorf Research plus, mono-canal, volume variable, 2 - 20 et mu ; LEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus, mono-canal, volume variable, 20 - 200 & mu ; LEppendorf3123000055
Ruban d’étiquetage polyvalent de laboratoireVWR89097-920
DMEM Gibco, poudre, glycémie élevéeFisher Scientific121000614 & deg ; C
Solution bleue Gibco Trypan, 0,4 %Fisher Scientific15-250-061Température ambiante
Gibco Value Heat Inactivated FBSFisher ScientificA5256901-20 & degrés C
Gibco, Trypsine-EDTA (0,05 %), avec EDTA, origine animale, 1X, Phénol rouge, 500 mLGibco25300062-20 & degrés C
HEK293T CellulesATCCCRL-11268-80 ° ; C, azote liquide
Marqueurs de laboratoire, MicronovaVWR89205-944
Lampe de bureau en métalDesigns simplesN/ALampe pour la lumière rouge
OptoPlate-96LABmakerN/A
XP de l’aide aux pipetsDrummond4-000-101
Plasmide : CIBN-gRNAN/AN/A-20 & degrés C
Plasmide : CMV-eGFPN/AN/A-20 & degrés C
Plasmide : CRY2-eGFPN/AN/A-20 & degrés C
Réactif de transfection in vitro à l’ADN PolyJetFisher ScientificNC15361174 & deg ; C
Flasque de culture cellulaire T-75VWR10062-860
Incubateur CO<2/sous> chemise d’eauVWR10810-884

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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