Optimisation rapide d’un système inductible par la lumière pour contrôler l’expression génique de mammifères

Les outils de biologie synthétique tels que les systèmes d’expression génique inductibles ont apporté des contributions importantes à la recherche biologique. Leur capacité à réguler l’expression des gènes de manière réglable, réversible et précise peut améliorer le contrôle de la production de protéines 1,2,3,4,5,6, de la morphologie cellulaire ^{7,8,9,10,11,12}, des voies métaboliques 13,14,15^,16,17,18, et d’autres cibles pour la biofabrication et les applications thérapeutiques. Les systèmes inductibles chimiques peuvent avoir des effets résiduels^19,20 ou hors cible. Les additifs chimiques peuvent également être très coûteux et difficiles à mettre à l’échelle industriellement en raison de processus de purification supplémentaires en aval 21,22,23. Les systèmes d’expression génique inductibles par la lumière peuvent offrir une méthode évolutive et précise pour les pratiques de biofabrication 24,25,26,27.

De nombreux systèmes d’expression génique inductibles par la lumière ont été développés comme outils de biologie synthétique utiles dans une variété d’applications 28,29,30,31,32,33,34,35,36 et les longueurs d’onde du bleu 35,37,38, rouge/rouge lointain^12,39,⁴⁰, ou vert⁴¹ clair. Dans le cas de la régulation des gènes optogénétiques basée sur CRISPR, la modification de la quantité d’ARN guides individuels (ARNg) délivrés peut affecter l’expression de l’ARNm des gènes endogènes⁴² et devra être optimisée pour différentes lignées cellulaires. Des protéines de transactivation telles que VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p65⁴⁴, ou des fusions de ceux-ci 47 peuvent également être utilisées, augmentant ainsi la modularité des systèmes optogénétiques. Afin d’étudier des voies biologiques complexes et entrelacées 12,40,48,49,50,51,52,53, différentes combinaisons de ces composants connus peuvent être testées. De plus, différentes lignées cellulaires peuvent présenter des différences d’induction avec le même système⁵². Différents niveaux d’induction peuvent conduire à une expression génique insuffisante ou à une sensibilité insuffisante dans le contrôle précis de l’expression génique, nécessitant des tests rigoureux pour trouver un système optogénétique optimal dans des lignées cellulaires nouvelles ou plus pertinentes sur le plan biologique. Avec un rythme croissant et une applicabilité croissante de la régulation des gènes optogénétiques, il est impératif de caractériser rapidement ces différents systèmes.

Les méthodes actuelles de caractérisation des outils optogénétiques utilisent l’expression stable ou transitoire des gènes^12,54. La génération de lignées cellulaires exprimant de manière stable et l’optimisation de la dynamique du système pour une expression maximale peuvent prendre du temps et donc être coûteuses. L’expression transitoire permet d’obtenir des informations rapides et précieuses, en particulier lors du test de systèmes optogénétiques à plusieurs composants. Ici, nous avons utilisé le système effecteur CRISPR-dCas9 activé par la lumière bleue (LACE)³⁷, composé de cryptochrome 2 (CRY2) et de CIBN (basic-helix-loop-helix N-terminal) interagissant avec le cryptochrome. Il a été utilisé pour contrôler l’expression génique dans des cellules de mammifères telles que HEK293T (cellules rénales embryonnaires humaines)^37,38, CHO-DG44 (cellules ovariennes de hamster chinois)⁵⁵ et C2C12 (cellules myoblastiques de souris)³⁸. Sa nature modulaire est idéale pour caractériser rapidement les performances du système par des méthodes d’expression transitoire et à haut débit. Par exemple, les systèmes à plusieurs composants comme LACE peuvent nécessiter une optimisation des rapports de masse pour améliorer l’induction, une étape qui n’est généralement pas utilisée dans la caractérisation des systèmes optogénétiques.

Ce protocole détaille l’optimisation et la caractérisation rapides du système LACE à deux plasmides (2pLACE)³⁸. Dans cette configuration, 2pLACE contrôle l’expression d’un rapporteur fluorescent, eGFP (enhanced green fluorescent protein), dans HEK293T cellules. L’activation est effectuée dans des plaques à 96 puits à fond de verre noir à l’aide d’une OptoPlate-96, un réseau de LED imprimé en 3D conçu et construit par Lukasz Bugaj et ses collègues 56,57,58,59. Ce protocole optimise spécifiquement l’expression maximale avec différents rapports de masse du système à deux plasmides. Il comprend également un code convivial permettant de contrôler différentes intensités lumineuses afin d’étudier l’accordabilité du système et sa plage dynamique complète. La cytométrie en flux est utilisée pour la collecte et l’analyse des données. Les protocoles de génération de constructions plasmidiques et de matériaux d’impression 3D pour le réseau de LED peuvent être trouvés dans des publications précédentes^54,56. Ces méthodes mettent en évidence un pipeline rapide et à haut débit pour caractériser les systèmes d’expression génique inductibles par la lumière.

1. Placage HEK293T cellules dans un format de 96 puits

1. Dans une enceinte de biosécurité, récupérez un contenant de déchets d’eau de Javel, des pipettes sérologiques, un aide-pipette, une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS), un milieu d’aigle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS) et un flacon de culture cellulaire T-75 avec des cellules de HEK293T confluentes. Préchauffez le milieu à 37 °C.
2. Dans une fiole T-75, vérifiez que la confluence est d’environ 80 à 100 % confluente à l’aide d’un microscope inversé.
3. Dans l’enceinte de biosécurité, à l’aide d’une pipette sérologique, aspirer le milieu usagé de la fiole de culture cellulaire. Évitez de toucher la surface ou le plastique de la fiole. Jetez le support usagé et l’aspirateur dans le conteneur à déchets.
4. Lavez délicatement les cellules avec environ 10 ml de DPBS en l’aspirant dans un coin du ballon et en le faisant tourner doucement sur la surface. Aspirez le DPBS de la fiole et jetez le produit de lavage et l’aspirateur dans le conteneur à déchets.
5. Ajouter 1,5 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % pour couvrir la surface du ballon et incuber à température ambiante pendant 1 min. Tapotez doucement le ballon pour détacher les cellules de la surface.
6. Ajouter 8,5 ml de DMEM frais dans la fiole. Remettre les cellules en suspension et mélanger à l’aide d’une pipette sérologique jusqu’à ce que tous les agrégats aient été brisés par aspiration vers le haut et vers le bas.
7. Prélever 9 mL de suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL.
   1. Ajouter 9 mL de DMEM frais dans la fiole et la placer dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂
8. À l’aide d’un hémocytomètre, mélangez 10 μL de cellules en suspension avec 10 μL de colorant bleu de trypan dans un rapport de 1:1 pour calculer la concentration des cellules. Utilisez cette valeur pour préparer suffisamment de cellules à ensemencer sur la plaque.
9. Ensemencez ~35 000 cellules dans 100 μL pour chaque puits d’une plaque inférieure en verre noir haute performance #1,5 à 96 puits et placez-les dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 h.

2. Optimisation de la transfection 2pLACE

1. Pour un puits et un excédent de 10 %, aliquote 11 μL de DMEM chaud sans sérum (SFM) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
2. À l’aide d’un rapport de masse plasmidique CRY2-eGFP : CIBN-gRNA égal à 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 et 9:1, aliquote 110 ng pour chaque puits d’ADN total aux aliquotes de SFM (Tableau 1).
3. En tant que témoin positif, aliquote la même masse de plasmide CMV-eGFP à différentes aliquotes de SFM.
4. Pour chaque puits, aliquote 11 μL de SFM pour la dilution du réactif de transfection.
5. Préparez le réactif de transfection selon un rapport masse/volume (μL) de 1:3 entre l’ADN et le réactif de transfection.
6. Ajoutez un réactif de transfection dilué à l’ADN dilué et incubez pendant 12 minutes à température ambiante pour créer les complexes de transfection.
7. Ajouter ~20 μL du complexe de transfection dans chaque puits. Assurez-vous qu’il ne touche pas les parois du puits.
8. Enveloppez la plaque dans du papier d’aluminium et placez-la dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 h.

3. Activation de 2pLACE

1. Modifiez le code d’entrée du microcontrôleur pour éclairer les puits souhaités à l’aide de ces paramètres (Fichier de codage supplémentaire 1, lignes 147 - 158).
   1. Intensité des LED : 9,27 mW/cm² (fichier de codage supplémentaire 1, lignes 200 - 215).
   2. Durée de l’impulsion : 1 s (Fichier de codage supplémentaire 1, lignes 280 à 290).
   3. Fréquence d’impulsion : 0,067 Hz (toutes les 15 s) (Fichier de codage supplémentaire 1, lignes 264 à 278).
      REMARQUE : Les paramètres de longueur d’onde sont déterminés par les types de LED installées.
2. Vaporisez le couvercle imprimé en 3D de l’OptoPlate avec de l’éthanol à 70 % et laissez-le sécher dans une enceinte de biosécurité.
3. Allumez une lampe à lumière rouge dans une chambre noire et placez la plaque à 96 puits dans une enceinte de biosécurité, puis remplacez le couvercle par le couvercle séché imprimé en 3D.
   REMARQUE : On peut éventuellement visualiser les cellules CMV-eGFP à l’aide de la microscopie à fluorescence pour estimer l’efficacité de la transfection.
4. Prenez la plaque de 96 puits et placez-la sur le réseau de LED pour construire l’appareil du réseau de LED. Assurez-vous que la plaque s’enclenche.
5. Connectez les ports du microcontrôleur, de la LED et du ventilateur à une source d’alimentation.
6. Vaporisez soigneusement les fils avec de l’éthanol à 70 % et essuyez-les.
7. Placez l’appareil à LED dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 24 h. Assurez-vous que les LED s’allument comme prévu et que les fils ne sont pas tendus lorsque l’incubateur est scellé.

4. Préparation de la cytométrie en flux

1. Dans un environnement chaud, retirez l’OptoPlate et placez-la dans une enceinte de biosécurité
   REMARQUE : On peut éventuellement visualiser les cellules par microscopie à fluorescence pour confirmer visuellement l’induction de la lumière.
2. Aspirez soigneusement tous les fluides de chaque puits.
3. Détachez les cellules à l’aide de 30 μL de trypsine-EDTA à 0,05 % et incubez pendant 1 min à température ambiante.
4. Mélangez chaque puits avec 100 μL de tampon FACS froid (1 % FBS dans PBS) jusqu’à ce qu’ils soient unicellulaires.
5. Transférez chaque échantillon dans une plaque à fond en V de 96 puits.
6. Centrifuger la plaque à 96 puits à fond en V à 164 x g pendant 10 min à température ambiante.
7. Aspirer 80 μL de surnageant sans perturber la pastille.
8. Ajouter 200 μL de tampon FACS froid pour remettre la pastille en suspension.
9. Enveloppez la plaque à fond en V de 96 puits dans une feuille d’aluminium pour une isolation légère.
10. Placez l’assiette dans une boîte en polystyrène avec de la glace pour le transport.

5. Cytométrie en flux, contrôle et collecte de données

1. Allumez le cytomètre en flux à l’aide de l’interrupteur situé à l’arrière et ouvrez le logiciel de cytométrie en flux correspondant sur l’ordinateur.
2. Exécutez le programme de démarrage du système et chargez 2 ml d’eau DI dans le chargeur d’échantillons (Figure supplémentaire 1A).
3. Effectuez le contrôle de la qualité (CQ) à l’aide des billes de CQ fournies (Figure supplémentaire 1B).
4. Assurez-vous que le cytomètre en flux est en mode d’échantillonnage sur plaque (figure supplémentaire 1C).
5. Configurez et spécifiez les puits d’échantillonnage (figure supplémentaire 1D).
6. Créez les diagrammes de dispersion et les tableaux suivants (Figure supplémentaire 2A).
   1. Diffusion latérale (SSC-A) vs diffusion directe (FSC-A).
   2. SSC-H contre SSC-A.
   3. SSC-A contre FITC-A.
   4. Tableau des statistiques FITC-A (figure supplémentaire 2B).
7. Enclenchez la plaque à fond en V dans le chargeur de plaques du cytomètre.
8. Sélectionnez un puits non transfecté et cliquez sur Initialiser, puis sur Exécuter.Assurez-vous que la fréquence d’échantillonnage volumique est de 10 μL/min (Figure supplémentaire 2C).
9. Ajustez les tensions SSC et FITC pour centrer la population d’intérêt sur le graphique SSC-A vs FSC-A (Figure supplémentaire 2C).
   1. Créez un polygone pour contrôler la population de cellules saines d’intérêt (figure supplémentaire 2D).
   2. Créez un polygone à contrôler pour la discrimination des doublets sur le tracé SSC-H vs SSC-A.
   3. Ajustez la tension FITC pour placer les cellules non transfectées vers la gauche du tracé SSC-A vs FITC-A (Figure supplémentaire 2D).
10. Répétez l’opération pour les puits non transfectés restants et enregistrez les données FITC-A moyennes.
11. Sélectionnez un CMV-eGFP bien transfecté et cliquez sur Exécuter.
12. Ajustez la tension FITC pour capturer à la fois les cellules autofluorescentes et fluorescentes dans le tracé SSC-A vs FITC-A.
    1. Créez un polygone pour comparer les cellules fluorescentes aux cellules non fluorescentes tout en faisant référence à la porte initiale dans les cellules non transfectées (figure supplémentaire 2E).
13. Enregistrer automatiquement les échantillons à 60 μL/min jusqu’à ce que 200 s aient été atteintes et/ou que les événements aient atteint 10 000 (figure supplémentaire 2F).
14. Exportez Mean FITC sous forme de fichier CSV et analysez les données.
15. Nettoyez le cytomètre en flux à l’aide de l’option de nettoyage quotidien (Figure supplémentaire 2G).

6. Optimisation de l’intensité des LED

1. Modifiez le script du microcontrôleur pour tester les intensités de LED souhaitées (Fichier de codage supplémentaire 1, lignes 200-215).
   REMARQUE : Les intensités de LED équivalentes par rapport aux valeurs dans le script du microcontrôleur sont signalées ailleurs³⁸. L’auto-étalonnage peut être nécessaire lors de l’utilisation de différentes LED.
2. Assurez-vous que le script contient les valeurs suivantes dans (Fichier de codage supplémentaire 1, lignes 200-215) comme indiqué dans le Tableau 2, et téléchargez le code sur le microcontrôleur.
3. Répétez les étapes 1 à 5.

En reprenant des éléments de flux de travail de la littérature précédente 37,38,55, nous avons ajouté un éclairage simultané à haut débit de l’OptoPlate-96 et démontré un pipeline permettant d’optimiser rapidement un système d’expression génique inductible par la lumière dans les cellules de mammifères (Figure 1).

Pour les systèmes d’expression génique inductibles, des plages dynamiques élevées sont un marqueur de performance critique, en plus de l’expression absolue activée et désactivée (fuyante). Avec l’imagerie par fluorescence des cellules transfectées, la différence d’expression de l’eGFP entre les cellules activées par la lumière et les cellules maintenues dans l’obscurité peut être observée qualitativement (Figure 2). Un rapport de 1:9 entraîne visiblement une expression eGFP maximale inférieure à celle d’un rapport de 5:5. On peut également observer qu’il y a une augmentation des fuites dans le rapport 5:5. L’imagerie par fluorescence d’une cellule transfectée eGFP exprimant constitutivement (CMV-eGFP) et de cellules non transfectées est un contrôle positif et négatif précieux pour contextualiser l’efficacité de la transfection et l’expression induite et fuyante du système, respectivement. L’utilisation de l’imagerie par fluorescence permet aux utilisateurs de voir et de valider rapidement la transfection et l’activation réussies de l’expression génique avec la lumière bleue, fournissant un point de contrôle précieux avant la cytométrie en flux. La cytométrie en flux peut ensuite être utilisée pour quantifier l’intensité moyenne de fluorescence (MFI) et la plage dynamique.

Après avoir activé la lumière, les cellules sont préparées avec un tampon FACS et analysées par cytométrie en flux. HEK293T cellules mesurent environ 11 à 15 μm, ce qui donne un gain FSC de 500 et un gain SSC de 125 (figure supplémentaire 2C) pour centrer les populations de cellules saines. Des tensions plus élevées entraînent l’analyse de débris plutôt que de populations de cellules saines. Nos parcours ont systématiquement plus de ~60 % des événements dans la première porte de population (P1) (Figure 3A-D). Une fois que les populations de cellules saines constituent la plupart des événements dans le graphique SSC-A vs FSC-A, la densité des événements peut également être vérifiée pour identifier la majorité de la population (figure supplémentaire 3A). Ensuite, la discrimination des doublets peut être effectuée à travers le tracé SSC-H vs SSC-A, ce qui est crucial pour des résultats fiables et reproductibles60,61. Dans ce système, nous avons généralement constaté que plus de 95 % des événements déclenchés dans P1 étaient des singlets (Figure 3A-D). Dans le graphique SSC-A vs FITC-A, les cellules non transfectées se trouvent généralement vers la gauche du centre du graphique et sont limitées à une population de <0,1 % (figure 3A). Ensuite, les cellules eGFP-positives rempliront la porte qui était vide dans l’échantillon non transfecté, ce qui entraînera des mesures d’analyse de MFI sur cellule unique (Figure 3B). Une fois que les commandes négative et positive sont collectées pour définir les portes et les tensions appropriées, les échantillons avec 2pLACE peuvent être analysés à l’aide des mêmes portes pour exclure de manière fiable les cellules autofluorescentes (Figure 3C,D). Ici, le pourcentage de population pour les cellules positives à l’eGFP était de ~99 % pour le CMV-eGFP et de ~57 % pour les cellules transfectées par 2pLACE. Une dernière porte peut également être utilisée sur le canal PE-A pour garantir la capture des cellules hautement fluorescentes (figure supplémentaire 3B).

Un autre rapport qui a été choisi pour tester était 3:7. Comme étape de validation, des images de microscopie à fluorescence ont été prises avant la cytométrie en flux et ont permis d’observer une transfection réussie pour l’induction de l’expression de l’eGFP avec 2pLACE, ce qui était inférieur à celui du CMV-eGFP (Figure 4A). Après avoir recueilli les données de cytométrie en flux de 2pLACE, l’expression génique activée par la lumière bleue peut être comparée à l’expression génique perméable (Figure 4B). En utilisant les paramètres répertoriés à l’étape 3.1, nous avons pu observer une augmentation de ~3 fois de l’expression après l’activation de la lumière bleue, ce qui correspond à l’augmentation qualitative du signal de fluorescence observée par la microscopie. De plus, l’efficacité de la transfection peut être observée indirectement en mesurant le pourcentage de population eGFP positive, ou pourcentage parent, à ~60 % de cellules uniques saines (Figure 4C).

La mise en œuvre de ce protocole dans son intégralité permet d’identifier les rapports de masse (Figure 5A) et les intensités lumineuses (Figure 5B) optimaux pour une plage dynamique maximale et une expression réglable. Les rapports de masse inférieurs à 6:4 présentaient une plage dynamique plus grande (3,5-4,5), tandis que les rapports de masse supérieurs à 6:4 présentaient une plage dynamique réduite en raison de l’augmentation du bruit de fond et de la diminution de l’expression maximale de l’eGFP. Pour l’expression maximale et la plage dynamique élevée, un rapport de 3:7 est préférable. Les rapports inférieurs à 3:7 ont montré des inductions de pli similaires mais avaient moins d’expression maximale globale. En utilisant nos valeurs d’intensité lumineuse précédemment calibrées38 (Tableau 2), on peut caractériser le niveau d’expression des gènes par rapport à différentes intensités lumineuses. Les intensités lumineuses ont également contrôlé les niveaux d’expression de l’eGFP, où MFI sature à ~3 mW/cm2. Les intensités lumineuses au-delà de cette intensité peuvent avoir des valeurs MFI variables, probablement en raison du photoblanchiment dans certains échantillons, comme on le voit à ~9 et 11 mW/cm2.

Figure 1 : Pipeline général d’expériences à haut débit testant des systèmes optogénétiques. Les cellules sont ensemences dans une plaque noire de 96 puits pendant 24 h. Ensuite, les cellules sont transfectées avec une période d’incubation de 12 minutes d’ADN et de réactif de transfection. 24 h après la transfection, la plaque est placée sur l’OptoPlate-96 pour l’activation de la lumière bleue. Après la durée souhaitée d’activation de la lumière bleue, les cellules sont préparées dans un environnement de lumière rouge pour la cytométrie en flux. Les données de cytométrie en flux sont représentées sous forme de graphiques d’intensité de fluorescence moyenne de cellules eGFP-positives dans l’obscurité ou traitées avec de la lumière bleue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Images représentatives en microscopie à fluorescence de 2pLACE à l’état allumé et éteint dans les cellules HEK293T. Différents rapports de masse de CRY2-eGFP : CIBN-gRNA ont été testés pour les niveaux d’expression de l’eGFP. Les cellules ont été exposées à la lumière bleue (ON) ou maintenues dans l’obscurité (OFF) pendant 24 h. La barre d’échelle représente 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Nuages de points représentatifs de cytométrie en flux de cellules HEK293T non transfectées (UT), CMV-eGFP et 2pLACE. La cytométrie en flux a été réalisée à l’aide de la fonction de chargement de plaques. (A) HEK293T cellules ont été contrôlées en fonction de la diffusion vers l’avant (FSC-A) et de la diffusion latérale (SSC-A). La concentration des événements sur les parcelles SSC-A par rapport aux parcelles FSC-A peut être visualisée à l’aide d’un graphique de contour (figure supplémentaire 3A) pour aider à bloquer les populations saines. La discrimination doublet a été réalisée sur un tracé SSC-H vs. SSC-A à l’aide d’une porte linéaire. Le tracé final a bloqué les cellules fluorescentes en faisant référence à l’échantillon non transfecté. (B) Les cellules ont été fermées comme en (A), montrant la population fluorescente et l’intensité de la fluorescence dans le tableau statistique (figure supplémentaire 2B). (C,D) Les cellules transfectées par 2pLACE ont été séparées par la porte P3. La population magenta représente toutes les cellules eGFP positives (figure supplémentaire 3B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse qualitative et quantitative de l’expression de l’eGFP induite par la lumière dans HEK293T cellules. (A) Images de microscopie à fluorescence de cellules HEK293T transfectées avec des plasmides 2pLACE ou CMV-eGFP. (B) Quantification de l’intensité moyenne de fluorescence (MFI) de l’eGFP dans les cellules maintenues dans des conditions de lumière bleue ou d’obscurité. (C) Pourcentage de cellules eGFP-positives mesurées par analyse de cytométrie en flux. Le déclenchement a permis de faire en sorte que <0,1 % des cellules non transfectées se situent sous le seuil eGFP-positif. Les données de cytométrie en flux représentent des valeurs moyennes, et les barres d’erreur indiquent les écarts-types de quatre répétitions techniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Cytométrie en flux des rapports de masse représentatifs des intensités de 2pLACE et de la lumière bleue. (A) Divers rapports de masse de CRY2-eGFP : CIBN-gRNA ont été transfectés dans HEK293T cellules, qui ont ensuite été exposées à la lumière bleue ou maintenues dans l’obscurité en utilisant les mêmes paramètres que ceux indiqués à l’étape 3 du protocole. Chaque condition est la moyenne de 3 réplicats biologiques. (B) Tendance représentative de l’expression des gènes en fonction de l’intensité de la lumière bleue. Chaque condition est la moyenne de 6 répétitions techniques. Les intensités moyennes de fluorescence sont quantifiées par cytomètre en flux des cellules exprimant l’eGFP. Toutes les barres d’erreur représentent l’écart-type. Pour les rapports plasmidiques, la signification statistique de l’IFM a été calculée à l’aide d’un test t unidirectionnel comparant la lumière et l’obscurité d’un rapport plasmidique. Pour les intensités lumineuses, la signification statistique a été calculée à l’aide de l’ANOVA à un facteur et du test post-hoc T2 de Tamhane par rapport à l’état sombre (OFF). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p <0,0001, *****p < 0,00001 et ns n’est pas significatif. Cette figure a été adaptée de Garimella et al.38. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Quantité de plasmides CRY2-eGFP et CIBN-gRNA par puits à l’aide d’exemples de concentrations. Les quantités de volume sont par puits et peuvent être modifiées en fonction du nombre d’échantillons ou de répétitions dans une expérience. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Valeurs recommandées pour les intensités de lumière bleue. Le code se trouve dans le fichier de codage supplémentaire 1 (lignes 215 à 228). Les valeurs d’intensité équivalente sont calculées à l’aide des données d’étalonnage précédemment rapportées à l’aide d’un wattmètre optique. Chaque niveau d’intensité comporte 6 répliques techniques. Les rangées G et H sont destinées aux CMV-eGFP et aux puits de contrôle non transfectés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure supplémentaire 1 : Étapes 5.1 à 5.5 du protocole. (A) Exécution du programme de démarrage du système. (B) Normalisation du contrôle de la qualité à l’aide de billes de fluorophore. (C) Passage de l’échantillonnage de tubes au mode de chargement de plaques. (D) Sélection des puits à étiqueter comme puits échantillons ; 35 puits ont été retenus pour cet exemple. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Étapes 5.6 à 5.14 du protocole. (A) Mise en place de tracés de diffusion de la lumière : FSC-A vs. SSC-A pour le gating de population cellulaire saine, SSC-A vs. SSC-H pour la discrimination des doublets, et SSC-A vs. FITC-A pour le gating des cellules autofluorescentes et eGFP positives. (B) Mise en place du tableau statistique pour l’acquisition des données FITC-A afin de mesurer l’intensité moyenne de fluorescence. (C) Mise en évidence des règles d’arrêt dans l’onglet Événements à afficher. Assurez-vous d’un débit d’échantillon lent, éjectez et chargez la plaque, initialisez la sonde du cytomètre en flux et ajustez les tensions d’acquisition. (D) Création de polygones pour contrôler chaque population comme indiqué. (E) Ajouter le nombre approprié de puits. (F) En cliquant sur Enregistrer automatiquement une fois les paramètres et les portes terminés. (G) Cliquer sur Nettoyage quotidien une fois que tous les échantillons ont été collectés et que les statistiques ont été exportées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Validation de toutes les cellules à l’intérieur de la porte capturée, visualisées par des événements verts en P4 (magenta). (A) Courbe de niveau de la population saine à l’intérieur de la porte de population eGFP-positive (P3). Les cellules sont principalement concentrées dans les zones rouges, diminuant vers l’extérieur. (B) Tracé SSC-A vs PE-A pour le contrôle P4, fournissant une vérification supplémentaire pour s’assurer que tous les événements fluorescents sont pris en compte dans le graphique FITC-A. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 1 : Exemple de code Arduino implémentant toutes les propriétés décrites dans le protocole ci-dessus. Ce fichier active toutes les positions des LED à l’aide des valeurs d’intensité de LED recommandées dans le Tableau 2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.