Quantification tridimensionnelle du mucus intestinal à l’aide de l’imagerie tissulaire intégrale

Summary

Cette étude présente une méthode d’imagerie 3D utilisant des tissus intestinaux entiers et la microscopie multiphotonique pour quantifier le mucus sécrété, permettant une analyse volumétrique précise et la visualisation de la dynamique du mucus en réponse à des stimuli comme le chlorure de carbamoylcholine.

Abstract

Le mucus joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie intestinale en facilitant la digestion, en formant une barrière contre les microbes et en régulant les réponses immunitaires dans l’intestin. Sa sécrétion est modulée par divers facteurs intrinsèques et extrinsèques, notamment les infections microbiennes et l’inflammation. Alors que les méthodes traditionnelles d’analyse du mucus reposent sur une quantification relative, comme la mesure de l’épaisseur du mucus dans les coupes histologiques, ces approches fournissent un aperçu limité du volume réel et de la distribution spatiale du mucus sécrété dans la lumière intestinale. Ici, nous présentons une méthodologie détaillée pour la quantification absolue et tridimensionnelle du mucus à l’aide de tissus intestinaux entiers et de la microscopie multiphotonique. Ce protocole comprend la préparation d’anses intestinales ligaturées, le traitement au chlorure de carbamoylcholine comme stimulus pour l’activation des cellules caliciformes, la fixation des tissus et la coloration pour l’imagerie. À l’aide de la microscopie multiphotonique, nous acquérons des images empilées en Z de la surface luminale. Ceux-ci sont traités dans le logiciel Imaris pour quantifier le volume et la distribution spatiale du mucus sécrété. Nous démontrons que le chlorure de carbamoylcholine induit de manière robuste la sécrétion de mucus dans les tissus iléaux et côliques en 30 minutes. Le mucus sécrété apparaît de manière sporadique et discontinue dans toute la lumière, soulignant l’importance de l’analyse volumétrique par rapport aux approches bidimensionnelles traditionnelles. Ce protocole permet aux chercheurs d’obtenir des données quantitatives absolues et de visualiser la distribution du mucus in situ, offrant ainsi un outil puissant pour étudier la dynamique du mucus intestinal dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Introduction

L’environnement muqueux du tractus gastro-intestinal des mammifères est très dynamique, favorisant la colonisation d’une communauté microbienne diversifiée. L’épithélium intestinal est constitué de diverses cellules spécialisées qui collaborent pour absorber les nutriments, maintenir l’intégrité de la barrière et communiquer avec le système immunitaire¹. Parmi celles-ci, les cellules caliciformes stockent des granules de mucine et sécrètent du mucus dans la lumière dans des conditions d’état stationnaire. Ce mucus forme une barrière physique critique, empêchant le contact microbien direct avec la couche épithéliale, modulant l’inflammation des tissus et maintenant l’homéostasie intestinale ^2,3. La dérégulation de la sécrétion de mucus compromet la fonction barrière et a été associée à l’inflammation et à la tumorigenèse 4,5,6,7.

La sécrétion de mucus intestinal peut être déclenchée par des facteurs intrinsèques, tels que le neurotransmetteur acétylcholine, et par des composants microbiens provenant de commensaux ^8,9. Compte tenu de la complexité de l’environnement intestinal, de nombreux facteurs influençant la sécrétion de mucus des cellules caliciformes restent inexplorés. Par conséquent, une méthode précise de quantification du mucus luminal est essentielle pour étudier comment différents stimuli affectent la dynamique de la sécrétion. Les approches traditionnelles reposent principalement sur la quantification relative : par exemple, mesurer l’épaisseur du mucus à l’aide de particules fluorescentes ou de charbon de bois dans des systèmes d’explants intestinaux ex vivo ^10,11, ou évaluer la distance entre les microbes luminaux et l’épithélium dans des coupes de tissus colorés^12,13. Bien que ces méthodes soient pratiques pour les comparaisons relatives, elles peuvent ne pas capturer la distribution complète ou la structure tridimensionnelle du mucus sécrété, d’autant plus que le mucus sécrété ne couvre pas toujours uniformément l’épithélium.

Dans cette étude, nous présentons une méthode de visualisation tridimensionnelle et de quantification absolue du mucus luminal à l’aide de tissus intestinaux entiers. Cette approche nécessite une fixation des tissus frais à l’aide d’un fixateur approprié pour préserver l’intégrité structurelle et la morphologie, suivie d’une coloration fluorescente et d’une imagerie à l’aide d’un microscope confocal ou multiphotonique. En administrant des agents d’essai directement dans des anses intestinales ligaturées de souris profondément anesthésiées, suivi d’une fixation immédiate, la méthode préserve l’architecture native du mucus et permet d’analyser la cinétique de sécrétion. Par rapport aux tissus sectionnés, où la profondeur d’imagerie est principalement limitée par l’épaisseur du tissu, la profondeur d’imagerie des tissus entiers (sans délipidation) atteint environ 200-300 μm, limitée par la diffusion de la lumière et l’opacité des tissus. En utilisant cette technique, nous montrons que le chlorure de carbamoylcholine (CCh), un analogue de l’acétylcholine dont les récepteurs sont exprimés sur les cellules caliciformes¹⁴, induit de manière robuste une sécrétion rapide de mucus. Notamment, le mucus sécrété forme à la fois une couche continue le long de l’épithélium et des structures discontinues dans la lumière, des caractéristiques difficiles à détecter dans les coupes de tissus conventionnelles. Ce protocole fournit une plate-forme robuste pour quantifier la distribution tridimensionnelle du mucus intestinal et pour comparer le potentiel d’induction de mucus de divers stimuli.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux sont approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Chang Gung. L’animalerie de l’Université Chang Gung est accréditée par l’Association pour l’évaluation et l’accréditation des soins aux animaux de laboratoire (AAALAC). Aucune préoccupation pour la santé animale n’a été observée dans ces études.

1. Préparation de la base de fixation

1. Mélanger la poudre d’agarose avec du ddH₂O à une concentration de 4 % (p/v) dans une fiole allant au micro-ondes. Cuire au micro-ondes pendant 2-3 minutes jusqu’à ce qu’il atteigne une ébullition sans petites bulles.
   REMARQUE : Le volume dépend du nombre d’échantillons ; environ 10 mL pour un plat de 6 cm.
2. Laissez la solution d’agarose refroidir à ~60 °C en ~3 min. Versez délicatement l’agarose dans un plat de 6 cm jusqu’à ce que la hauteur du liquide atteigne la moitié du plat (environ 10 ml pour un plat de 6 cm).
3. Placez le plat avec le couvercle dans un endroit fermé pendant 20-30 min, jusqu’à ce que l’agarose soit complètement solidifiée.

2. Préparation du matériel de fixation

1. Préparez de nouveaux fils de cuivre et coupez-les en longueurs de 5 mm. Chaque morceau de tissu nécessite 6 à 8 morceaux de fil.

3. Préparation de la solution CCh

1. Dissoudre le CCh cristallin dans un tampon PBS stérile jusqu’à une concentration finale de 10 μM (200 μL pour une anse intestinale).

4. Préparation des anesthésiques injectables

1. Pour préparer la solution mère pour l’anesthésie, dissoudre le 2,2,2-tribromoéthanol dans le 2-méthyl-2-butanol.
2. Utiliser du PBS stérile pour diluer la solution mère, de sorte que la solution de travail finale contienne 30 mg/mL de 2,2,2-tribromoéthanol et 3 % (v/v) de 2-méthyl-2-butanol.
3. Agitez abondamment pendant ~1 min jusqu’à ce qu’il ne reste plus de pastille en solution (taux maximal : 8).
4. Conserver la solution mère dans l’obscurité à 4 °C pour éviter toute dégradation ; Jetez le bouillon 1 mois après préparation.
5. Avant l’anesthésie, aspirez la solution mère dans du PBS stérile et mélangez bien pour assurer une dispersion uniforme, atteignant une dose finale de 250 mg/kg par souris.
   ATTENTION : Le 2,2,2-tribromoéthanol a une neurotoxicité, et le 2-méthyl-2-butanol est volatil et a une odeur irritante. Un équipement de protection approprié doit être utilisé. Pour l’élimination, recueillez les déchets dans un contenant scellé et suivez les procédures d’élimination des déchets chimiques dangereux de l’établissement.

5. Inoculation intestinale par injection en boucle

1. Anesthésier une souris âgée de 6 à 8 semaines avec une injection intrapéritonéale de 200 μL de 2,2,2-tribromoéthanol (250 mg/kg par souris) et placer la souris sur un coussin chauffant pour maintenir sa température corporelle.
2. Après avoir stérilisé la surface de la peau avec de l’alcool, faites une incision dans le bas-ventre gauche de la souris à l’aide de ciseaux opératoires et exposez le caecum sous anesthésie.
3. Identifiez l’iléon ou le côlon proximal, placez l’anse intestinale sur une gaze stérile et utilisez des pinces artérielles pour fixer les deux extrémités, créant ainsi une boucle fermée de 3 cm de long.
4. Rincez l’organe sur la gaze avec du PBS stérile.
5. Injecter un réactif PBS ou CCh stérile d’un volume ne dépassant pas 200 μL dans l’anse intestinale ligaturée sous anesthésie.

6. Prélèvement, fixation et coloration des tissus

1. Après 30 min de traitement, euthanasiez la souris par luxation cervicale et prélevez l’anse intestinale.
2. Utilisez une pince pour tenir l’anse intestinale et rincez-la doucement dans du PBS stérile.
3. Ouvrez doucement l’anse intestinale longitudinalement et rincez le tissu dans du PBS stérile.
4. Aplatissez le tissu et utilisez des segments de fil de cuivre pour l’ancrer sur l’agarose dans un plat de 6 cm.
5. Fixez le mouchoir avec 10 ml de solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 12 à 24 h dans le plat.
6. Lavez le tissu avec du PBS au moins 3 fois pour éliminer le paraformaldéhyde résiduel.
7. Immerger le tissu dans 10 mL de tampon de blocage (PBS complété par 0,4 % de Triton X-100 et 3 % d’albumine sérique bovine [BSA]) à 4 °C pendant 12 à 24 h dans la boîte.
8. Teindre le tissu avec de l’agglutinine de germe de blé (WGA, 1:200) et de la phalloïdine (1:500) dans un tampon de blocage, en agitant à 120 tr/min à 4 °C pendant 12 à 24 h dans le plat.
   REMARQUE : Pour minimiser la consommation de colorant, le tissu peut être ancré sur de l’agarose solidifié dans un plat de 3 cm immergé dans 2 mL de tampon de colorant pour la coloration.
   ATTENTION : Le paraformaldéhyde présente un risque d’inhalation. Un équipement de protection approprié doit être utilisé pendant la manipulation, comme le fonctionnement dans une hotte. Pour l’élimination, recueillez les déchets dans un contenant scellé et suivez les procédures d’élimination des déchets chimiques dangereux de l’établissement.

7. Capture d’image par microscopie multiphotonique

1. Lavez le tampon de coloration restant au moins 3 fois avec du PBS.
2. Ancrez le tissu sur de l’agarose avec des fils de cuivre dans une parabole de 6 cm dans 10 mL de PBS.
3. Acquérir 100 coupes optiques (couvrant 99 m de profondeur) de tissu intestinal et de mucus sécrété associé à l’aide d’un microscope multiphotonique équipé d’une lentille d’objectif à haute ouverture numérique pour l’imagerie des tissus profonds. Utilisez une source d’excitation pour la microscopie multiphotonique réglée sur une longueur d’onde de 750 nm. Collectez les signaux d’émission à l’aide des filtres passe-bande BP500-550 nm et BP565-610 nm. Réglez la vitesse de numérisation sur 8.
   REMARQUE : Pour la microscopie multiphotonique, la vitesse de balayage maximale est de 9, les valeurs les plus élevées indiquant une acquisition plus rapide. Le réglage de la vitesse dépend de la capacité du microscope. Lors de l’utilisation de la plate-forme d’imagerie utilisée pour acquérir des piles 3D, nous recommandons une vitesse de numérisation de 8 pour équilibrer le temps d’acquisition et la qualité de l’image.

8. Analyse d’images et quantification du mucus (Figure 1)

1. Pour mesurer le volume de chaque particule de mucus (dans le canal WGA), ouvrez la pile d’images dans Imaris en glissant et déposant le fichier sur la page Arena. Cliquez sur l’icône Surface pour lancer le processus de création de surface. Suivez les étapes standard pour segmenter et quantifier les volumes de particules au sein de la pile z. Les paramètres spécifiques et les étapes de traitement sont détaillés dans la figure 1.
2. Exclure les particules de mucus inférieures à 1 000 μm³, qui sont principalement des cellules caliciformes (Figure 2A,B).
3. Additionnez le volume de mucus sécrété pour chaque groupe.

9. Analyse statistique

1. Analysez et comparez le volume total de chaque groupe. Entrez la valeur du volume de mucus dans la colonne et analysez à l’aide d’un test de Mann-Whitney non paramétrique.

Results

Dans cette méthode, nous avons quantifié le volume de mucus intestinal à partir d’images empilées de tissus entiers acquises par microscopie multiphotonique. Les tissus intestinaux ont été colorés avec de la phalloïdine fluorescente et de l’agglutinine de germe de blé (WGA) pour visualiser l’actine F cellulaire et le mucus, respectivement^15,16. Dans les tissus iléaux et coliques traités avec le PBS, le mucus WGA⁺ a été principalement détecté dans les c...

Discussion

Ici, nous présentons une méthode de quantification tridimensionnelle du mucus intestinal à l’aide de la coloration des tissus entiers, de la microscopie multiphotonique et de l’analyse avec le logiciel Imaris. Cette procédure permet d’observer la distribution discontinue du mucus au sein de la lumière intestinale et fournit une mesure absolue du volume de mucus.

Une distribution discontinue du mucus lors de la stimulation a également été observée dans les syst...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-tribromoéthanol	Sigma-Aldrich	T48402
2-méthyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	240486
6 cm de plat   ;	Alpha Plus	16021-1
Agarose  ;	Hispanagar	A02599
BSA	BioShop	ALB001
Chlorure de carbamoylcholine & ge ; 98 % (titration), cristalline	SIGMA	SI-C4382-1G
Fil de cuivre (neuf)	TOP TECH WIRE & INDUSTRIE DU CÂBLE	IW00125	Fil de cuivre sans couche isolante
Forceps	Shineteh	ST-M110
Gaze, stérile	GMTH	Mai-40
GraphPad Prism 8  ;	Logiciel GraphPad
Bouillotte	CONFORT	SY-666
IMARIS 10.0.0	OXFORD INSTRUMENTS
Paraformaldéhyde	BIOVOVAS	BL0415-1000
PBS	GENESTAR	BL0180-1000
Sondes de marquage des phaloïdines	Invitrogen	A12379
Ciseaux	Shineteh	02-1250.18
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
Conjugués de l’agglutinine germinale du blé (WGA)	Biotium	29027
Zeiss 7MP avec un objectif d’immersion en eau W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III (NA 1.0), laser femtoseconde Spectra-Physics Mai Tai HP ti saphir (sans module DeepSee) avec détecteurs BP500 nm-550 nm et BP565 nm-610 nm, et longueur d’onde laser de 750 nm			plateforme d’imagerie utilisée pour acquérir des piles 3D avec une lentille objective à haute concentration d’atomie narcisienne pour l’imagerie des tissus profonds ; Une source d’excitation pour la microscopie multi-photons réglée à une longueur d’onde de 750 nm