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Article de méthode

Modèle murin de rechute de la leucémie à la chimiothérapie d’induction pour la leucémie lymphoblastique aiguë

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DOI :

10.3791/68797

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17 octobre 2025

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1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, University of Campinas, 3Boldrini Children's Center, 4Department of Translational Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas

Dans cet article

Résumé

Le protocole vise à décrire un modèle murin permettant de générer des rechutes de leucémie lymphoblastique aiguë, en se basant sur la dynamique de la réponse à la chimiothérapie d’induction.

Résumé

La leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est un néoplasme de cellules précurseurs lymphoïdes immatures et l’une des tumeurs malignes les plus courantes chez l’enfant. Bien que les taux de guérison dans la LAL pédiatrique approchent les 90 %, la rechute et la résistance aux médicaments restent des défis. Dans ce contexte, l’étude de la biologie du cancer in vivo est essentielle, et les xénogreffes dérivées de patients (PDX) utilisant des modèles murins sont largement utilisées à cette fin. Cependant, les PDX provenant d’échantillons en rechute - ou comparés à des échantillons diagnostiques - n’évaluent pas pleinement les mécanismes à l’origine de l’initiation et de la progression de la rechute. Ce protocole repose sur la génération de rechutes de PDX B-ALL chez la souris, permettant la collecte de cellules leucémiques tout au long du processus d’acquisition de la résistance aux médicaments. Les animaux greffés avec des cellules PDX B-LLA, sont traités avec une combinaison de quatre médicaments couramment utilisés dans le traitement de la LAL, représentant des mécanismes d’action distincts : la dexaméthasone, la vincristine, la L-asparaginase et la daunorubicine. Après une phase d’induction de la rémission de 4 semaines, les animaux sont surveillés pour détecter les rechutes pendant une période de repos. Le cycle de traitement et de rechute est répété jusqu’à ce que le temps de rechute se raccourcisse, servant de substitut à l’augmentation de la résistance aux médicaments in vivo. Pour explorer les mécanismes sous-jacents à la rechute et à la résistance, des cellules leucémiques sont prélevées avant et après chaque cycle de traitement pour une analyse phénotypique et génétique. Pour valider le modèle, différents échantillons de LAL pédiatriques ont été testés, y compris les bons et les mauvais répondeurs, comme l’a évalué la présence de blastes dans le sang périphérique après 7 jours de corticothérapie et la maladie résiduelle minimale (MRM) aux jours 15, 33 et 78/96. Les résultats observés chez la souris étaient cohérents avec les données des patients, confirmant la précision du modèle dans l’imitation de la réponse clinique à la chimiothérapie. Cette approche permet l’étude dynamique de la rechute et de la résistance aux médicaments dans la LAL-B, soutenant les investigations mécanistes et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Introduction

La leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est le cancer le plus répandu chez les enfants. Malgré les taux de guérison élevés atteints au cours des dernières décennies avec une survie globale à 5 ans atteignant 90 % dans les pays à revenu élevé1 et des efforts importants dans la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques, dans les pays développés, 15 à 20 % des patients rechutent de la maladie, jusqu’à qui le taux de survie varie entre 30 % et 60 % selon que la première rechute survient tôt (moins de 18 mois) ou plus tard (36 mois) après le diagnostic2, 3. Accès Dans ce contexte, les LAL réfractaires et relapses restent des défis à surmonter. En termes de diagnostic, la LAL réfractaire se distingue de la rechute par une faible sensibilité à la chimiothérapie, tandis que la LAL récidive se caractérise par la récidive de la maladie après une période de rémission. Comme pour d’autres cancers, la LAL est caractérisée par des anomalies génétiques, notamment des aneuploïdies, des réarrangements chromosomiques et diverses mutations génétiques associées à différentes réponses thérapeutiques et à un risque de rechute4. Étant donné que les rechutes de LAL sont plus fréquentes chez les patients à haut risque - qui ont déjà reçu une chimiothérapie d’intensité maximale - il est peu probable que d’autres ajustements aux doses ou aux combinaisons de médicaments soient suffisants. Au lieu de cela, les efforts doivent être orientés vers l’identification des mécanismes sous-jacents à la résistance aux médicaments et à la rechute.

À la lumière de cela, les chercheurs ont tenté de comprendre comment la pression de sélection exercée par la chimiothérapie contribue à l’émergence de cellules résistantes. La plupart de la littérature existante attribue la rechute à la propagation d’un sous-clone malin résistant qui était déjà présent au moment du diagnostic5. Cependant, une étude récente suggère l’existence de mécanismes alternatifs, tels que des modifications épigénétiques qui régulent les programmes transcriptionnels, qui pourraient également contribuer à la rechute6.

Des efforts considérables ont été consacrés à la création de modèles in vivo précis pour étudier les rechutes de LAL. Des souris immunodéficientes ont été utilisées avec succès pour la greffe de LAL, préservant les caractéristiques originales de la maladie 7,8, conduisant au développement de xénogreffes dérivées de patients (PDX). Ce modèle permet la greffe et la prolifération de cellules tumorales/leucémiques originales dans un microenvironnement compatible. L’un de ses avantages majeurs est la capacité d’évaluer la réponse des cellules LAL transplantées à la chimiothérapie9.

Des modèles PDX ont également été utilisés pour imiter et étudier les rechutes de LAL. Par exemple, un protocole mis au point par Samuels et coll.10 a utilisé des souris non obèses diabétiques/immunodéficients sévères combinés (NOD/SCID) transplantées avec des cellules leucémiques de patients pour étudier les mécanismes de résistance à un régime de chimiothérapie de type induction. Les auteurs ont décrit le traitement à la vincristine, à la dexaméthasone, à la L-asparaginase et à la daunorubicine (VXLD) et ont fourni des exemples du nombre de cycles de traitement et du moment de la rechute. Cependant, le modèle s’est concentré sur l’analyse des cellules immédiatement après le traitement - celles qui ont survécu au traitement initial - représentant probablement une maladie résiduelle minime (MRM) plutôt qu’une rechute.

Une étude plus récente a évalué si le traitement à court terme du NOD transplanté de LAL. Les souris immunodéficientes Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NOD scid gamma, ou NSG) pourraient prédire la rechute chez les patients correspondants11. Des échantillons de LAL à risque intermédiaire - provenant de patients en rechute et non en rechute - ont été transplantés chez des souris et traités avec un régime de type induction composé de vincristine, de dexaméthasone et de L-asparaginase (VXL). Le temps avant la greffe et les rechutes post-traitement ont été mesurés et comparés. Les résultats suggèrent que ce modèle PDX pourrait servir d’outil pronostique pour prédire les résultats des patients. Cette découverte soutient l’utilité des modèles de souris PDX dans l’étude de la biologie des rechutes de LAL. Par exemple, les cellules récurrentes auraient pu être examinées à différents moments pour découvrir les mécanismes sous-jacents à la rechute.

Dans ce manuscrit, nous présentons des améliorations apportées au modèle de souris PDX pour étudier la rechute de la LAL-B. Notre objectif est d’étudier la récidive de la maladie et les caractéristiques des cellules en rechute après leur mise en forme par chimiothérapie d’induction. Un régime à quatre médicaments, semblable à l’induction - vincristine, dexaméthasone, L-asparaginase et daunorubicine - a été standardisé, en utilisant la souche de souris NSG. Cette souche est connue pour avoir des limites dans la résistance aux cycles de chimiothérapie répétés en raison de la mutationscid Prkdc et d’une sensibilité accrue au stress génotoxique12. Par conséquent, le poids corporel des animaux a été surveillé en tant que marqueur de la toxicité du traitement. Le modèle de rechute de la LAL B peut être divisé en trois étapes principales : (1) transplantation de cellules LAL chez la souris, visant un seuil de greffe de 0,2 à 1 % de cellules CD45⁺ humaines dans le sang périphérique ; (2) 4 semaines de traitement de chimiothérapie, suivies d’une période de repos jusqu’à la première rechute (R1) ; et (3) lors de la détection de R1, cycles de traitement répétés de type induction d’une semaine. Les rechutes subséquentes (R2, R3... RN) peut survenir, et l’intervalle entre le traitement et la rechute (Δt) est enregistré. Un raccourcissement progressif de Δt est interprété comme une indication de résistance acquise aux médicaments. Dans le cadre d’investigations plus approfondies sur les mécanismes de la rechute, des cellules B-ALL peuvent être collectées avant et après différentes étapes du protocole. Il est important de souligner que, selon le temps écoulé entre l’apparition de la rechute et la récupération cellulaire, les mécanismes inhérents à ce phénomène peuvent ne pas être conservés. Dans ce contexte, il est extrêmement important que les cellules de rechute soient collectées rapidement après la confirmation de la rechute. Les cellules collectées peuvent être utilisées pour de futures analyses phénotypiques et génétiques, y compris des évaluations de la dynamique du cycle cellulaire, de la migration cellulaire, de la fréquence des cellules initiatrices de leucémie, des altérations chromosomiques et des modifications épigénétiques, entre autres.

Pour les besoins de cet article, nous nous concentrerons sur la description du modèle de souris de rechute. Des informations détaillées seront fournies pour les trois phases expérimentales - transplantation, traitement jusqu’à la première rechute (R1), et traitement cyclique jusqu’aux rechutes multiples (R2, R3...). Nous espérons que ce modèle permettra aux chercheurs de générer des cellules B-LAL résistantes à la chimiothérapie à partir de divers sous-types, ce qui permettra une étude plus approfondie des changements cellulaires et moléculaires associés à la rechute. En fin de compte, cela pourrait contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes de résistance et faciliter le développement de thérapies plus efficaces et personnalisées.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux réglementations et aux directives éthiques de la Comissão de Ética no Uso de Animais du Centro Infantil Boldrini (CEUA/Boldrini 0047-2024). Les échantillons de leucémie utilisés dans cette étude ont été obtenus à partir de flacons de patients traités au Centro Infantil Boldrini, qui ont autorisé l’utilisation de leurs cellules par le biais d’un formulaire de consentement éclairé. Le projet a été approuvé par le Comité d’éthique institutionnelle (CAAE 34601120.7.0000.5376).

1. Surveillance de la greffe de cellules leucémiques et de la greffe

  1. Préparation d’échantillons de leucémie pour la transplantation de souris
    1. Décongelez des échantillons précédemment cryoconservés de cellules TOUTES prélevées dans l’aspiration de la moelle osseuse du patient. Utilisez un bain-marie réglé à 37°C. Décongelez les échantillons en déplaçant le cryotube dans un mouvement circulaire.
    2. Transférez l’échantillon décongelé dans un tube à centrifuger de 15 ml. Ajoutez 14 ml de 1x PBS stérile à l’échantillon pour laver les cellules et retirer la solution de cryoconservation. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant.
  2. Préparation de la solution de transplantation
    1. Remettre en suspension les cellules décongelées dans du PBS stérile 1x. Utiliser 5-10 x 106 cellules viables dans un volume de 100 μL de PBS pour chaque animal à transplanter. Conservez la solution de transplantation sur de la glace jusqu’à la transplantation.
      REMARQUE : Les cellules ont été comptées selon la méthode semi-automatique13.
  3. Transplantation de souris
    1. Sélectionnez un NOD mâle ou femelle de 2 mois. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) souris pour la transplantation de leucémie.
      REMARQUE : Afin de maintenir un plan expérimental homogène exempt d’interférences sexuelles chez les animaux, les échantillons de LAL ont été transplantés chez les deux sexes de souris, en veillant à ce que toutes les leucémies à bonne et mauvaise réponse soient également représentées chez les deux sexes. En conséquence, nous avons constaté que les souris femelles se greffent plus tôt que les souris mâles. Étant donné que, pour éviter une éventuelle interférence du sexe de la souris dans les analyses futures (telles que la cinétique de greffe), nous suggérons d’utiliser un seul sexe de souris lorsque l’on travaille avec le même échantillon de leucémie. Aucun autre paramètre n’a été utilisé pour choisir préférentiellement un sexe plutôt qu’un autre.
    2. Placez une souris à la fois dans un piège à souris sûr et approuvé pour assurer un bon confinement de l’animal. Assurez-vous que la queue de l’animal est à l’extérieur du piège et qu’elle est facilement accessible pour la transplantation.
      REMARQUE : Les cellules leucémiques sont transplantées chez la souris par injection intraveineuse (IV). Les protocoles établis utilisent les veines latérales de la queue à cette fin11.
    3. Utilisez la lumière infrarouge pour assurer une bonne expansion des veines. Injectez 100 μL de la solution de transplantation à l’aide d’une aiguille d’injection stérile, tranchante et à usage unique. Conservez les souris transplantées dans une installation spécifique exempte d’agents pathogènes. Laissez-les reposer pendant 15 jours.
      1. Pour utiliser la lumière infrarouge, gardez l’animal déjà retenu à l’extérieur de la cage et à 30 cm de la lumière. En fonction de la puissance lumineuse potentielle, ajustez le temps d’exposition. Lors de l’utilisation d’une lampe de puissance moyenne, une période de 5 min est suffisante pour assurer l’expansion des veines. Laisser la queue exposée pendant une période plus longue peut causer des brûlures et du stress à l’animal.
      2. Pour l’injection, utilisez une seringue à insuline munie d’une aiguille d’un volume de 1 mL et d’une aiguille de 12,7 mm x 0,33 mm. Les spécifications de l’aiguille utilisée se trouvent dans la table des matériaux. Maintenez les souris dans un régime de cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h. De plus, logez les animaux utilisés dans cette étude dans une cage en polycarbonate ambré translucide autoclavable avec enrichissement de l’environnement pour créer des nids.
  4. Prélèvement de sang périphérique
    1. Prélever un échantillon de sang périphérique de 50 μL de chaque souris 2 semaines après l’inoculation et toutes les semaines par la suite.
    2. Retenez manuellement l’animal avec la main gauche, en vous assurant que sa tête est bien maintenue. Avec la main droite, utilisez une lancette stérile, tranchante et jetable pour percer la veine faciale du plexus sous-mandibulaire de l’animal.
      REMARQUE : Il s’agit d’une procédure potentiellement dangereuse pour les souris et doit être effectuée avec soin.
      1. Assurez-vous que l’animal peut respirer facilement pendant la contention. Surveillez les changements de fréquence respiratoire (essoufflement) et les changements de couleur de la bouche (elle ne doit pas virer au violet ou au bleu foncé). Si le plexus sous-mandibulaire n’est pas perforé correctement, des saignements dans l’oreille peuvent survenir en raison de la ponction du conduit auditif. Pour guider les futurs expérimentateurs, la figure supplémentaire 1 est disponible pour assurer le bon emplacement du plexus.
        REMARQUE : Comme alternative, les saignements de la veine de la queue peuvent également être utilisés pour prélever des échantillons de sang.
    3. Après le ramassage, ne laissez pas l’animal sans surveillance. Il doit être actif et indemne. Si la souris présente des signes de chute (tête ou corps) et d’inactivité, elle doit être euthanasiée. Ne dépassez pas un volume de 50 μL, car de plus grandes quantités de sang peuvent entraîner la mort de l’animal.
    4. Conservez l’échantillon de sang prélevé dans un tube à centrifuger de 1,5 mL contenant 8 μL d’EDTA de 50 mM pour éviter la coagulation de l’échantillon.
      REMARQUE : Ici, nous avons utilisé une solution EDTA préalablement préparée comme anticoagulant. Si vous le souhaitez, des tubes EDTA de faible volume disponibles dans le commerce pour le prélèvement sanguin peuvent également être utilisés à cette étape. Les échantillons de sang doivent être traités le même jour.
  5. Préparation d’échantillons de sang périphérique pour le traitement
    1. Homogénéiser le sang avec de l’EDTA. Transvaser 50 μL du mélange dans un tube de cytométrie en flux.
    2. Préparez un mélange d’anticorps à ajouter à chaque échantillon, composé d’anticorps anti-CD45 de souris (mCD45), d’anticorps CD45 anti-humains (hCD45), d’anticorps anti-CD19 humains (hCD19) et de 1x PBS stérile comme diluant.
  6. Traitement des échantillons de sang
    1. Ajouter 10 μL du mélange d’anticorps à chaque échantillon de sang. Homogénéiser en tapotant doucement avec l’index. Incuber pendant 30 min à température ambiante, à l’abri de la lumière.
      REMARQUE : Sélectionnez les anticorps appropriés décrits ci-dessus, en tenant compte des canaux disponibles du cytomètre. Pour déterminer la quantité d’anticorps utilisée par échantillon, envisagez d’effectuer une courbe de titrage pour chaque anticorps. Les anticorps utilisés dans notre étude, les fluorochromes, et le volume choisi pour les échantillons sont énumérés dans le tableau supplémentaire 1. Une description complète des numéros de catalogue des anticorps et des noms des clones est répertoriée dans la Table des matières.
    2. Ajouter 1 mL de solution commerciale de lyse des globules rouges (GR) à chaque échantillon. Homogénéiser vigoureusement avec l’index. Incuber 15 min à température ambiante, à l’abri de la lumière.
      REMARQUE : La solution de lyse utilisée à cette étape est une solution de lyse 10x RBC disponible dans le commerce. Si un réactif différent est utilisé, le volume de travail 1x pour la lyse doit être ajusté.
    3. Ajouter 2 ml de PBS stérile 1x à chaque échantillon pour la première étape de lavage. Centrifuger des échantillons à 200 x g (dans un rotor pivotant) pendant 5 min à température ambiante. Jetez délicatement le surnageant en l’inversant et séchez tout liquide restant en haut du tube en épongeant doucement avec du papier absorbant.
      REMARQUE : Dans les étapes de lavage, les cellules leucémiques seront granulées au fond du tube cytométrique et le liquide restant sera jeté. Il est impératif de faire preuve de prudence lors de la manipulation des échantillons, car dans certains cas, la pastille peut ne pas être discernable. Pour garantir l’intégrité de la pastille, évitez de secouer l’échantillon, car cela pourrait entraîner sa perte.
    4. Répétez l’étape 1.6.3. Remettez les cellules leucémiques en suspension avec 200 μL de PBS 1x stérile en tapotant doucement le tube de cytométrie avec l’index. Les échantillons sont prêts à être analysés par cytométrie en flux. Le suivi de la greffe doit être effectué le même jour que le prélèvement sanguin.
  7. Suivi de la greffe par cytométrie en flux
    1. Utiliser des méthodologies standard de cytométrie en flux 9,14 pour déterminer le pourcentage de cellules CD45+ humaines dans le sang périphérique par rapport aux cellules CD45+ de souris ( % hCD45+).
    2. Recueillir les données générées par cytométrie en flux pour l’analyse ultérieure du pourcentage de hCD45+ par rapport aux cellules CD45 totales (hCD45+ plus mCD45+) à l’aide d’un logiciel d’analyse par cytométrie en flux.
      REMARQUE : Pour assurer une bonne surveillance de la greffe, les étapes d’analyse suivantes doivent être effectuées le même jour. Cette séquence quotidienne est particulièrement importante lorsque l’on considère le début du futur calendrier de traitement, que nous suggérons de commencer le lundi. Dans l’impossibilité de commencer le lundi, le traitement peut commencer n’importe quel jour de la semaine, en fonction de l’atteinte du hCD45+ % (0,2 %-1 %) sur le sang périphérique.
  8. Préparation de l’environnement pour l’analyse des données de cytométrie en flux
    1. Lancez un logiciel d’analyse par cytométrie en flux. Importez les données collectées et attendez leur reconnaissance par l’outil.
    2. Ouvrez les données de l’échantillon initial pour créer la porte étiquetée Lymphocytes. Vérifier les paramètres de l’axe : sélectionnez FSC-A pour l’axe X et SSC-A pour l’axe Y. Dans le panneau de création de porte supérieur, sélectionnez l’outil poly-liner et décrivez la population de cellules principale.
      REMARQUE : Les lymphocytes apparaissent généralement entre 50 000 et 100 000 sur l’axe des X et entre 0 et 50 000 sur l’axe des Y. Les valeurs peuvent varier en fonction des caractéristiques de chaque leucémie.
    3. Double-cliquez sur la population fermée pour créer une nouvelle porte. Pour exclure les doublets de cellules, définissez FSC-A sur l’axe X et FSC-H sur l’axe Y. Utilisez l’outil poly-liner pour isoler la population cellulaire primaire. Tracez la porte de près de la population, en excluant les événements éloignés le long de l’axe des abscisses.
      REMARQUE : Cette étape distingue les événements de cellule individuels.
  9. Création du panel de cytométrie pour distinguer les populations cellulaires
    1. Double-cliquez sur la population sélectionnée pour différencier les cellules CD45 humaines des cellules CD45 de souris. Réglez l’axe X sur le fluorophore mCD45 et l’axe Y sur SSC-A. À l’aide de l’outil Forme, tracez un carré autour de la population mCD45-négative.
    2. Double-cliquez sur la population résultante pour distinguer les cellules hCD19+ et/ou hCD45+. Réglez l’axe X sur le fluorophore hCD19 et l’axe Y sur hCD45. Dans le panneau de création de porte, sélectionnez Lignes perpendiculaires pour séparer les populations distinctes.
      REMARQUE : Comme alternative, l’investigateur peut utiliser la porte ou la possibilité de discriminer les cellules hCD45 et mCD45. Cette possibilité considère la somme des événements comme 100 %, créant ainsi une stratégie plus précise d’identification des populations.
  10. Application de statistiques au panneau créé
    1. Calculez le pourcentage de chaque population cellulaire isolée par rapport à tous les événements acquis. Dans la fenêtre principale du logiciel, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’icône Sous-graphe dérivé du graphique principal de chaque échantillon et sélectionnez Créer des statistiques. Dans la fenêtre qui s’ouvre, cliquez sur Fréquence de et sélectionnez Cellules uniques. Effectuez cette étape individuellement pour chaque sous-graphe.
    2. Sélectionnez toutes les modifications apportées pour appliquer la stratégie de contrôle et les statistiques associées à tous les échantillons. Ensuite, à l’aide du bouton gauche de la souris, faites glisser les modifications sélectionnées vers l’option Tous les échantillons dans la fenêtre principale du logiciel.
    3. Cliquez sur Éditeur de table dans la fenêtre principale pour générer une table avec toutes les fréquences calculées. Dans la fenêtre contextuelle, choisissez le format de fichier .xls, désignez le dossier de destination, puis cliquez sur Créer une table.
      REMARQUE : Toutes les étapes effectuées à l’aide du logiciel d’analyse de cytométrie en flux peuvent être visualisées dans la figure supplémentaire 2. Le tableau final généré par cette étape contient le pourcentage de hCD45+ nécessaire pour générer des graphiques permettant d’analyser la progression de la greffe dans le temps.
  11. Tracé de la progression de la greffe
    1. Lancez un logiciel de traçage et d’analyse de graphiques. Sélectionnez le format de table XY. Dans la fenêtre principale, choisissez Entrer ou Importer des données dans une nouvelle table, définissez X sur Nombres et Y sur Entrer des valeurs de réplication dans des sous-colonnes côte à côte.
    2. Dans le tableau ouvert, organisez les titres des colonnes : entrez Jours de greffe pour la colonne X et % hCD45+ sur PB pour le premier groupe de sous-colonnes Y. Remplissez la colonne X avec les jours post-injection correspondant aux jours de prélèvement sanguin pour le suivi de la greffe. Entrez manuellement le pourcentage hebdomadaire de données hCD45+ collectées pour chaque souris dans les sous-colonnes Y.
    3. Dans le menu du logiciel, sous le sous-ensemble Famille, sélectionnez Données 1. Dans la fenêtre contextuelle, choisissez la deuxième option de graphique nommée Points et ligne de connexion avec barres d’erreur, et activez le traçage des barres de moyenne et d’erreur.
    4. Ajustez les axes du graphique aux plages souhaitées. Cliquez sur Exporter dans le coin supérieur droit du menu pour télécharger le graphique final.
      REMARQUE : Toutes les données recueillies au cours des expériences avec une seule LAL doivent être tracées sur le même graphique afin de faciliter les analyses au fil du temps depuis le début de l’expérience. Un exemple descriptif de traçage graphique se trouve dans la figure supplémentaire 3.

2. Traitement des souris

  1. Préparation de solutions de travail médicamenteux
    1. Préparez une solution de travail de vincristine à une concentration de 1 mg/mL. Préparez une solution de travail de dexaméthasone à 4 mg/mL. Préparez une solution de travail de L-asparaginase à 2 000 UI/mL. Préparez la solution de travail de daunorubicine à 2 mg/mL.
      REMARQUE : Les médicaments utilisés dans ce protocole sont équivalents à ceux utilisés dans le traitement clinique des patients15. Le véhicule de solution de travail de la dexaméthasone est composé de créatinine, de citrate de sodium dihydraté, d’hydroxyde de sodium, de bisulfite de sodium, de méthylparabène, de propylparabène et d’eau pour injection. Le véhicule de solution de travail de vincristine est composé de mannitol, d’acide sulfurique, d’hydroxyde de sodium et d’eau pour injection. La L-asparaginase et la daunorubicine sont fréquemment disponibles sous forme lyophilisée. Dans de tels cas, le véhicule recommandé pour la reconstitution est de l’eau stérile pour préparations injectables, qui doit être utilisée pour atteindre la concentration correcte. Pour éviter la perte d’activité du médicament due à des cycles répétés de décongélation, les médicaments doivent être divisés en aliquotes de travail utilisées pas plus de 3 fois.
  2. Pesées des animaux au moment de la détection d’une leucémie
    1. Amorcer le traitement au moment où le pourcentage de cellules hCD45+ dans le sang périphérique de la souris atteint une médiane comprise entre 0,2 % et 1 %. Une fois atteint, divisez les souris transplantées en deux groupes distincts : l’un pour recevoir le traitement et l’autre pour servir de contrôle.
    2. Une fois le seuil établi atteint, persister dans le suivi hebdomadaire de la progression de la leucémie. Collecter en continu des données sur le taux de hCD45 pour surveiller la réponse au traitement, la survenue de rechutes et la détection de la résistance aux médicaments.
    3. Peser les animaux à traiter. Utilisez la moyenne arithmétique des poids pour déterminer la dose de chaque médicament à administrer au groupe. Pesez les animaux du groupe témoin pour comparer le gain ou la perte de poids entre les groupes.
      1. Utilisez les doses de médicament suivantes : vincristine, 0,15 mg/kg ; dexaméthasone, 5 mg/kg ; L-asparaginase, 1 000 UI/kg ; et la daunorubicine, 1,2 mg/kg. Pesez tous les animaux au moins 3 fois par semaine : le lundi, le mercredi et le vendredi. Utilisez les poids pour ajuster les doses de traitement des médicaments et pour surveiller le niveau de toxicité du traitement.
  3. Préparation des solutions d’administration de médicaments à partir des aliquotes de la solution de travail
    REMARQUE : Les solutions d’administration de médicament se composent de 1x PBS stérile comme diluant et du volume correct (en fonction du poids de l’animal) de solutions médicamenteuses de travail (l’eau stérile est utilisée exclusivement pour la reconstitution et non pour l’injection) administrées chaque jour de la semaine. Les médicaments administrés par voie intrapéritonéale peuvent être réunis dans la même solution ; Cependant, si un médicament est administré par voie intraveineuse, il doit être placé dans une solution individuelle. Le volume de la solution d’administration du médicament à administrer à chaque animal est de 100 μL.
    REMARQUE : Une seringue à insuline stérile avec aiguille attachée (1 ml, dont les dimensions de l’aiguille sont de 12,7 mm X 0,33 mm) a été utilisée à l’étape décrite ci-dessus. Une description complète de la seringue se trouve dans la table des matériaux.
    1. Le lundi, préparez une solution d’administration de médicament composée de dexaméthasone, de vincristine et de PBS. Administrer les médicaments par voie intrapéritonéale.
    2. Le mardi et le jeudi, préparez une solution d’administration de médicament composée de dexaméthasone, de L-asparaginase et de PBS. Administrer les médicaments par voie intrapéritonéale.
    3. Le mercredi, préparez une solution d’administration de médicament composée de dexaméthasone et de PBS et administrez-la par voie intrapéritonéale. Préparez une deuxième solution d’administration de médicament composée de daunorubicine et de PBS. Administrez-le par voie intraveineuse.
    4. Le vendredi, préparez une solution d’administration de médicament composée de dexaméthasone et de PBS. Administrer le médicament par voie intrapéritonéale.
    5. Laissez les animaux se reposer pendant les jours de week-end. Répétez le cycle de traitement pendant 4 semaines.
      REMARQUE : Un calendrier de traitement complet se trouve dans le tableau supplémentaire 2. Il est important de préciser que d’autres protocoles déjà établis pour le traitement des souris ont été testés, mais qu’ils ont entraîné des niveaux élevés de toxicité pour la souche NSG. Par conséquent, le calendrier de traitement proposé a d’abord été soumis à un processus de normalisation pour la réduction de la toxicité, ce qui a abouti aux doses et à la fréquence d’administration présentées dans ce protocole. On s’attend à ce que le pourcentage de hCD45+ dans le groupe traité diminue par rapport au pourcentage de hCD45+ dans le groupe témoin en raison de l’administration du traitement.
  4. Administration de médicaments et surveillance de la réponse à la leucémie
    1. Retenir manuellement l’animal avec la main gauche pour administrer des médicaments par voie intrapéritonéale. Gardez l’animal avec la partie ventrale vers le haut. Sur la partie ventrale, localisez le quadrant inférieur droit.
    2. Avec la main droite, utilisez une aiguille d’injection stérile, tranchante et à usage unique et injectez 100 μL de la solution d’administration du médicament dans le quadrant inférieur droit de la souris.
      REMARQUE : Soyez prudent lorsque vous retenez l’animal ; Cela ne devrait pas être une procédure nocive pour les souris. Comme pour le prélèvement sanguin, soyez conscient de toute complication respiratoire. Dans le cas d’injections intrapéritonéales, tenez toujours l’aiguille perpendiculairement afin d’éviter de percer un organe.
    3. Suivez les mêmes instructions que celles utilisées pour la transplantation de cellules leucémiques afin d’administrer des médicaments par voie intraveineuse. Laisser les souris se reposer après 4 semaines d’administration du traitement jusqu’à la réapparition des cellules LAL, ici appelée première rechute (R1).
      REMARQUE : Malgré la différence dans la voie d’administration, l’injection intraveineuse utilise le même volume que l’injection intrapéritonéale.
  5. Surveillance de la réactivité de la leucémie et détection de la première rechute (R1)
    1. Ne pas interrompre la surveillance hebdomadaire de la leucémie par cytométrie en flux pendant les phases de traitement ou de repos.
      REMARQUE : Compte tenu du traitement 5 jours par semaine, il est fortement recommandé que le suivi soit effectué en début de semaine. Dans notre étude, la collecte de sang, le traitement des échantillons et l’analyse étaient toujours effectués le lundi.
    2. Effectuer le prélèvement sanguin et toutes les procédures subséquentes requises pour la surveillance conformément aux étapes 1.4 à 1.11.
      REMARQUE : Après la période de repos donnée, les cellules R1 seront détectées par l’augmentation soudaine du pourcentage de hCD45+ dans le sang périphérique des souris. La période entre la fin du traitement et la survenue d’une rechute est variable et peut être distincte pour chaque leucémie dépistée. Lors de la détection de R1, la troisième et dernière phase du modèle murin de rechute proposé doit être effectuée. Pour améliorer la surveillance et l’analyse de la réponse, nous suggérons d’utiliser des mesures de réponse objectives telles que la maladie progressive, la maladie stable, le niveau de réactivité (partielle, complète ou maintenue), la rémission et la résistance, en suivant les directives décrites par Randall et al. (2024)16.

3. Cycles de traitement répétés jusqu’à l’émergence de cellules résistantes

  1. Détection de la première rechute
    1. Administrer une semaine complète de traitement de type induction à toute souris présentant une rechute de leucémie (nommée R1), c’est-à-dire lorsque le seuil de 0,2 % de hCD45+ dans le sang périphérique est atteint. Pendant 1 semaine, du lundi au vendredi, suivez le calendrier d’administration du médicament utilisé pour le traitement de type induction de 4 semaines.
      REMARQUE : L’administration de seulement 1 semaine de traitement à ce stade vise à tester in vivo si les cellules leucémiques ont acquis une résistance à la chimiothérapie tout en conduisant éventuellement la progression de la leucémie vers des rechutes successives au fil du temps, sous la pression de la chimiothérapie. Nous avons choisi de ne pas administrer un deuxième calendrier de 4 semaines afin d’éviter une toxicité excessive et la perte d’animaux.
    2. Laissez les souris se reposer à la fin de la semaine complète d’administration du médicament. Poursuivre la surveillance hebdomadaire de la réponse leucémique par cytométrie en flux en suivant les étapes 1.4 à 1.11.
      REMARQUE : À ce stade, on s’attend à ce que les cellules leucémiques continuent de répondre au traitement. Par conséquent, lors de la surveillance de la leucémie, le pourcentage de hCD45+ chez les souris devrait diminuer et rester négatif pendant un certain temps.
  2. Surveillance de l’apparition de R2
    1. Attendre l’apparition de la rechute R2 (cellules hCD45+ ≥ 0,2 %). Lorsqu’il apparaît, comptez le temps écoulé entre la fin du traitement et l’apparition de R2. Appelons cette période Δt1.
    2. Procéder à une deuxième semaine complète d’administration d’un traitement de type induction. Suivez les mêmes directives que lors de la première administration de ce calendrier.
    3. Laissez les souris se reposer à la fin du traitement. Poursuivre la surveillance de la leucémie.
  3. Surveillance de l’apparence de R3
    1. Attendez que la rechute R3 apparaisse. Comptez le temps de la même manière qu’à l’étape 3.2.1. Appelez-le Δt2.
    2. Comparez Δt1 et Δt2. Répétez les étapes ci-dessus N fois pour obtenir plusieurs rechutes de leucémie (R1, R2... RN) si la période Δt reste la même. Arrêtez les cycles de traitement une fois que la période Δt se raccourcit.
      REMARQUE : Une diminution de Δt jusqu’à la rechute est une indication de la résistance aux médicaments acquise par les cellules leucémiques. Ce résultat renforce la capacité du modèle murin de rechute à générer des cellules LAL résistantes à la chimiothérapie.
    3. Récupérez les cellules leucémiques comme décrit à l’étape 4 ci-dessous. Conservez-les vivants par cryoconservation ou par tout conservateur compatible avec les analyses ultérieures prévues.
      REMARQUE : L’événement recommandé pour la récupération des cellules leucémiques est jusqu’à 25 % de hCD45+ dans le sang périphérique, tel que décrit dans la littérature récente16.

4. Récupération des cellules leucémiques par prélèvement d’organes

  1. Euthanasie de souris avec une surdose d’anesthésiques chimiques
    1. Euthanasier les souris par surdose d’anesthésiques chimiques, suivie d’une luxation cervicale pour confirmation de l’euthanasie comme décrit ci-dessous.
    2. Préparez un mélange contenant trois anesthésiques dilués dans du PBS stérile 1x pour une anesthésie profonde. Utiliser 150 μL de maléate d’acépromazine du commerce, 50 μL de xylazine du commerce, 80 μL de kétamine du commerce et 220 μL de PBS pour chaque animal à euthanasier.
    3. Administrer 500 μL du mélange préparé par injection intrapéritonéale. Suivez les mêmes directives de contention et d’injection que celles décrites à l’étape 2.4.
    4. Sous l’effet d’une surdose d’anesthésiques chimiques, les souris vont se coucher au fond de la cage. Après quelques minutes, observez si les souris ont un arrêt respiratoire. Si c’est le cas, attendez que l’effort respiratoire cesse. Pour vérifier l’efficacité de la procédure d’euthanasie, il faut vérifier la présence d’un réflexe involontaire en exerçant une pression sur l’une des pattes arrière de l’animal. Pour confirmer l’euthanasie, procédez à une luxation cervicale.
  2. Luxation cervicale
    1. Tenez l’animal avec l’arrière du corps contre la grille d’alimentation de la cage. Utilisez l’index et le pouce de la main gauche pour former la forme d’une pince à épiler. Placez les doigts en forme de pince à épiler directement sous la tête de l’animal. Appuyez fermement contre la partie cervicale de la colonne vertébrale.
    2. Saisissez la queue de l’animal avec la main droite. Tirez-le vers l’arrière avec un mouvement ferme et régulier jusqu’à ce que la tête de l’animal soit séparée du reste de son corps.
      REMARQUE : La luxation cervicale est l’une des méthodes acceptées pour confirmer l’euthanasie 17,18,19. D’autres méthodes, telles qu’une exposition continue au CO2 pendant au moins 15 minutes après l’arrêt respiratoire, peuvent être utilisées comme alternative.
  3. Préparation des animaux pour le prélèvement d’organes
    1. Désinfectez les souris en appliquant 70 % d’alcool sur tout leur corps. Placez le corps de l’animal sur une plate-forme chirurgicale pour rongeurs avec la partie ventrale vers le haut. Rasez la partie abdominale du corps.
      REMARQUE : Une description complète de la plate-forme opératoire chirurgicale pour rongeurs se trouve dans la table des matériaux.
  4. Prélèvement de la rate
    1. Faites une petite incision avec des ciseaux chirurgicaux stériles et une pince à épiler sur la peau abdominale. Retirez-le de la région abdominale, exposant le péritoine.
    2. Faites une petite incision dans le péritoine. Coupez-le jusqu’à ce que l’accès complet aux organes situés dans l’abdomen soit obtenu.
    3. Localisez la rate, juste en dessous de l’estomac de l’animal. Retirez la rate. Placez-le dans un récipient contenant 1x PBS stérile pour un traitement ultérieur.
  5. Prélèvement des fémurs
    1. Procédez à l’ouverture de la cavité péritonéale pour accéder aux pattes arrière de l’animal.
    2. Localisez le fémur. Enlevez-le en coupant au niveau des articulations qui l’unissent à l’os du bassin ainsi qu’au tibia et au péroné. Faites ce processus pour les deux os du fémur.
    3. Nettoyez les os en enlevant tout muscle, peau ou tissu restant. Placez-les dans un récipient contenant 1x PBS stérile pour un traitement ultérieur. Jetez la carcasse de l’animal selon les directives du Comité d’éthique animale.
      REMARQUE : Selon les objectifs de l’étude, TOUTES les cellules pourraient également être prélevées dans le foie, le système nerveux central, le thymus, les ganglions lymphatiques, etc. Dans ce manuscrit, à titre d’exemple, nous décrivons la collection de cellules LAL de la rate et de la moelle osseuse.
  6. Préparation au traitement d’organes
    1. Rassemblez un tube à centrifuger stérile de 50 ml, deux seringues stériles de 1 ml, une aiguille hypodermique stérile de 25 mm x 0,6 mm et deux filtres à cellules stériles de 70 μm.
  7. Traitement de la rate
    1. Placez une crépine sur le dessus d’un tube à centrifuger ouvert de 50 ml. Mettez la rate à la surface de la passoire cellulaire. Faites macérer l’organe avec la partie plate du piston de la seringue jusqu’à ce qu’aucune grande partie ne soit visible.
    2. Ajouter du 1x PBS stérile à la rate macérée. Effectuez des mouvements circulaires avec la partie plate du piston de la seringue pour assurer la filtration des cellules.
      REMARQUE : Le coulage PBS peut être effectué progressivement ; cependant, le volume final utilisé ne peut pas dépasser 6 ml. Une fois le traitement de la rate terminé, la crépine cellulaire doit être claire et dépourvue de tout tissu résiduel. En cas de saturation de la crépine cellulaire, il est possible d’utiliser une autre crépine cellulaire. Le contenu de la passoire initiale peut être transféré dans la deuxième passoire, et le traitement peut ensuite être poursuivi. Pour accéder à la charge tumorale dans cet organe, une partie de la rate peut être séparée pour une évaluation histopathologique.
  8. Traitement de la moelle osseuse
    1. Incorporer une nouvelle crépine cellulaire pour le traitement de la moelle osseuse dans le tube à centrifuger déjà utilisé. Coupez les bords de l’os du fémur jusqu’à ce que les ouvertures de la moelle osseuse soient accessibles. Insérez l’aiguille hypodermique dans une nouvelle seringue. Ajouter 1 mL de PBS stérile 1x dans la seringue.
      REMARQUE : Selon les objectifs de l’étude, TOUTES les cellules obtenues à partir de la rate et de la moelle osseuse doivent être prélevées séparément. Dans ce cas, un tube à centrifuger séparé doit être utilisé pour chaque tissu. Une partie du fémur peut être séparée pour une évaluation histopathologique afin d’évaluer la charge tumorale au sein de cet organe.
    2. Effectuez le rinçage de la moelle osseuse sur la crépine cellulaire. Insérez la pointe de l’aiguille dans un côté de l’ouverture de la moelle osseuse. Poussez le piston de la seringue d’un mouvement ferme et constant. Répétez la procédure avec l’autre os du fémur.
    3. Découplez l’aiguille. Utilisez la partie plate de la seringue pour faire macérer la moelle osseuse rincée. Ajouter du 1x PBS stérile à la moelle osseuse macérée. Effectuez des mouvements circulaires avec la partie plate du piston de la seringue pour assurer la filtration des cellules. À la fin de la procédure de traitement, le tube à centrifuger de 50 mL contiendra un volume total de 10 mL, composé d’un mélange de cellules spléniques et de moelle osseuse qui ont été diluées dans du PBS.
      REMARQUE : Le processus de coulée PBS peut être exécuté progressivement ; cependant, il est impératif de s’assurer que le volume final utilisé ne dépasse pas 2 ml.

5. Isolement des cellules leucémiques par centrifugation à gradient

  1. Préparation à l’isolement des cellules leucémiques
    1. Rassemblez un tube à centrifuger de 15 ml, des pipettes Pasteur stériles jetables, le tube à centrifuger de 50 ml contenant les organes qui ont été traités et le milieu à gradient de densité pour l’isolement des lymphocytes.
      REMARQUE : Le milieu facilite l’isolation des cellules mononucléées en créant un gradient de densité par centrifugation. Les cellules mononucléées (lymphocytes, monocytes et cellules LAL) forment une couche à l’interface entre le milieu et le plasma.
  2. Isolement des cellules leucémiques
    1. Ajouter 5 mL du milieu à gradient de densité pour l’isolement des lymphocytes dans le tube à centrifuger de 15 mL à l’aide d’une pipette Pasteur jetable. Ajouter graduellement les 10 ml du mélange de cellules spléniques et de moelle osseuse sur la couche moyenne. Tenez le tube à un angle peu profond, environ 30° ou moins, et ajoutez lentement le mélange de cellules le long de la paroi du tube afin que la couche de densité moyenne ne soit pas perturbée.
      REMARQUE : Faites preuve de prudence pendant ce processus pour vous assurer que les cellules ne se mélangent pas avec le milieu de densité. Les perturbations au cours de ce processus peuvent entraîner l’échec de la formation d’un gradient de densité pendant la centrifugation.
    2. Centrifuger le tube de 15 mL à 420 x g sur un rotor à godet pivotant, pendant 30 min, sans accélération et sans rupture, pour ne pas perturber les phases formées.
      REMARQUE : Les cellules leucémiques vont former une couche entre le milieu de densité et les phases aqueuses.
    3. Retirer et jeter la phase aqueuse supérieure à l’aide d’une pipette Pasteur stérile et jetable. Prélever la couche de cellules leucémiques formée à l’aide d’une pipette Pasteur stérile et jetable. Transférez-le dans un nouveau tube à centrifuger de 15 ml.
      REMARQUE : Ne vous inquiétez pas si une partie de la couche moyenne de faible densité est pipetée avec les cellules leucémiques.
  3. Lavage des cellules leucémiques
    1. Ajouter du PBS stérile 1x dans le tube contenant les cellules collectées jusqu’à ce que la limite de 15 mL soit atteinte.
    2. Centrifuger les cellules à 300 x gpendant 5 min. Rétablissez l’accélération et le freinage maximum. Retirez et jetez le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans un nouveau rhume stérile 1x PBS.5.3.3.Procéder au contrôle de la cellule et de la viabilité cellulaire. Suivre les directives de procédure standard de numération cellulaire13. Les cellules lavées peuvent être colorées avec un anticorps CD45 anti-souris (mCD45), un anticorps CD45 humain (hCD45) et un anticorps CD19 humain (hCD19), suivi d’étapes de lavage et d’acquisition de données.
      REMARQUE : En cas de traitement des cellules de la rate et des cellules de la moelle osseuse dans différents tubes de centrifugation, une partie de ces échantillons peut être utilisée pour accéder à la charge tumorale dans ces organes par cytométrie en flux.
  4. Cryoconservation des cellules leucémiques
    1. Granuler les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 min. Jetez le surnageant. Gardez les cellules sur de la glace.
    2. Préparez un milieu de congélation composé de 90 % de sérum bovin fœtal froid stérile (FBS) et de 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO). Utilisez 1 mL de cette solution pour chaque flacon de cryoconservation.
    3. Sur glace, remettre en suspension les cellules dans la solution préparée à une concentration de 2 x 107 cellules/mL. Aliquote les cellules dans les tubes de cryoconservation. Cryoconserver les cellules selon les directives standard de cryoconservation des cultures cellulaires20.
      REMARQUE : Ces cellules peuvent être utilisées pour des analyses plus approfondies. Au lieu de congeler des cellules viables, on peut également aliquoter et conserver des cellules dans différents conservateurs pour des analyses ultérieures de l’ADN, de l’ARN, des protéines et des métabolites.

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Résultats

Dans le cadre de nos études, des échantillons de LAL à cellules B précurseurs ont été sélectionnés dans deux groupes de patients : l’un qui présentait une réponse favorable, déterminée par l’absence de cellules leucémiques dans le sang périphérique au jour 8 et l’absence de cellules leucémiques résiduelles dans la moelle osseuse aux jours 15, 33 et 78/96. L’autre groupe a été formé par des LAL qui correspondaient aux sous-groupes moléculaires des précéden...

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Discussion

Comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents aux maladies néoplasiques est essentiel pour le développement de thérapies plus efficaces et pour améliorer les résultats pour les patients. Dans des conditions telles que la leucémie lymphoblastique aiguë pédiatrique, ces approches d’investigation sont non seulement pertinentes pour augmenter les taux de guérison, mais ont également une valeur particulière pour les patients chez qui les traitements standard ont atteint les limites de l’...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions le Centro Infantil Boldrini et tous les patients qui ont fait don de leurs échantillons pour l’étude. Manuella M. Hoff a reçu une bourse du Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) de la Fondation pour la recherche de São Paulo (FAPESP, 2024/ 03383-2). José A. Yunes a reçu une bourse de productivité du Conseil national du développement technologique et scientifique (CNPq, 308399/2021-8). Ce travail a été soutenu par un financement de recherche du ministère brésilien de la Santé par le programme PRONON (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 mL  ; seringueBD  ;#309628Prélèvement d’organes
10 mL d’eau stérile pour injectionHalex Istar Indú ; stria Farmaceutica LTDAhttps://www.medstoremaringa.com.br/produtos/agua-destilada-10ml-pack-c-5un-isofarma/Reconstitution des médicaments
Solution de lyse 10X pour les globules rougesBioLegend#420302Traitement des échantillons de sang chez les souris
Analyseur de cellules à 5 canauxBD Biosciences658226R1Cytomètre en flux   ;
Filtre à cellules 70 uMFalcom#352350Prélèvement d’organes
Maléat d’Acepromazine Inj  ;Vetnil LTDAhttps://vetnil.com.br/produto/acepran-r-1Anesthésie de souris
APC anti-humain CD45 - souris isotype IgG1 - clone HI30BioLegend#304037Coloration lymphocytaire
Asparaginase 10000 UAginase/medac#88660100Traitement des souris
Brilliant-Violet 605 anti-souris CD45 - isotype IgG2 - clone 30-F11BioLegend#103139Coloration lymphocytaire
DaunorubicineFarmarin#116880025Traitement des souris
DexaméthasoneAché ;#00000066Traitement des souris
DiméthylsulfoxydeSigma-Aldrich#589569Cryopréservation des lymphocytes
Aiguille jetable - 0,60 x 25 mm (23G x 1' ’)BD#300388Prélèvement d’organes
Lancet jetable stérile   ;Yancheng Huida Instruments Médicaux & nbsp ;https://www.cralplast.com.br/produto/lanceta-manual/Collecte de sang de souris
Acide éthylénédiaminetétracetiqueTechnologies de vie#15576-O28Solution EDTA
Sérum fœtal bovinCultilab#F083Cryopréservation des lymphocytes
Analyse logicielle de cytométrie en flux - Version 10.10.0BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/Analyse de cytométrie en flux
Analyse logicielle de graphes et de tracés - Version 9.5.1Dotmaticshttps://www.graphpad.com/featuresTracé et analyse de graphes
Seringue à insuline avec aiguille attachée 1 mL FX 12,7 mm X 0,33 mmDescarpacke0342101Transplantation de souris et administration des médicaments
Ketamine InjSespo Indú ; stria e Comé ; rcio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/dopalen-pecuaria/Anesthésie de souris
Plateforme chirurgicale multifonctionnelle pour rongeursKent Scientific Corporationhttps://www.kentscientific.com/products/surgisuite/Interventions chirurgicales de souris
PE anti-humain CD19 - isotype de souris IgG1 - clone de HIB19BioLegend#302208Coloration lymphocytaire
Chlorure de potassiumSigma-AldrichP3911-1KGSolution PBS
Dibase phosphate de potassiumSigma-AldrichP0662-1KGSolution PBS
Réactif pour l’isolement des lymphocytesCytiva#17-1440-02, paquet de 6 & Times ; 100  ; MlIsolement des lymphocytes à partir d’organes prélevés
Chlorure de sodiumSigma-AldrichS9888-1kgSolution PBS
Phosphate de sodium dibase & nbsp ;Sigma-AldrichS9763-1KGSolution PBS
Pince à épiler anatomique stérile - 12 cm ABC 0170Laboratoire Lí ; Der120Interventions chirurgicales sur la souris
Ciseaux stériles 12 cm - ABC 0321Laboratoire Lí ; Der136Interventions chirurgicales sur la souris
VincristineLibbs#7896094208483Traitement des souris
Xylazine InjSespo Indú ; stria e Comé ; rcio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/anasedan-10-ml-bovinos-e-equinos/Anesthésie de souris

Références

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