Une méthode d’imagerie optique compatible avec la microscopie électronique à balayage pour la cartographie céraire mesoscopique de toutes les cellules

Summary

Nous avons introduit une nouvelle technique d’imagerie appelée tomographie par interférence optique multicouche (OMLIT), qui permet l’imagerie impartiale de toutes les cellules dans des échantillons cérébraux à l’échelle mésoscale et peut être intégrée sans effort au flux d’imagerie de la microscopie électronique à balayage en série sur ruban sur le même échantillon.

Abstract

Comprendre les relations structurelles et fonctionnelles au sein des réseaux neuronaux complexes du cerveau nécessite la construction d’atlas cérébraux qui possèdent à la fois un champ de vision large et une résolution subcellulaire. Cependant, les méthodes actuelles d’imagerie optique et microscopie électronique présentent chacune des limites, rendant difficile l’imagerie de toutes les cellules d’un même échantillon. Ce protocole introduit une technique d’imagerie appelée tomographie d’interférence optique multicouche (OMLIT), qui permet l’imagerie optique indiscriminée de toutes les cellules dans des échantillons cérébraux réalisés après la préparation d’échantillons par microscopie électronique, reconstruisant ainsi un atlas cérébral complet de toutes les cellules neuronales. De plus, l’imagerie OMLIT peut être intégrée de manière transparente au flux de travail d’imagerie de la microscopie électronique à balayage automatisé d’ultramicrotomie (ATUM-SEM). Cela permet aux chercheurs d’obtenir des informations structurales à mésoéchelle des cellules avant l’imagerie microscopique électronique, facilitant la sélection précise des régions d’intérêt et réduisant significativement la surface et le volume de données nécessaires à l’imagerie électronique (EM) à haute résolution. Nous avons validé la précision et la compatibilité de cette méthode dans des échantillons réels du cortex cérébral de la souris adulte, démontrant ses vastes perspectives d’application dans la construction d’atlas cérébral multi-échelles.

Introduction

Une cartographie complète des circuits neuronaux à la résolution cellulaire et subcellulaire est essentielle pour révéler la structure et la fonction du cerveau. Les méthodes traditionnelles d’imagerie optique, telles que la microscopie à deux^{photons 1}, la tomographie micro-optique de section à fluorescence (fMOST^)2,3,4 et le système^{VISoR 5}, ont permis l’imagerie neuronale à mésoéchelle et l’imagerie fonctionnelle in vivo. Cependant, en raison de leur dépendance à un marquage clairsemé, ils ne parviennent pas à capturer l’ensemble de la population cellulaire. En revanche, les techniques d’imagerie optique sans marqueur, telles que la microscopie photoacoustique fonctionnelle (fPAM^)6,7, la tomographie par cohérence optique (OCT)⁸ et la microscopie quantitative^{de phase 9}, ont le potentiel de visualiser simultanément tous les neurones dans le champ de vision. Néanmoins, ces méthodes sont généralement limitées par une faible résolution axiale et une faible profondeur d’imagerie, et leur complexité matérielle entrave une application généralisée dans la construction d’atlas cérébraux. En revanche, les techniques de microscopie électronique en section série (SSEM), incluant le SEB à face en bloc sériel (SBF-SEM^)10,11, le SEB à faisceau ionique focalisé (FIB-SEM⁾12,13,14, et l’ultramicromicrotomie automatisée de collecte de rubans SEM (ATUM-SEM⁾15,16,17 , peut révéler des réseaux de connectivité synaptique denses à la résolution nanométrique, fournissant des outils essentiels pour la connectomique haute résolution. Cependant, ces techniques souffrent d’un faible débit, de longs temps d’acquisition, de champs de vision limités et d’un coût élevé en traitement des données^{et matériel.}

Pour surmonter ces limitations, nous avons développé une méthode d’imagerie appelée Tomographie d’Interférence Optique Multicouche (OMLIT), qui offre une solution à faible coût et à haut débit pour l’imagerie à large champ indiscriminée, à fort contraste et à large champ de toutes les cellules sur des sections ultrafines, atteignant une résolution submicronique sur de grandes surfaces tissulaires. Parallèlement, OMLIT est intrinsèquement compatible avec les flux de travail SEM en sections sérielles : avant la microscopie électronique haute résolution, OMLIT fournit des informations structurelles sur les mêmes sections, permettant une navigation précise sur ROI et réduisant significativement la surface et le volume de données nécessaires pour l’imagerie électromagnétique ultérieure. L’OMLIT offre des avantages uniques au niveau de l’imagerie mésoscale et sert de pont essentiel reliant les cartes structurelles neuronales à différentes échelles spatiales. Sa nature non destructrice préserve le potentiel d’intégration future avec des stratégies spécifiques de marquage, telles que l’utilisation de protéines fluorescentes^{résistantes à l’osmium 19} pour la préparation et l’imagerie des échantillons. Cette méthode permet l’imagerie mésoscale de certaines régions cérébrales sélectionnées, permettant l’acquisition rapide de la morphologie, de la quantité, de la distribution et de la densité neuronale dans ces régions. Il facilite également la caractérisation quantitative des projections axonales et de la distribution des dendrites entre les neurones dans différentes zones cérébrales. Pour des régions spécifiques d’intérêt dans les résultats d’imagerie, les détails ultrastructuraux in situ peuvent être approfondis à l’aide de la microscopie électronique.

Le principe d’imagerie de l’OMLIT a été décrit dans les travaux de Hao^{Fan 20}. En résumé, lors de l’imagerie, la section ultrafine, la couche revêtue, le ruban de collecte, le ruban conducteur et la plaquette forment une structure de film fin multicouche. Lorsqu’une onde plane interagit avec cette structure, des ondes réfléchies sont générées à diverses interfaces et se chevauchent dans l’espace de détection, ce qui entraîne des interférences optiques dues aux différences de réflectance, d’indice de réfraction et d’absorption entre les matériaux. Un programme de simulation basé sur MATLAB, développé selon ce principe, a démontré un accord raisonnable avec les résultats expérimentaux.

Le schéma d’imagerie OMLIT peut être catégorisé en deux types selon la stratégie de traitement de la bande. La première est la stratégie de haute réflectivité, dans laquelle des métaux tels que Cr, Cu, Al ou Ag sont utilisés pour recouvrir la surface du ruban, ce qui entraîne des intensités optiques plus élevées dans les régions cytoplasmiques et des lumières vasculaires remplies de résine comparé aux zones environnantes. La seconde est la stratégie à faible réflectivité, qui utilise du ruban Kapton non revêtu, du ruban D-50 ou du ruban PET recouvert de CNT. Dans ce cas, le résultat de l’imagerie optique est l’inverse du premier : des régions sans membranes riches en résine (par exemple, cytoplasme et lumières vasculaires) apparaissent avec une intensité plus faible.

Nous résumons et établissons systématiquement des protocoles standardisés adaptés à deux stratégies d’imagerie distinctes. Les protocoles présentés ici offrent des procédures expérimentales complètes et détaillées. De plus, les problèmes courants rencontrés lors des expériences sont résumés, ainsi que les solutions proposées. Nous nous concentrons sur la présentation d’un ensemble de données du cortex de souris acquis en utilisant la stratégie à faible réflectivité (805 × 857,5 × 11,66 μm³), illustrant les caractéristiques distinctives et les avantages de l’approche d’imagerie OMLIT.

Protocol

Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles de l’Université des sciences et technologies de Chine et aux réglementations nationales pertinentes. La préparation de l’échantillon pour l’imagerie OMLIT suit le même protocole que celui utilisé en EM conventionnelle, et la procédure spécifique que nous avons employée a été décrite ailleurs²¹. En résumé, après anesthésie, les souris ont été perfusées séquentiellement par transcardie avec un tampon cacodylate de sodium, du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF), puis enfin un fixateur contenant du glutaraldéhyde et du paraformaldéhyde. Le cerveau a été soigneusement retiré, et environ 1 × 1 × 1 mm³ de tissu cérébral ont été sectionnés. Les échantillons étaient ensuite fixés chimiquement, soumis à des taches en série de métaux lourds, déshydratés et intégrés dans la résine. Le flux de travail général du protocole est présenté à la Figure 1.

Figure 1 : Aperçu du flux de travail. (A) Bandes de collecte mentionnées dans le protocole (de gauche à droite : polyimide, D-50 et PET recouvert de CNT). (B) Séparation en série et collecte des échantillons découpés. (C) Montage de rubans contenant des sections collectées sur une plaquette circulaire en silicium. (D) Imagerie par microscopie optique, barre d’échelle 100 μm. (E) Revêtement au carbone. (F) L’imagerie microscopique électronique correspond à la région décrite dans la Figure 1D, barre d’échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Préparation de la bande

REMARQUE : Les procédures suivantes doivent être effectuées dans une salle blanche afin d’éviter la contamination du ruban par la poussière.

1. Stratégie à haute réflectivité
   1. Sélectionnez Kapton (désormais appelé ruban polyimide, épaisseur 50 μm) ou film Panlite (désormais appelé D-50, épaisseur 50 μm) et montez-le sur le système d’enroulement motorisé. Ici, le ruban polyimide est utilisé comme exemple.
      REMARQUE : Un dispositif d’enroulement motorisé, conçu pour être entraîné par un moteur pas à pas contrôlé via une carte Arduino, pour faire passer la bande d’une bobine à l’autre via le cône plasma à sputter, a été utilisé dans cette étude. Pour compenser l’augmentation de la vitesse de ligne de la translation de la bande causée par l’accumulation de bande sur la bobine d’entraînement, augmentant ainsi le diamètre de la bobine de reprise, un programme a été écrit pour accorder en série la vitesse angulaire de la bobine après chaque rotation de 360°.
   2. Déposez un film fin uniforme de Cr (ou d’autres métaux tels que l’Al, l’Ag ou le Cu) à la surface de la bande à l’aide d’un système de sputtering magnétron (sputter à double tête). Positionnez la bande à une distance de 80 mm de la cible de sputtering pour un dépôt optimal. Effectuer le procédé sous alimentation en courant continu et à une pression de 1,0 Pa régulée par 99,99 % de gaz argon.
   3. Réglez la vitesse d’enroulement de la bande à 0,6 mm/s pour obtenir une épaisseur de revêtement métallique de 50 nm. Après dépôt, refroidissez lentement la chambre à température ambiante (RT) sous vide élevé pour minimiser les contraintes de revêtement.
      REMARQUE : L’épaisseur optimale du revêtement pour un même ruban peut varier selon le type de métal utilisé. Ajustez la vitesse de translation de la bande pour obtenir une variété d’épaisseurs de revêtement, telles que 50, 70, 100, 150 et 200 nm.
   4. Évaluez l’épaisseur et l’uniformité du revêtement à l’aide d’un profileur au stylet, d’une microscopie à force atomique ou d’une microscopie électronique à balayage.
   5. Nettoyez et rendez la bande hydrophile à l’aide d’un nettoyeur plasma à 80 W de puissance, avec une vitesse de déplacement de la bande de 7 mm/s. Après traitement, les gouttelettes d’eau placées sur la surface du ruban doivent rapidement se disperser dans un film fin (Figure 2A).
2. Stratégie à faible réflectivité
   REMARQUE : Ce protocole autorise l’utilisation soit d’un ruban D-50, soit d’un ruban commercial en polyéthylène térephtalate (PET) recouvert de polyéthylène (CNT). Comme ce dernier peut introduire un bruit de fond lors de l’imagerie microscopique électronique — bien que pas fort — cela pourrait potentiellement affecter la segmentation des images électromagnétiques. Par conséquent, la description suivante utilisera toujours la bande D-50 comme exemple.
   1. Préparez les films D-50 et découpez la feuille entière en bandes d’environ 7 mm de large. Utilisez un côté exposé du ruban pour collecter les sections, tout en protégeant l’autre côté avec une couche de film mat pour éviter les rayures et la contamination. Retirez le film mat lors de l’étape suivante de montage de la plaquette en silicium.
   2. Pour un plus grand nombre de sections, joignez différentes sections de ruban D-50 ensemble. Fixez les joints entre les segments de ruban à l’aide d’un ruban adhésif double face.
      REMARQUE : Lorsque vous collez des segments de ruban, assurez-vous que le ruban avant chevauche le ruban arrière de haut en bas via le ruban double face. Minimisez la surface adhésive et laissez une marge le long des bords du ruban pour éviter que la colle ne soit écrasée lors de l’enroulement, ce qui pourrait contaminer le ruban (Figure 2B).
   3. Nettoyez et rendez la bande hydrophile à l’aide d’un nettoyant plasma, en suivant la même procédure et en obtenant le même effet que décrit précédemment.
      REMARQUE : À part les étapes de revêtement métallique et de pulvérisation au carbone, les autres étapes des deux stratégies sont les mêmes.

2. Sélection en sections ultrafines et bande rubanée

1. À l’aide d’un petit meuleur ou d’un outil de coupe similaire, découpez grossièrement la résine sur le côté avec l’échantillon, en retirant la résine vierge environnante pour exposer la zone d’échantillon.
2. Placez le bloc incrusté de résine dans le porte-échantillon et serrez le bouton du support pour bien fixer le bloc.
3. Montez le porte-échantillon sur le bras mobile du microtome. Installez un couteau en verre ou un couteau de coupe diamant (à un angle de 45°) sur le porte-couteau. Au microscope, découpez la surface de l’échantillon en forme de pyramide et lissez la surface.
   REMARQUE : Les bords avant et arrière du bloc d’échantillon coupé doivent être aussi parallèles que possible ( voir Figure 2C).
4. Ajustez et lissez les quatre côtés du bloc d’échantillon pour éliminer tout excès de résine autour des bords, évitant ainsi d’éventuelles collisions avec le couteau diamanté. Faites pivoter le bouton pour vous assurer que les bords avant et arrière du bloc découpé sont alignés à l’horizontale.
5. Retirez le couteau de taille et remplacez-le par un couteau diamant posé à un angle de 45°. Réglez l’angle d’inclinaison de la base du microtome à 6°. Déplacez lentement le porte-couteau à l’aide du bouton jusqu’à ce que le bord avant du couteau diamanté soit à 1-2 mm de la surface de l’échantillon.
6. Observez la bande brillante entre la surface de l’échantillon et le bord du couteau, et ajustez l’angle d’inclinaison pour que la bande soit uniforme de haut en bas et de côté à côté. Cela permet de garantir que la première section inclut toute la surface de l’échantillon, et pas seulement un coin.
7. Injectez de l’eau distillée dans la rainure du couteau diamanté, permettant au niveau du liquide de monter et assurant que la lame est humide. Ensuite, utilisez une seringue pour retirer un peu d’eau jusqu’à ce que le niveau du liquide baisse et que le reflet paraisse argenté.
8. Réglez l’épaisseur de la section (alimentation), la vitesse de coupe et la fenêtre de coupe dans l’unité de commande. Ajustez la vitesse de coupe à 0,6 mm/s et réglez l’épaisseur de la section à 60 nm (la vitesse et l’épaisseur spécifiques dépendent de la qualité de l’échantillon).
9. Commencez le découpage. Une fois que le microtome est stable et que des sections uniformes sont produites, il faut interrompre le processus de sectionnement. Utilisez un pinceau fin pour enlever les sections coupées et les débris.
10. Installez à la fois le moulinet de ruban enduit et un moulinet vide sur le système automatique de collecte de sections ultrafines. Sécuriser le mécanisme de verrouillage et effectuer un essai pour garantir que la bande se déplace en douceur à une vitesse constante et qu’elle est correctement collectée sur la bobine vide.
11. Immergez la tête de collecte du dispositif de collecte de ruban dans le bain-marie du couteau diamant. Ajustez la position de la tête de collecte pour qu’elle soit parallèle au tranchant, à une distance de 1,5 fois la longueur de la tranche d’échantillon, afin de garantir que les sections coupées soient bien collectées sur le ruban. Sécurisez le dispositif de collecte et reprenez le coupe tout en faisant fonctionner simultanément le dispositif de collecte de bande.
12. Après avoir collecté un nombre suffisant de sections continues, mettez en pause le processus de sectionnement. Coupez la bande dans la zone de section où aucune section n’a été collectée, et continuez à faire fonctionner le dispositif de collecte de bande jusqu’à ce que toute la bande restante soit collectée sur la bobine.
13. Retirez la bobine contenant les sections collectées et placez-la dans un four de séchage électronique. Nettoyez le dispositif de collecte de ruban et le microtome, puis remettez tous les accessoires à leur place.

Figure 2 : Préparatifs avant la coupe. (A) Gouttelettes d’eau à la surface du ruban D-50 avant (en haut) et après le traitement hydrophile (en bas). (B) Vues schématiques de haut et de côté de la zone de jonction de la bande D-50. Bleu : bande D-50 ; orange : adhésif double face ; Green Arrow : Direction du mouvement de la bande. (C) Vue frontale de l’échantillon après la taille, montrant des bords supérieurs et inférieurs parallèles. (D) Dispositif automatisé de collecte de bandes. a : Bobine de ruban pour l’alimentation du ruban D-50 ; b : Bobine de ruban pour la récupération de bande ; Flèche rouge : direction du mouvement de la bande. (E) Position de la tête de collecte sur le dispositif automatisé de collecte de bandes. La boîte jaune en bas à droite indique une section fraîchement découpée sur le point d’être récupérée par l’appareil. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

3. Montage sur une plaquette en silicium

REMARQUE : Assurez-vous que l’espace de travail est propre afin d’éviter la contamination du ruban par la poussière lors des étapes suivantes.

1. Utilisez une tranche ronde de silicium de 4 pouces pré-nettoyée et hydrophilisée dans un système de traitement plasma (à 80 W de puissance, 3 min).
2. Mettez des gants propres, placez la plaquette en silicone sur une surface plane, et coupez un morceau de ruban carbone conducteur double face à une longueur appropriée (avec un surplomb de 2-3 cm aux deux extrémités). Décollez la couche blanche protectrice d’un côté du ruban conducteur double face, et appliquez-la de haut en bas sur la plaquette en silicium.
   REMARQUE : Les deux faces de la bande conductrice doivent être espacées d’environ 2 mm, et les bords du ruban doivent être visibles sur la plaquette en silicium. Pour un ruban conducteur double face de 25 mm de large, trois segments de ruban peuvent être appliqués à une plaquette de silicium de 4 pouces.
3. Dessinez un contour de la plaquette en silicium de 4 pouces sur l’établi et marquez la longueur approximative de chaque segment de bande qui sera appliqué sur la plaquette. Coupez le ruban qui a recueilli les sections selon les longueurs précédemment indiquées.
   REMARQUE : Le ruban coupé ne doit pas dépasser le bord de la plaquette en silicium, et ne doit pas couper dans les sections.
4. Décollez le film protecteur transparent du ruban conducteur double face, et pour le ruban D-50, retirez le film protecteur au dos du ruban à ce stade. Appliquez le ruban parallèlement au ruban conducteur double face. Appliquez jusqu’à trois segments de ruban adhésif sur chaque morceau de ruban conducteur double-face.
   REMARQUE : Pour réduire le risque que le ruban D-50 soit mal aligné ou contaminé par la poussière, couvrez une partie du ruban conducteur avec le film transparent qui avait été précédemment décollé, ne laissant qu’une petite partie du ruban conducteur exposée pour fixer l’extrémité du ruban D-50. Cela permet un ajustement plus facile de la direction de la bande. Ensuite, décollez lentement le film transparent restant, laissant le reste du ruban D-50 tomber doucement et adhérer au ruban conducteur.
5. Après le montage du ruban, des bulles d’air peuvent se former entre le ruban et le ruban conducteur, ce qui peut interférer avec le processus d’imagerie ultérieur. Placez la plaquette de silicium dans une chambre à vide (ou un autre équipement à vide) et appliquez un vide. Après la fin du processus de vide, assurez-vous que les bulles d’air ont disparu.

4. Après la coloration

1. Préparez 4 % d’acétate d’uranyle et 3 % de citrate de plomb, puis préchauffez-les à 50 °C à l’aide d’une marme.
   ATTENTION : L’acétate d’uranyle est radioactif et présente une toxicité importante pour le foie et les reins. Le citrate de plomb peut provoquer une intoxication au plomb, affectant le système nerveux, les reins et le système hématopoïétique. Le travail avec ces réactifs doit se faire dans une hotte à fumées, et un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, incluant une blouse de laboratoire, des gants en nitrile, un masque et des lunettes de sécurité, doit être porté. En cas de contact cutané ou visuel, lavez-vous immédiatement avec de grandes quantités d’eau, signalez le personnel de sécurité du laboratoire et consultez un médecin.
2. Placez la plaquette de silicium, qui a été aspirée et est exempte de bulles, dans un système d’hydrophilisation plasma pour hydrophilisation et nettoyage.
3. À l’aide d’une seringue de 10 mL sans l’aiguille, fixez un filtre à seringue de 0,22 μm et filtrez l’acétate d’uranyle à 4 %. Laissez tomber la solution sur la section jusqu’à ce que toute la surface de la tranche de silicium soit couverte, puis attendez 3 minutes.
4. Lavez avec de l’eau distillée pendant 3 minutes, répétez 3 fois, puis séchez la surface de l’échantillon avec de l’azote.
5. À l’aide d’une seringue de 10 mL sans l’aiguille, fixez un filtre à seringue de 0,22 μm et filtrez le citrate de plomb à 3 %. Laissez tomber la solution sur la section jusqu’à ce que toute la surface de la tranche de silicium soit couverte, puis attendez 5 minutes.
6. Lavez avec de l’eau distillée pendant 3 minutes, répétez 3 fois, puis séchez la surface de l’échantillon avec de l’azote.

5. Acquisition de données

1. Microscopie optique
   REMARQUE : Dans cette section, un scanner de lames de recherche (VS200, Olympus) est utilisé comme exemple pour la microscopie optique. D’autres microscopes, tels que l’Axio Imager.A2 Vario (Zeiss, Allemagne), conviennent également à l’imagerie optique décrite ici. Les étapes pour d’autres microscopes optiques sont généralement les mêmes.
   1. Placez la plaquette en silicium sur la scène du microscope optique et fixez-la avec un ruban adhésif non résiduaire.
   2. Utilisez une lentille objectif 5x pour obtenir une image d’ensemble de la plaquette de silicium, du ruban et de l’échantillon.
   3. Sur l’image d’aperçu, faites le contour de chaque section et triez-les, puis ajoutez des points de mise au point et des points d’exposition pour réaliser une imagerie automatique à un grossissement de 20x ou 50x sur l’ensemble de la plaquette de silicium avec toutes les sections.
   4. Une fois l’imagerie terminée, enregistrez les images, puis vérifiez la qualité de l’image. S’il y a des images floues ou de mauvaise qualité, refocalisez et réimagez.
2. Microscopie électronique
   REMARQUE : Plusieurs types de microscopes électroniques peuvent réaliser une imagerie continue de sections ultrafines placées sur des plaquettes en silicium. Ici, le Multibeam 505 (Zeiss) est utilisé comme exemple.
   1. Effectuez un revêtement au carbone sur la surface de l’échantillon à l’aide d’un revêtement à pulvérisation à haute vacuité, avec une épaisseur de carbone de 5,7 nm.
      REMARQUE : Cette étape peut être sautée pour les bandes recouvertes de métal selon une stratégie à haute réflectivité ou recouvertes de nanotubes de carbone (CNT) dans une stratégie à faible réflectivité.
   2. Utilisez un microscope optique (Axio Imager.A2 Vario, Zeiss) pour capturer la carte de navigation optique de la plaquette en silicium.
   3. Placez la plaquette de silicium dans la chambre d’échantillonnage du MEB. Associez la carte de navigation optique à l’image du microscope électronique en identifiant séquentiellement les deux marqueurs en forme de L imbriqués sur l’étage d’échantillonnage.
   4. Utilisez le module SAT dans le logiciel de microscopie (v3.2, 64 bits) pour identifier semi-automatiquement les positions de section et les zones d’imagerie à partir de la carte de navigation optique.
   5. Réglez la taille des pixels de l’image à 4 nm, le temps de séjour à 0,8 μs, les points et positions de mise au point, ainsi que les emplacements de stockage.
   6. Commencez l’imagerie continue.

6. Traitement des données

REMARQUE : Le stitching 2D des images OMLIT est effectué automatiquement par le logiciel. Pour l’enregistrement 3D à grande échelle et la segmentation des images OMLIT, d’autres algorithmes d’IA plus puissants sont disponibles. Ici, pour faciliter la vérification du procédé par la plupart des laboratoires, la couture, l’enregistrement et la segmentation à l’aide de Fiji (v1.54p, 64 bits) et VAST (v1.5.0, 64 bits) sont démontrés.

1. Ouvrez le jeu d’images à Fiji en faisant glisser le dossier contenant tous les fichiers image dans l’interface fidjienne, puis sélectionnez Stack Virtuelle lorsque vous le demandez.
2. Utilisez l’outil Rectangle pour sélectionner la région d’intérêt (ROI), puis recadrez le jeu de données via Image > Recaitre.
3. Alignez la pile d’images en utilisant le plugin Register Virtual Stack Slices (Plugins > Registration > Register Virtual Stack Slices).
4. Sauvegardez l’ensemble de données aligné au format TIFF (fichier > enregistrer comme > Tiff).
5. Importez la pile d’images TIFF dans VAST²² en utilisant Import > Import volume d’images des images vers . Fichier VSV.
   REMARQUE : Pour un tutoriel plus détaillé, veuillez consulter le site web : https://lichtman.rc.fas.harvard.edu/vast/
6. En connectant une tablette externe, utilisez l’outil pinceau en mode Dessin de segment pour commencer la segmentation manuelle et le traçage (utilisez les raccourcis A et Z pour naviguer rapidement entre les tranches d’image).
7. Visualisez la structure segmentée en 3D à l’aide de Window > 3D Viewer > Vue > mise à jour.
8. Sauvegardez les résultats de segmentation via File > Save Segmentation.

Results

Le flux de travail global du protocole (Figure 1) commence par la préparation de différentes bandes de collection. La figure 1 montre les trois types de bandes mentionnés dans le protocole (de gauche à droite : Kapton, D-50 et PET recouvert de CNT), qui présentent des propriétés optiques distinctes lorsqu’elles sont placées sur le même substrat de fond. Après la préparation de l’échantillon et le découpage des blocs, quelques se...

Discussion

Ici, nous avons développé une approche d’imagerie optique, appelée OMLIT, qui permet l’imagerie mésoscopique et est compatible avec les flux de travail de microscopie électronique à balayage série sur bande. En utilisant la méthode OMLIT, la microscopie optique peut être employée pour capturer des caractéristiques structurelles mésoscopiques à partir d’échantillons cérébraux, notamment les vaisseaux sanguins, les corps cellulaires, les noyaux, les branches dendritiques majeures et certai...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ruban adhésif	3M	B5005094008	Adhésif double face
Microscope à force atomique	Bruker	Icône dimensionnelle
Système automatique de collecte en sections ultrafines   ;	Lehua	AutoCUTS II
Ruban adhésif conducteur	Ted Pella	FP16084-8
Dektak Stylus Profilers	Bruker	DektakXT
Couteau diamanté pour sectionner	Diatomée	DUJ3530	Couteau Jumbo à diatomée
Couteau diamanté pour la coupe	Diatomée	DTB90	Couteau en verre
Microscope électronique	Zeiss	MultiSEM505	Alternative : GeminiSEM 300, Zeiss
FIJI (v1.54p, 64 bits)  ;	Open source	https://fiji.sc
Couteau de taille en verre	Self-made
Citrate de plomb	Leica	T534/2
Microscope optique	Olympus  ;	VS200	Alternative : Axio Imager. A2 Vario, Zeiss
Microscope optique   ;	Zeiss	; Axio Imager.A2 Vario
Nettoyeur plasma	Yidon Technologies	Hydro-S4	Alternatives : Ted Pella Pelco ou autre nettoyant plasma de laboratoire
Bande polymère	Melton	Kapton	Le site web de l’entreprise n’est plus accessible. Nous recommandons aux chercheurs d’essayer les bandes KAPTON disponibles localement.
Bande polymère	Teijin	PET	https://www.teijin.com/
Bande polymère	Teijin	D-50	https://www.teijin.com/
Plaquette en silicium	Saichi	912303	La plaquette est polie d’un côté.
Enduiseur sputter & nbsp ;	Leica	ACE600	Alternative : Sputter à double tête, Yujie
Ultramicrotome	Leica	UC7	Alternative : RMC PT-PC
Uranylacétate	EMS	22400
VAST (v1.5.0, 64 bits)	Institut médical Howard Hughes	https://software.dvid.io/vast/	VAST A1 :D32Lite est un outil gratuit pour l’annotation manuelle et la segmentation de grands ensembles de données de microscopie 3D.
Logiciel ZEN (v3.2, 64 bits)	Zeiss	https://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html