Une méthode d’imagerie optique compatible avec la microscopie électronique à balayage pour la cartographie céraire mesoscopique de toutes les cellules

Summary

Nous avons introduit une nouvelle technique d’imagerie appelée tomographie par interférence optique multicouche (OMLIT), qui permet l’imagerie impartiale de toutes les cellules dans des échantillons cérébraux à l’échelle mésoscale et peut être intégrée sans effort au flux d’imagerie de la microscopie électronique à balayage en série sur ruban sur le même échantillon.

Abstract

Comprendre les relations structurelles et fonctionnelles au sein des réseaux neuronaux complexes du cerveau nécessite la construction d’atlas cérébraux qui possèdent à la fois un champ de vision large et une résolution subcellulaire. Cependant, les méthodes actuelles d’imagerie optique et microscopie électronique présentent chacune des limites, rendant difficile l’imagerie de toutes les cellules d’un même échantillon. Ce protocole introduit une technique d’imagerie appelée tomographie d’interférence optique multicouche (OMLIT), qui permet l’imagerie optique indiscriminée de toutes les cellules dans des échantillons cérébraux réalisés après la préparation d’échantillons par microscopie électronique, reconstruisant ainsi un atlas cérébral complet de toutes les cellules neuronales. De plus, l’imagerie OMLIT peut être intégrée de manière transparente au flux de travail d’imagerie de la microscopie électronique à balayage automatisé d’ultramicrotomie (ATUM-SEM). Cela permet aux chercheurs d’obtenir des informations structurales à mésoéchelle des cellules avant l’imagerie microscopique électronique, facilitant la sélection précise des régions d’intérêt et réduisant significativement la surface et le volume de données nécessaires à l’imagerie électronique (EM) à haute résolution. Nous avons validé la précision et la compatibilité de cette méthode dans des échantillons réels du cortex cérébral de la souris adulte, démontrant ses vastes perspectives d’application dans la construction d’atlas cérébral multi-échelles.

Introduction

Une cartographie complète des circuits neuronaux à la résolution cellulaire et subcellulaire est essentielle pour révéler la structure et la fonction du cerveau. Les méthodes traditionnelles d’imagerie optique, telles que la microscopie à deux^{photons 1}, la tomographie micro-optique de section à fluorescence (fMOST^)2,3,4 et le système^{VISoR 5}, ont permis l’imagerie neuronale à mésoéchelle et l’imagerie fonctionnelle in vivo. Cependant, en raison de leur dépendance à un marquage clairsemé,....

Protocol

Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles de l’Université des sciences et technologies de Chine et aux réglementations nationales pertinentes. La préparation de l’échantillon pour l’imagerie OMLIT suit le même protocole que celui utilisé en EM conventionnelle, et la procédure spécifique que nous avons employée a été décrite ailleurs²¹. En résumé, après anesthésie, les souris ont été perfusées séquentiellement par transcardie avec un tampon cacodylate de sodium, du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF), puis enfin un fixateur contenant du glutaraldéhyde ....

Results

Le flux de travail global du protocole (Figure 1) commence par la préparation de différentes bandes de collection. La figure 1 montre les trois types de bandes mentionnés dans le protocole (de gauche à droite : Kapton, D-50 et PET recouvert de CNT), qui présentent des propriétés optiques distinctes lorsqu’elles sont placées sur le même substrat de fond. Après la préparation de l’échantillon et le découpage des blocs, quelques se.......

Discussion

Ici, nous avons développé une approche d’imagerie optique, appelée OMLIT, qui permet l’imagerie mésoscopique et est compatible avec les flux de travail de microscopie électronique à balayage série sur bande. En utilisant la méthode OMLIT, la microscopie optique peut être employée pour capturer des caractéristiques structurelles mésoscopiques à partir d’échantillons cérébraux, notamment les vaisseaux sanguins, les corps cellulaires, les noyaux, les branches dendritiques majeures et certai.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ruban adhésif	3M	B5005094008	Adhésif double face
Microscope à force atomique	Bruker	Icône dimensionnelle
Système automatique de collecte en sections ultrafines   ;	Lehua	AutoCUTS II
Ruban adhésif conducteur	Ted Pella	FP16084-8
Dektak Stylus Profilers	Bruker	DektakXT
Couteau diamanté pour sectionner	Diatomée	DUJ3530	Couteau Jumbo à diatomée
Couteau diamanté pour la coupe	Diatomée	DTB90	Couteau en verre
Microscope électronique	Zeiss	MultiSEM505	Alternative : GeminiSEM 300, Zeiss
FIJI (v1.54p, 64 bits)  ;	Open source	https://fiji.sc
Couteau de taille en verre	Self-made
Citrate de plomb	Leica	T534/2
Microscope optique	Olympus  ;	VS200	Alternative : Axio Imager. A2 Vario, Zeiss
Microscope optique   ;	Zeiss	; Axio Imager.A2 Vario
Nettoyeur plasma	Yidon Technologies	Hydro-S4	Alternatives : Ted Pella Pelco ou autre nettoyant plasma de laboratoire
Bande polymère	Melton	Kapton	Le site web de l’entreprise n’est plus accessible. Nous recommandons aux chercheurs d’essayer les bandes KAPTON disponibles localement.
Bande polymère	Teijin	PET	https://www.teijin.com/
Bande polymère	Teijin	D-50	https://www.teijin.com/
Plaquette en silicium	Saichi	912303	La plaquette est polie d’un côté.
Enduiseur sputter & nbsp ;	Leica	ACE600	Alternative : Sputter à double tête, Yujie
Ultramicrotome	Leica	UC7	Alternative : RMC PT-PC
Uranylacétate	EMS	22400
VAST (v1.5.0, 64 bits)	Institut médical Howard Hughes	https://software.dvid.io/vast/	VAST A1 :D32Lite est un outil gratuit pour l’annotation manuelle et la segmentation de grands ensembles de données de microscopie 3D.
Logiciel ZEN (v3.2, 64 bits)	Zeiss	https://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html