Method Article

Détection par sonde fluorescente PCR des espèces d’Aspergillus , Cryptococcus neoformans et Pneumocystis jirovecii

DOI:

10.3791/68819

⸱

May 8th, 2026

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1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

In This Article

Summary

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Ici, nous présentons un protocole de test clinique basé sur la méthode de la sonde fluorescente PCR pour la détection simultanée d’Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans et Pneumocystis jirovecii.

Abstract

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Ce protocole décrit une procédure standardisée pour la détection qualitative des espèces d’Aspergillus , Cryptococcus neoformans et Pneumocystis jirovecii dans des échantillons cliniques d’écrachats utilisant un kit de détection d’acides nucléiques par sonde fluorescente PCR. La procédure comprend la collecte d’échantillons cliniques, le prétraitement de liquéfaction alcaline, l’extraction automatisée des acides nucléiques et la détection par PCR en temps réel multiplex. Aspergillus spp., C. neoformans et P. jirovecii sont détectés à l’aide de sondes fluorescentes spécifiques à la cible (canaux FAM, VIC et CY5, respectivement), avec un contrôle interne (canal ROX) intégré pour l’assurance qualité. La validité du test et l’interprétation des résultats de l’échantillon sont basées sur des seuils de seuil de cycle (Ct) définis. Un contrôle positif doit présenter des courbes d’amplification en forme de S avec Ct ≤ 33,7 sur tous les canaux, tandis que le contrôle négatif ne doit afficher aucune amplification. Pour les échantillons cliniques, une valeur de Ct ≤ 33,7 dans le canal FAM indique la positivité pour les espèces d’Aspergillus , et une valeur ≤ 36 dans les canaux VIC ou CY5 indique la positivité pour C. neoformans ou P. jirovecii, respectivement.

Introduction

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Les infections fongiques invasives, telles que celles causées par Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans et Pneumocystis jirovecii, représentent une menace significative pour les patients immunodéprimés, entraînant une morbidité et une mortalité élevées. Un diagnostic rapide et précis est essentiel pour initier une thérapie antifongique appropriée et améliorer les résultatscliniques 1. Les méthodes diagnostiques conventionnelles, notamment la culture, la microscopie et la détection antigénique, présentent des limites notables. La culture est longue et présente une faible sensibilité, la microscopie manque d’identification au niveau de l’espèce et dépend de l’opérateur, tandis que les tests antigéniques (par exemple, galactomanane, β-D-glucan) peuvent présenter une réactivité croisée et des performances incohérentes. Le diagnostic moléculaire, en particulier la PCR en temps réel, peut combler certaines de ces lacunes en offrant des délais de réponse plus courts et un potentiel de sensibilité et de spécificité élevées. Les avancées dans la PCR multiplex permettent également la détection simultanée de plusieurs agents pathogènes à partir d’un seul échantillon, améliorant ainsi l’efficacité du diagnostic.

Ce protocole décrit un test PCR multiplex par sonde fluorescente pour détecter qualitativement l’ADN d’Aspergillus spp., C. neoformans et P. jirovecii dans des échantillons d’expectorations humaines en ciblant des régions conservées du gène 18S rRNA (Aspergillus spp.), du gène ITS (C. neoformans) et du gène rRNA mtLSU (P. jirovecii). Les caractéristiques clés de cette méthode incluent une sensibilité analytique définie : la limite de détection pour les espèces d’Aspergillus, C. neoformans et P. jirovecii est de 1 500 copies/mL ; spécificité amorce/sonde : les amorces et sondes spécifiques à la cible minimisent la réactivité croisée avec l’ADN humain ou d’autres plantes communes ; Contrôle robuste de la contamination : l’intégration de systèmes dUTP-UDG (uracil-ADN glycosylase) empêche efficacement la contamination reportée par les amplicons PCR précédents, une caractéristique essentielle pour maintenir la fiabilité des tests en laboratoireclinique 2 ; Contrôle intégré du processus : Un contrôle interne endogène ciblant le gène RP humain (protéine ribosomal), marqué avec le fluorophore ROX, est co-amplifié pour surveiller l’intégrité de l’extraction des acides nucléiques et identifier une inhibition potentielle par PCR, réduisant ainsi les résultats fauxnégatifs 3. Cette approche est soutenue par des lignes directrices établies pour l’assurance qualité en diagnosticmoléculaire 4,5. Le protocole s’applique principalement aux échantillons respiratoires (craupions/BALF) provenant de populations à haut risque, telles que les patients en hémato-oncologie ou les receveurs de greffes. Les limites potentielles, notamment les faux positifs dus à la contamination environnementale ou à la diminution de la sensibilité due à une dilution excessive de l’échantillon, sont également abordées, ainsi que des stratégies d’atténuation.

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Protocol

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L’utilisation des échantillons cliniques a été approuvée par le comité d’éthique compétent (Accord n° : ZYS-GCP-2025006). Tous les participants ont donné un large consentement éclairé pour l’utilisation de leurs données et spécimens dans la recherche. Tous les réactifs et consommables utilisés dans ce protocole sont listés dans leT des matériaux.

1. Collecte d’échantillons

  1. Collectez 3 à 5 mL de liquide de lavage crachat ou bronchoalvéolaire dans des contenants stériles et soumettez rapidement pour analyse.

2. Préparation des réactifs

REMARQUE : Ces étapes ont été réalisées dans la salle de préparation des réactifs.

  1. Retirez le kit de détection du congélateur à -28 °C et décongelez complètement à température ambiante (25–30 °C) pendant 30 minutes.
  2. Calculer le nombre total de réactions (N) : N = nombre d’échantillons d’essai (n) + témoins positif/négatif (2) + 1
  3. Préparez le mélange de réaction dans un tube stérile de microcentrifuge. Pour une réaction unique : 35 μL de mélange d’amplification d’acides nucléiques + 5 μL de mélange amorce-sonde, montez en procédent à un vortex complet, puis centrifugez brièvement.
  4. Aliquote 40 μL de la réaction se mélange dans chaque tube PCR (selon le protocole du fabricant du kit) et transfert vers la fenêtre de passage de la salle de traitement de l’échantillon.

3. Traitement des échantillons

REMARQUE : Ces étapes ont été effectuées dans la salle de traitement des échantillons. Élimination des déchets : Jetez le surnageant de l’étape 3.2.2 ainsi que d’autres déchets liquides contenant du NaOH dans un contenant désigné pour déchets chimiques.

  1. Liquéfaction
    1. Ajoutez du liquide de lavage crachat/bronchoalvéolaire (BALF) dans un tube à bouchon vissé de 50 mL.
    2. Ajoutez 1 à 2 volumes de solution de digestion au NaOH à 4 % (par rapport à la viscosité des crachats).
      ATTENTION : NaOH est corrosif. Évitez le contact avec la peau et les yeux.
    3. Serrez le bouchon, faites le vortex pendant 1 minute, puis incubez dans un meuble de biosécurité à température ambiante pendant 15 à 20 minutes.
  2. Enrichissement
    1. Centrifugez des échantillons liquéfiés à 3 000 tr/min pendant 5 minutes.
    2. On élimine le surnageant à l’aide d’une pipette, en conservant 1 000 μL de sédiments.
    3. Manipulez soigneusement les sédiments.
  3. Lyse
    1. Transférez 500 μL de sédiments dans un tube de lyse. Vortex pendant 10 minutes puis centrifugeuse brièvement.
  4. Extraction
    REMARQUE : Élimination des déchets : Les plaques, embouts et tubes d’extraction utilisés ayant touché des échantillons biologiques doivent être jetés dans un contenant homologué pour déchets bio-dangereux.
    1. Transférez tout le surnageant lysate et 100 μL de témoins négatifs/positifs vers la colonne 2 de la plaque d’extraction.
    2. Effectuer l’extraction des acides nucléiques à l’aide d’un système automatisé d’extraction des acides nucléiques avec le programmedésigné 6.
  5. Chargement d’échantillons
    1. Transférez 10 μL d’acide nucléique extrait (colonne 6) et les témoins vers des tubes PCR. Centrifugez brièvement et transférez à la fenêtre de passage de la salle d’amplification.

4. Amplification des acides nucléiques

REMARQUE : Ces étapes ont été effectuées dans la salle d’amplification.

  1. Chargez les tubes PCR dans l’instrument automatisé d’amplification nucléique et sélectionnez le modèle d’amplification approprié.
  2. Assigner des canaux de détection : Aspergillus spp. : canal FAM ; C. neoformans : canal VIC ; P. jirovecii : canal CY5 ; Contrôle interne : ROXcanaux 7, 8, 9.
  3. Définissez des noms d’exemple et exécutez le programme.

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Results

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Les courbes d’amplification représentatives obtenues à l’aide de ce test PCR à sonde fluorescente multiplex sont illustrées dans les figures 1 et 2. La validité du test a été déterminée sur la base de critères témoins prédéfinis. Dans une exécution valide, le contrôle positif produisait des courbes d’amplification caractéristiques en forme de S dans les canaux FAM, VIC, CY5 et ROX, avec des valeurs de seuil de cycle (Ct) ≤ 33,7 ...

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Discussion

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Le protocole multiplex de PCR en temps réel établi dans cette étude fournit une procédure standardisée pour la détection simultanée et rapide de trois agents fongiques fongiques invasifs clés (Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans et Pneumocystis jirovecii) dans des échantillons cliniques d’expectorations. Cette méthode permet la détection directe de l’ADN pathogène à partir d’échantillons cliniques. Contrairement aux approches diagnostiques traditionnelles telles que la culture, la ...

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Disclosures

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgements

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Nous tenons à remercier le Département du laboratoire clinique de l’hôpital populaire du district de Shanshui à Foshan pour avoir fourni l’équipement et le soutien technique.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 & mu ; Pointes de pipette étendues stériles à pointe de filtre en L (en rack)Xiaorui BiotechnologieS20221126
1000 & mu ; Embouts stériles de pipette LJiangsu Xinkang Medical Instrument Co., Ltd241101
200 & mu ; Pointes de pipette stériles à filtre étendu LXiaorui Biotechnologie241001
Tubes de lyseZC de Pékin : Bio-Science & Sciences Technology CoF1040
Kit de détection des acides nucléiques pour Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans et Pneumocystis jiroveciiZC de Pékin : Bio-Science & Sciences Technology Co.CT8143-48T
Réactif d’extraction d’acides nucléiquesZC de Pékin : Bio-Science & Sciences Technology CoCN8053-B40T
Tampon de dilution d’échantillonZC de Pékin : Bio-Science & Sciences Technology CoSP7065

References

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PCR DetectionFluorescent ProbeAspergillus SppCryptococcus NeoformansPneumocystis JiroveciiMultiplex Real Time PCRNucleic Acid ExtractionClinical Sputum SamplesCycle ThresholdInternal Control

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