Method Article

Détection par sonde fluorescente PCR des espèces d’Aspergillus , Cryptococcus neoformans et Pneumocystis jirovecii

DOI:

10.3791/68819

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May 8th, 2026

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1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

In This Article

Summary

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Ici, nous présentons un protocole de test clinique basé sur la méthode de la sonde fluorescente PCR pour la détection simultanée d’Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans et Pneumocystis jirovecii.

Abstract

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Ce protocole décrit une procédure standardisée pour la détection qualitative des espèces d’Aspergillus , Cryptococcus neoformans et Pneumocystis jirovecii dans des échantillons cliniques d’écrachats utilisant un kit de détection d’acides nucléiques par sonde fluorescente PCR. La procédure comprend la collecte d’échantillons cliniques, le prétraitement de liquéfaction alcaline, l’extraction automatisée des acides nucléiques et la détection par PCR en temps réel multiplex. Aspergillus spp., C. neoformans et P. jirovecii sont détectés à l’aide de sondes fluorescentes spécifiques à la cible (canaux FAM, VIC et CY5, respectivement), avec un contrôle interne (canal ROX) intégré pour l’assurance qualité. La validité du test et l’interprétation des résultats de l’échantillon sont basées sur des seuils de seuil de cycle (Ct) définis. Un contrôle positif doit présenter des courbes d’amplification en forme de S avec Ct ≤ 33,7 sur tous les canaux, tandis que le contrôle négatif ne doit afficher aucune amplification. Pour les échantillons cliniques, une valeur de Ct ≤ 33,7 dans le canal FAM indique la positivité pour les espèces d’Aspergillus , et une valeur ≤ 36 dans les canaux VIC ou CY5 indique la positivité pour C. neoformans ou P. jirovecii, respectivement.

Introduction

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Les infections fongiques invasives, telles que celles causées par Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans et Pneumocystis jirovecii, représentent une menace significative pour les patients immunodéprimés, entraînant une morbidité et une mortalité élevées. Un diagnostic rapide et précis est essentiel pour initier une thérapie antifongique appropriée et améliorer les résultatscliniques 1. Les méthodes diagnostiques conventionnelles, notamment la culture, la microscopie et la détection antigénique, présentent des limites notables. La culture est longue et présente une faible sensibilit....

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Protocol

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L’utilisation des échantillons cliniques a été approuvée par le comité d’éthique compétent (Accord n° : ZYS-GCP-2025006). Tous les participants ont donné un large consentement éclairé pour l’utilisation de leurs données et spécimens dans la recherche. Tous les réactifs et consommables utilisés dans ce protocole sont listés dans leT des matériaux.

1. Collecte d’échantillons

  1. Collectez 3 à 5 mL de liquide de lavage crachat ou bronchoalvéolaire dans des contenants stériles et soumettez rapidement pour analyse.

2. Préparation ....

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Results

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Les courbes d’amplification représentatives obtenues à l’aide de ce test PCR à sonde fluorescente multiplex sont illustrées dans les figures 1 et 2. La validité du test a été déterminée sur la base de critères témoins prédéfinis. Dans une exécution valide, le contrôle positif produisait des courbes d’amplification caractéristiques en forme de S dans les canaux FAM, VIC, CY5 et ROX, avec des valeurs de seuil de cycle (Ct) ≤ 33,7 .......

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Discussion

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Le protocole multiplex de PCR en temps réel établi dans cette étude fournit une procédure standardisée pour la détection simultanée et rapide de trois agents fongiques fongiques invasifs clés (Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans et Pneumocystis jirovecii) dans des échantillons cliniques d’expectorations. Cette méthode permet la détection directe de l’ADN pathogène à partir d’échantillons cliniques. Contrairement aux approches diagnostiques traditionnelles telles que la culture, la .......

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Disclosures

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgements

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Nous tenons à remercier le Département du laboratoire clinique de l’hôpital populaire du district de Shanshui à Foshan pour avoir fourni l’équipement et le soutien technique.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 & mu ; Pointes de pipette étendues stériles à pointe de filtre en L (en rack)Xiaorui BiotechnologieS20221126
1000 & mu ; Embouts stériles de pipette LJiangsu Xinkang Medical Instrument Co., Ltd241101
200 & mu ; Pointes de pipette stériles à filtre étendu LXiaorui Biotechnologie241001
Tubes de lyseZC de Pékin : Bio-Science & Sciences Technology CoF1040
Kit de détection des acides nucléiques pour Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans et Pneumocystis jiroveciiZC de Pékin : Bio-Science & Sciences Technology Co.CT8143-48T
Réactif d’extraction d’acides nucléiquesZC de Pékin : Bio-Science & Sciences Technology CoCN8053-B40T
Tampon de dilution d’échantillonZC de Pékin : Bio-Science & Sciences Technology CoSP7065

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
  2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R.

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PCR DetectionFluorescent ProbeAspergillus SppCryptococcus NeoformansPneumocystis JiroveciiMultiplex Real Time PCRNucleic Acid ExtractionClinical Sputum SamplesCycle ThresholdInternal Control

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