Article de méthode

Étude du mécanisme de modulation de la LINC00511 médiée par les β-élémènes pour supprimer la résistance au cisplatine dans le cancer du poumon

DOI :

10.3791/68825

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19 août 2025

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1School of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine, 2Health Care Department, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Teaching Department, The Third Affiliated Clinical Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, 4The Research Center of The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 5Northeast Asia Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 6Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La résistance au cisplatine (DDP) limite l’efficacité de la chimiothérapie dans le cancer du poumon. Cette étude visait à élucider comment le β-Elemene(β-Ele) inverse la résistance dans les cellules A549/DDP en régulant à la baisse LINC00511. Des analyses in vitro et RNA-seq ont montré que cette régulation inhibe la glycolyse aérobie et la signalisation Wnt/β-caténine, offrant une stratégie potentielle pour surmonter la chimiorésistance.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La résistance au cisplatine limite considérablement l’efficacité de la chimiothérapie dans le cancer du poumon non à petites cellules, ce qui nécessite le développement de nouvelles stratégies pour surmonter cet obstacle. Cette étude in vitro visait à élucider le mécanisme par lequel β-Ele inverse la résistance au cisplatine dans les cellules d’adénocarcinome pulmonaire via les voies de signalisation LINC00511-médiée par le et Wnt/β-caténine. La lignée cellulaire d’adénocarcinome pulmonaire humain résistant au cisplatine (A549/DDP), avec surexpression ou knockdown LINC00511, a été établie par transfection plasmidique. L’efficacité de la transfection a été évaluée à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase par transcriptase inverse quantitative (qRT-PCR) pour détecter les niveaux d’expression LINC00511. L’évaluation par le dosage de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) a indiqué une inhibition significative de la prolifération cellulaire A549/DDP médiée par l’β-Ele. Une analyse plus poussée du séquençage de l’ARN a révélé que l’effet inhibiteur du β-Elemene sur la résistance au cisplatine était étroitement associé à l’interférence de la glycolyse cellulaire et à la suppression de l’activation de la voie de signalisation Wnt/β-caténine. L’analyse par transfert Western de protéines clés, y compris le transporteur de glucose 1 (GLUT1), la pyruvate kinase M2 (PKM2), la lactate déshydrogénase A (LDHA), la β-caténine et la glycogène synthase kinase 3β (GSK-3β), a montré que β-Elemene renversait la résistance au cisplatine en inhibant la glycolyse aérobie et en bloquant l’activation de la voie de signalisation Wnt/β-caténine par régulation négative de la LINC00511. Collectivement, ces résultats démontrent que β-Elemene surmonte la résistance au cisplatine dans le cancer du poumon en ciblant LINC00511 et sa voie associée de glycolyse aérobie/Wnt/β-caténine. Celle-ci établit un cadre théorique pour les futures investigations précliniques et cliniques tout en révélant des cibles thérapeutiques potentielles.

Introduction

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Parmi les tumeurs malignes dans le monde, le cancer du poumon présente des taux d’incidence et de mortalité exceptionnellement élevés, caractérisés par la transformation maligne et la croissance invasive des cellules épithéliales bronchiques 1,2. Sur la base des caractéristiques histopathologiques, le cancer du poumon est classé comme carcinome non à petites cellules (NSCLC) ou carcinome à petites cellules (SCLC)3. Il convient de mentionner que le CPNPC représente environ 85 % du total des cas de cancer du poumon 4,5. En tant que norme chimiothérapeutique de première intention pour le CPNPC, le cisplatine (DDP) est cliniquement indispensable6. Cependant, les observations cliniques ont révélé que les cellules tumorales peuvent développer une résistance aux médicaments via de multiples mécanismes, impliquant principalement l’activation des voies d’échappement immunitaire, des mutations dans les gènes cibles des médicaments et une dérégulation des voies métaboliques des médicaments 7,8,9.

Les ARN longs non codants (ARNlnc) représentent des transcrits > 200 nucléotides (nt) qui n’ont pas la capacité de codage des protéines10. De plus en plus de preuves indiquent que l’ARNlnc peut inverser la résistance au cisplatine dans les cellules tumorales par de multiples mécanismes, tels que le fonctionnement en tant qu’ARN endogènes concurrents (ARNce) pour éponger les miARN et libérer leurs gènes cibles11, moduler les voies de signalisation de l’apoptose12, participer à la réparation des dommages à l’ADN13 et réguler l’autophagie cellulaire14. De plus, avec l’avancement de la recherche sur la reprogrammation métabolique tumorale, des preuves substantielles ont émergé démontrant que l’ARNlnc joue un rôle régulateur essentiel dans ce processus. L’effet Warburg, dénotant la glycolyse aérobie, constitue une caractéristique métabolique fondamentale des cellules malignes15. Il fournit non seulement de l’énergie pour la prolifération cellulaire rapide, mais génère également des métabolites intermédiaires qui servent de précurseurs pour la biosynthèse, soutenant la synthèse des protéines et des lipides pour répondre aux exigences de la croissance tumorale maligne16. Dans le cancer du poumon, il a été confirmé que lncRNA influence significativement la progression tumorale et la résistance à la chimiothérapie en régulant la voie de glycolyse aérobie17,18.

Parmi ceux-ci, LINC00511, une molécule d’ARNlnc largement étudiée ces dernières années, serait étroitement associée à l’initiation et au développement de diverses tumeurs malignes19. Ces résultats permettent non seulement d’élucider les mécanismes spécifiques de l’implication de l’ARNlnc dans la reprogrammation métabolique de la tumeur, mais aussi de fournir une base théorique pour les stratégies de traitement des tumeurs ciblées par l’ARNlnc, ouvrant ainsi des voies thérapeutiques potentielles.

Dérivé des rhizomes de Curcuma zedoaria, β-Ele est un sesquiterpénoïde bioactif à l’efficacité antitumorale établie. Nos études précédentes ont démontré que le β-Ele sert d’inhibiteur sélectif de la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR et produit un effet synergique avec le cisplatine en ciblant le métabolisme tumoral. Il a significativement supprimé la croissance tumorale dans le modèle de xénogreffe de souris NSCLC20. Des études ultérieures démontrent la capacité de β-Ele à atténuer la glycolyse aérobie dans les cellules NSCLC via la modulation de l’axe de signalisation miR-301a-3p/AMPKα, ce qui entraîne des résultats oncostatiques21. Sur la base de nos résultats précédents, nous avons confirmé que LINC00511 atténue la résistance au cisplatine dans le cancer du poumon ; Néanmoins, le mécanisme moléculaire exact d’action reste à élucider.

Compte tenu du rôle central de la glycolyse aérobie dans la reprogrammation métabolique de la tumeur et du rôle essentiel de la LINC00511 dans le développement et la progression de la tumeur, cette étude vise à déterminer si l’β-Ele peut inverser la résistance au cisplatine dans le cancer du poumon en modulant la voie de glycolyse aérobie médiée par le LINC00511.

Des preuves antérieures indiquent que β-Ele peut inverser la résistance au cisplatine et améliorer ses effets antitumoraux en activant les voies apoptotiques22, en régulant la sécrétion d’exosomes23 et en arrêtant le cycle cellulaire24. Cependant, ces mécanismes connus présentent généralement des effets larges et manquent de régulation précise de cibles moléculaires spécifiques, ce qui limite leur traduisibilité clinique. Par conséquent, il est urgent d’explorer de nouvelles stratégies plus ciblées, dotées de mécanismes bien définis et démontrant un fort potentiel d’application clinique pour surmonter la résistance au cisplatine. Contrairement aux recherches antérieures mettant l’accent sur les actions biologiques immédiates de β-Ele, cette étude caractérise l’impact de β-Ele sur le métabolisme de Warburg et la voie de signalisation Wnt/β-caténine dans les cellules A549/DDP par la régulation des voies moléculaires médiées par lncRNA, dans le but d’élucider un nouveau mécanisme sous-jacent à son inversion de la chimiosensibilisation dans le cancer du poumon. Cet article révèle non seulement une nouvelle approche pour l’β-Ele pour inverser la chimiorésistance en ciblant l’ARNlnc, mais fournit également une nouvelle base théorique et des cibles d’intervention potentielles pour la prise en charge clinique du cancer du poumon. Ces résultats, grâce à l’élucidation détaillée d’une cible moléculaire spécifique (LINC00511) et de voies de signalisation clés (Warburg et Wnt/β-caténine), démontrent un potentiel translationnel clinique significativement amélioré. Ils devraient fournir une base scientifique solide pour améliorer la sensibilité à la chimiothérapie chez les patients atteints de cancer du poumon et améliorer leur qualité de vie, ainsi que pour faire progresser le développement de stratégies de traitement de précision pour le cancer du poumon.

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Protocole

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1. Préparation du solvant

  1. Préparation d’une solution de milieu pour les cellules A549/DDP : Cultivez des cellules A549/DDP dans le milieu complet F-12K de Ham (voir la table des matériaux pour plus de détails), complétées par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS, voir la table des matériaux pour plus de détails), une solution de pénicilline-streptomycine à 1 % (P/S, voir la table des matériaux pour plus de détails) et 2 μg/mL de cisplatine (DDP, voir la table des matériaux pour plus de détails).
    1. Préparation de la solution complète du milieu : Préparez une solution complète du milieu en ajoutant 50 ml de FBS et 5 ml de P/S à 500 ml de milieu F-12K de Ham, puis mélangez soigneusement.
    2. Préparation d’une solution complète de milieu contenant du cisplatine : Peser 1 mg de poudre de cisplatine (DDP, voir le tableau des matériaux pour plus de détails) et le dissoudre dans 1 mL d’eau doublement distillée (ddH2O) pour préparer la solution mère. Ajouter 200 μL de la solution mère à 100 mL de milieu complet (préparé conformément à l’étape 1.1.1) et bien mélanger pour préparer une solution de travail de milieu complet contenant 2 μg/mL de cisplatine.
      REMARQUE : Étant donné que le cisplatine est une substance cytotoxique, effectuez toutes les procédures dans une hotte ou une enceinte de biosécurité et portez un équipement de protection tel que des gants, des blouses de laboratoire et des lunettes de protection.
  2. Solution d’administration β-Ele : La concentration de médicament utilisée dans cette étude était basée sur les résultats d’expériences antérieures menées par notre équipe de recherche20,21. Dissoudre 1 mg de β-Ele (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) dans 20 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO, voir le tableau des matériaux pour plus de détails) pour préparer la solution mère. Diluer la solution mère à 25 mL à l’aide d’un milieu complet pour obtenir une solution de travail β-Ele de 40 μg/mL.
    REMARQUE : Étant donné que le DMSO peut améliorer l’absorption d’autres substances par la peau, effectuez toutes les étapes de fonctionnement dans une hotte ou une enceinte de biosécurité et portez des équipements de protection tels que des gants, des vêtements de laboratoire et des lunettes de protection.

2. Culture cellulaire 

  1. Utilisez la lignée cellulaire résistante au cisplatine de l’adénocarcinome du poumon humain (A549/DDP, Procell, voir la table des matériaux pour plus de détails) dans cette étude. Confirmer que cette lignée cellulaire a été identifiée par une analyse de répétition en tandem court (STR) et qu’elle a été appariée avec succès à des lignées standard dans l’ATCC et d’autres bases de données.
    1. Pour la méthode d’analyse STR, prélever environ 1 x 106 cellules et extraire l’ADN génomique à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN commercial (voir la table des matériaux pour plus de détails).
    2. Utiliser un système de STR multiplex validé adapté au typage de l’ADN pour amplifier 20 loci STR ainsi que le locus déterminant le sexe. Effectuez une amplification par PCR dans les conditions de cycle thermique suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 2 min, suivie de 29 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 30 s, recuit à 59 °C pendant 45 s et extension à 72 °C pendant 45 s, avec une étape d’extension finale à 72 °C pendant 10 min.
    3. Analysez les produits PCR résultants par électrophorèse capillaire à l’aide d’un analyseur génétique automatisé selon les instructions du fabricant. Ici, le typage allélique a été effectué à l’aide d’un logiciel d’analyse de fragments (voir le tableau des matériaux pour plus de détails), avec un seuil de détection de pic fixé à 150 unités de fluorescence relative (RFU).
      REMARQUE : Le profil STR à 20 locus généré a été comparé aux profils de référence des lignées cellulaires A549/DDP disponibles dans les bases de données publiques. Un taux de correspondance supérieur à 80 % a été considéré comme un indicateur d’homologie. L’absence de pics d’allèles externes a confirmé l’absence de contamination croisée.
  2. Récupérez les cellules de l’azote liquide et placez-les dans un bain-marie à 37 °C pour une décongélation rapide jusqu’à ce que le liquide soit complètement fondu. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 5 ml, ajoutez deux volumes de solution de milieu complet et remettez doucement le mélange en suspension. Après la centrifugation (358 × g, 5 min, température ambiante), jeter soigneusement le surnageant.
    REMARQUE : Lorsque vous utilisez des tubes de cryoconservation cellulaire à partir d’azote liquide, portez des gants antigel et des lunettes de protection ou un masque facial, et ne faites pas face à la bouche du tube.
  3. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu complet à l’aide d’un pipetage doux, puis diluer la suspension à 10 mL en ajoutant 9 mL de milieu complet. Ensemencez les cellules dans des boîtes de culture cellulaire de 100 mm et cultivez-les dans un incubateur (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) à 37 °C et 5 % de CO2. Le rapport de passage des cellules a été maintenu entre 1:2 et 1:3.
    REMARQUE : Le cisplatine est un médicament chimiothérapeutique à base de platine avec cytotoxicité. Dans cette méthode, les cellules A549/DDP sont cultivées avec un milieu contenant du cisplatine. Par conséquent, collectez le milieu de culture contenant du cisplatine dans un baril spécial de déchets liquides et envoyez-le régulièrement à l’entreprise de traitement des déchets dangereux pour une élimination professionnelle.

3. Transfection plasmidique 

  1. Utiliser une construction plasmidique pour la surexpression LINC00511 et un siRNA spécifique au gène ciblant LINC00511 (ID du gène : 400619 ; ID du transcrit : NR_033876.1) pour la transfection cellulaire. Les séquences d’ARNi utilisées sont fournies dans le tableau 1.
Séquences d’ARNi
NomSens 5'-3'Antisens 5'-3'
LINC00511-Homo-1625
CAGCUGUGAACUUCCUUUATT
UAAAGGAAGUUCACAGCUGTT

Tableau 1 : Liste des séquences d’ARNi

  1. Sélectionnez au hasard des cellules A549/DDP qui ont été transmises à la troisième génération après la réanimation, et inoculancez-les uniformément dans des plaques à 6 puits à une densité de 1 x 105 cellules/puits. Chaque puits a été numéroté au hasard, et les puits ont été attribués à des groupes expérimentaux en fonction de ces nombres aléatoires.
  2. Transfectez les cellules à l’aide d’un réactif de transfection (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) lorsque leur densité atteint environ 70 %.
    1. Préparez la solution de transfection de siRNA.
      1. Mélangez 250 μL de milieu essentiel minimum optimisé (Opti-MEM, voir le tableau des matériaux pour plus de détails) avec 5 μL de réactif de transfection, en tourbillonnant doucement 3 à 5 fois pour assurer l’homogénéité, et incubez à température ambiante pendant 5 min.
      2. Diluez 5 μL de siRNA (50 nM) dans 250 μL d’Opti-MEM, en tourbillonnant doucement 3 à 5 fois pour bien mélanger. Combinez le réactif de transfection dilué avec la solution de siRNA et incubez à température ambiante pendant 20 min pour former le complexe de transfection siRNA.
    2. Préparez la solution de transfection plasmidique.
      1. Mélangez 250 μL d’Opti-MEM avec 5 μL de réactif de transfection, agitez doucement 3 à 5 fois pour assurer l’homogénéité et incubez à température ambiante pendant 5 min.
      2. Diluez 2 μg de plasmide dans 250 μL d’Opti-MEM, en tourbillonnant doucement 3 à 5 fois pour assurer un mélange complet. Combinez le réactif de transfection dilué avec la solution plasmidique et incubez à température ambiante pendant 20 min pour préparer la solution de transfection plasmidique.
      3. Ajoutez la solution de transfection de siRNA et la solution de transfection plasmidique dans les plaques à 6 puits, respectivement. Ajouter 1 500 μL de milieu complet dans chaque puits. Mélangez délicatement les plaques cellulaires avant et après l’ajout pour assurer une répartition uniforme. Incuber les plaques à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h après la transfection avant l’analyse.

4. Détection de l’efficacité de la transfection par réaction en chaîne par polymérase quantitative par transcriptase inverse (qRT-PCR)

REMARQUE : Prenez les cellules après la transfection pendant 24 h à l’étape 3.3 pour la détection qRT-PCR selon la procédure suivante. Toutes les expériences ont été réalisées dans trois répétitions biologiques indépendantes (n = 3).

  1. Extraction de l’ARN
    1. Utilisez un kit d’extraction d’ARN ultra-pur (voir la table des matériaux pour plus de détails). Jetez le milieu dans la plaque à 6 puits selon les instructions du kit et lavez les cellules avec du PBS. Par la suite, ajoutez 500 μL de solution de réactif de lyse à base de phénol-guanidine dans chaque puits, soufflez doucement les cellules avec la pointe du pistolet pour les suspendre complètement et transférez le mélange dans un tube à centrifuger. Laisser agir 5 minutes pour assurer une lyse complète de l’échantillon de cellule.
    2. Ajouter 100 μL de réactif de lyse isothiocyanate de phénol-guanidine, agiter brusquement pendant 15 s et laisser reposer 2 min à température ambiante. Enfin, aspirez soigneusement la phase aqueuse supérieure, transférez-la dans la colonne d’adsorption et centrifugez-la à 13 400 x g pendant 10 min à 4 °C.
    3. Lier l’ARN à la membrane de gel de silice. Lavez-le avec le tampon RW1 et le tampon RW2 pour éliminer les protéines. Par la suite, ajoutez de la DNase I pour digérer l’ADN résiduel et effectuez un lavage secondaire avec le tampon RW2 pour assurer l’élimination complète des impuretés. Enfin, prélever des échantillons d’ARN en éluant l’ARN avec de l’eau exempte de RNase et en centrifugant à 13 400 x g pendant 1 min.
  2. Mesurez la concentration d’ARN.
    1. Placez chaque 1,5 μL de solution d’ARN de l’échantillon dans un détecteur d’acide micronucléique (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) et lisez les valeurs A260/A280.
      REMARQUE : Si les valeurs mesurées de A260/A280 se situent dans la plage de 1,8 à 2,0 et que la concentration d’ARN est comprise entre 20 ng/μL et 200 ng/μL, cela indique que la qualité de l’ARN est acceptable et peut être utilisée pour des expériences ultérieures.
    2. Sur la base des mesures, diluer la solution d’ARN avec de l’eau de pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) pour assurer des concentrations d’ARN cohérentes pour tous les échantillons, en utilisant la concentration minimale d’ARN mesurée comme référence, suivie d’expériences de PCR.
  3. Transcription inverse de l’ARN
    1. Utilisez l’ARN total extrait comme matrice et synthétisez l’ADNc selon les instructions du kit de transcription inverse (voir la table des matériaux pour plus de détails). Préparez le système de réaction selon les exigences du kit.
    2. Ajoutez la solution d’ARN extraite et le système réactionnel dans un tube à huit rangées, et placez deux puits de réplication dans chaque groupe. Initier la réaction dans des conditions séquentielles : 15 min d’incubation à 37 °C, 5 s de dénaturation thermique à 85 °C, 5 min de refroidissement à 4 °C.
  4. Réaction PCR
    1. Effectuez une amplification PCR sur un système de PCR quantitative par fluorescence en temps réel (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) à l’aide du mélange maître de PCR prémélangé basé sur SYBR Green (voir le tableau des matériaux pour plus de détails). Utilisez GADPH comme gène de référence, avec les séquences d’amorces énumérées dans le tableau 2, et préparez le mélange réactionnel comme suit : ajoutez séquentiellement 0,4 μL de l’amorce correspondante, 2 μL de matrice d’ADNc et le mélange réactionnel dans un tube à bandelettes à huit puits pour obtenir le volume de réaction final.
    2. Amplification PCR : 95 °C 30 s (1 cycle), 95 °C 5 s (40 cycles), 60 °C 20 s (40 cycles). Calculer les niveaux d’expression relatifs des gènes cibles à l’aide de la méthode 2 -ΔΔCt 25. Répétez indépendamment toutes les expériences trois fois pour garantir la fiabilité des données.
      REMARQUE : Les déchets chimiques générés au cours des procédures expérimentales doivent être collectés dans des conteneurs de déchets dangereux désignés et éliminés par des services de gestion des déchets dangereux certifiés conformément aux politiques de l’établissement.
Séquences d’amorçage
AmorceSéquence(5'-3')
humain-LINC00511-FTTTCCCAGCACAGCTCAATC
humain-LINC00511-RTCCCTTCTCCCTCGGTCA
GAPDH-FAATCCCATCACCATCTTCCA
GAPDH-RAAATGAGCCCCAGCCTTCT

Tableau 2 : Séquences d’amorces pour les tests PCR

5. Détection EdU

  1. Évaluez l’effet de l’expression modifiée de LINC00511 sur la prolifération des cellules A549/DDP à l’aide d’un kit de test EdU (voir le tableau des matériaux pour plus de détails).
    1. Sélectionnez au hasard les cellules A549/DDP qui ont été transmises à la troisième génération après la réanimation, et inocunez-les uniformément dans des plaques de 24 puits à une densité de 2 x 104 cellules/puits.
      REMARQUE : Ici, toutes les expériences ont été réalisées dans trois réplicats biologiques indépendants (n = 3).
    2. Numérotez chaque puits de manière aléatoire et attribuez-le à l’un des quatre groupes expérimentaux en fonction de ces nombres aléatoires : groupe témoin, groupe β-Ele, groupe β-Ele + LINC00511 groupe de surexpression (β-Ele + OV-LINC00511) et groupe β-Ele + LINC00511 knockdown (β-Ele + si-LINC00511).
  2. Lorsque la densité cellulaire atteint environ 70 %, effectuez la transfection plasmidique et le traitement d’interférence conformément à l’étape 3.3. Après 24 h de transfection, jeter le milieu d’origine et ajouter 1 mL de solution de milieu contenant du β-Ele (40 μg/mL) dans chaque puits du groupe de traitement médicamenteux.
  3. Incuber les cellules avec EdU pour le marquage après les avoir traitées avec 40 μg/mL de β-Ele pendant 24 h. Fixez ensuite les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 10 min et perméabilisez-les avec 0,5 % de Triton X-100.
  4. Ajouter la solution de réaction click (préparée en dissolvant un flacon du réactif Click Additive fourni par le kit dans 1,3 mL d’eau déminéralisée avec un mélange minutieux) dans l’obscurité et maintenir la réaction dans l’obscurité pendant 30 min. Laver les cellules avec du PBS une fois la réaction terminée, suivie d’une coloration Hoechst pendant 5 min. Enfin, observez les résultats à l’aide de la microscopie à fluorescence (Figure 1 et Figure 2).
    REMARQUE : Le DMSO est très perméable et un liquide inflammable. Dans ce schéma, la solution d’administration β-Ele contient DMSO. Par conséquent, collectez la solution d’administration de β-Ele dans un baril spécial de déchets liquides après utilisation et remettez-la régulièrement à l’entreprise de traitement des déchets dangereux pour une élimination professionnelle.

6. Détection de la teneur en glucose 

REMARQUE : Toutes les expériences ont été réalisées dans trois répétitions biologiques indépendantes (n = 3).

  1. Sélectionnez au hasard des cellules A549/DDP qui ont été transmises à la troisième génération après la réanimation, et inoculancez-les uniformément dans des plaques à 6 puits à une densité de 1 x 105 cellules/puits. Numérotez chaque puits au hasard et attribuez-les à des groupes expérimentaux en fonction de ces nombres aléatoires.
  2. Lorsque la densité cellulaire atteint environ 70 %, procédez à la transfection plasmidique et à l’interférence comme décrit à l’étape 3.3. Après 24 h de transfection, traiter les cellules des groupes traités avec 40 μg/mL de β-Ele.
  3. Après 24 h de traitement médicamenteux, prélever le milieu de culture supérieur des cellules et le centrifuger à 1000 × g pendant 5 min. Récupérez le surnageant. Selon les instructions du kit de test de glucose (voir le tableau des matériaux pour plus de détails), préparez la solution réactionnelle et mélangez-la soigneusement avec le surnageant.
  4. Placez les échantillons dans des plaques de 96 puits avec cinq puits répétés par groupe. Secouez doucement les plaques et laissez-les incuber à 37 °C pendant 10 min. Mesurez l’absorbance de chaque puits à l’aide d’un lecteur de microplaques à une longueur d’onde de 505 nm et calculez la teneur en glucose à l’aide de la formule fournie dans le kit de test :
    figure-protocol-1
    Ici, Cstandard = 5,55 mmol/L, N = facteur de dilution.
    REMARQUE : Les déchets chimiques générés au cours des procédures expérimentales doivent être collectés dans des conteneurs de déchets dangereux désignés et éliminés par des services de gestion des déchets dangereux certifiés conformément aux politiques de l’établissement.

7. Détection de la teneur en acide lactique 

REMARQUE : Toutes les expériences ont été réalisées dans trois répétitions biologiques indépendantes (n = 3).

  1. Sélectionnez au hasard les cellules A549/DDP qui sont passées à la troisième génération après la réanimation, et inocunez-les uniformément dans des plaques à 6 puits (1 × 10 à5 cellules/puits). Numérotez chaque puits au hasard et attribuez-les à des groupes expérimentaux en fonction de ces nombres aléatoires. Lorsque la densité cellulaire atteint environ 70 %, procédez à la transfection plasmidique et à l’interférence comme décrit à l’étape 3.3. 24 h après la transfection, traiter les cellules des groupes traités avec 40 μg/mL de β-Ele.
  2. Après 24 h de traitement médicamenteux, prélever le milieu de culture supérieur des cellules et le centrifuger à 1000 x g pendant 5 min. Récupérez le surnageant. Selon les instructions du kit de test d’acide lactique (voir le tableau des matériaux pour plus de détails), préparez la solution réactionnelle et mélangez-la soigneusement avec le surnageant.
  3. Ajouter un total de 250 μL d’échantillon dans chaque puits d’une plaque de 96 puits, en réglant cinq puits de répétition pour chaque groupe. Secouez doucement la plaque et laissez-la incuber à 37 °C pendant 10 min. Mesurez l’absorbance de chaque puits à une longueur d’onde de 530 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques (voir la Table des matériaux pour plus de détails) et calculez la teneur en lactate à l’aide de la formule fournie dans le kit de test :
    figure-protocol-2
    Ici, Cstandard = 3 mmol/L, N = facteur de dilution.
    REMARQUE : Les déchets chimiques générés au cours des procédures expérimentales doivent être collectés dans des conteneurs de déchets dangereux désignés et éliminés par des services de gestion des déchets dangereux certifiés conformément aux politiques de l’établissement.

8. Séquençage de l’ARN en vrac

  1. Établir un exemple de base de données
    1. Sélectionnez les cellules A549/DDP pour l’expérience et divisez-les dans les groupes suivants : groupe témoin, groupe DDP, groupe β-Ele (40 μg/mL) + groupe DDP (48 μM), β-Ele+ DDP + groupe OV-LINC00511 et groupe β-Ele + DDP + groupe si-LINC00511. Incluez 3 échantillons dans chaque groupe.
    2. Extraire l’ARN total de chaque groupe de cellules. Utilisez un kit d’isolement d’ARNm à base de billes magnétiques (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) pour enrichir l’ARNm eucaryote, dans lequel les billes enrobées d’oligo(dT) se lient sélectivement aux queues poly(A) de l’ARNm via l’appariement des bases A-T. Ajouter un tampon de fragmentation (1 μL/μg d’ARN, voir la Table des matériaux pour plus de détails) et incuber à 94 °C pendant 7 min pour fragmenter l’ARNm en segments courts.
    3. Procédez à la synthèse de l’ADNc du premier brin à l’aide d’amorces hexamères aléatoires conformément aux instructions du fabricant. Pour la synthèse de l’ADNc sur le second brin, ajoutez des quantités appropriées de tampon de réaction, de RNase H et d’ADN polymérase I pour terminer le processus.
    4. Effectuer la réparation de l’extrémité et le suivi A sur l’ADNc double brin par incubation à 25 °C pendant 30 min (réparation finale), immédiatement suivi de 72 °C pendant 30 min (détail A). Ligate des adaptateurs de séquençage aux fragments réparés.
    5. Purifiez et sélectionnez la taille des produits ligaturés à l’aide de billes de silice magnétique modifiées aux carboxyles (voir le tableau des matériaux pour plus de détails). Enfin, construire la banque de séquençage par amplification PCR.
    6. Après la préparation de l’échantillon, analysez la bibliothèque de séquençage sur la plateforme DNBSEQ-T7 (voir la table des matériaux pour plus de détails). Chargez l’échantillon sur une puce de microréseau Patterned Array pour le séquençage.
      REMARQUE : L’instrument a recueilli, lu et identifié des signaux optiques à l’aide d’un système d’imagerie à haute résolution pour déterminer les informations de séquence de chaque base. Par la suite, effectuez des cycles de séquençage supplémentaires pour obtenir la séquence des bases suivantes. Après plusieurs cycles, les données de séquençage brutes ont été générées.
  2. Analyse bio-informatique
    1. Séquencez les échantillons sur la machine pour obtenir les données brutes, également appelées données hors machine. De plus, traitez les données de séquençage à l’aide de fastp (v 0.21.0). Supprimez les lectures contenant des séquences d’adaptateur 3' et éliminez les lectures de mauvaise qualité avec un score de qualité moyen inférieur à Q20 dans le cadre des critères de filtrage primaires. Effectuer toutes les analyses en aval sur la base des données nettoyées et de haute qualité.
      REMARQUE : Effectuez le filtrage initial des données de séquençage à l’aide de fastp. Reportez-vous à la documentation officielle des ensembles de données transcriptomiques (https://github.com/OpenGene/fastp#rna-seq-processing) pour les paramètres spécifiques de la ligne de commande.
    2. Utilisez FastQC (v 0.12.0) pour évaluer la qualité des données de séquençage nettoyées. Les exigences de qualité sont les suivantes : au moins 90 % des bases doivent avoir un score de qualité supérieur à Q20, et le pourcentage de séquences d’adaptateurs restantes ne doit pas dépasser 1 %. Les données qui répondent à ces critères sont considérées comme qualifiées et peuvent être utilisées pour l’analyse en aval.
      REMARQUE : Évaluez la qualité des données de séquençage nettoyées à l’aide de FastQC, en suivant les directives officielles (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/).
  3. Analyse de l’expression génique
    1. Utilisez le logiciel DESeq2 pour effectuer une analyse d’expression différentielle entre les deux groupes de comparaison.
      1. Tout d’abord, entrez les données dans le logiciel pour construire un DataSet DESeq. Ensuite, filtrez les gènes dont le nombre total est inférieur à 10 sur tous les échantillons.
      2. Enfin, effectuez l’analyse différentielle des gènes et extrayez les résultats. Les conditions de dépistage des gènes exprimés de manière différentielle sont les suivantes : le changement de pli d’expression |log2FoldChange| > 1, et la signification padj ≤ 0,05.
        REMARQUE : Pour les étapes de fonctionnement détaillées du logiciel DESeq2, veuillez vous référer aux étapes détaillées sur le site officiel : https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html.

9. Détection des changements de niveau d’expression des protéines par Western blot (WB) 

REMARQUE : Toutes les expériences ont été réalisées dans trois répétitions biologiques indépendantes (n = 3).

  1. Effectuer un western blot pour quantifier les niveaux d’expression des protéines cellulaires.
    1. Sélectionnez au hasard des cellules A549/DDP qui ont été transmises à la troisième génération après la réanimation, et inoculancez-les uniformément dans des plaques à 6 puits à une densité de 1 x 105 cellules/puits.
    2. Numérotez chaque puits au hasard et attribuez-le à l’un des six groupes expérimentaux en fonction de ces nombres aléatoires : Contrôle, β-Ele, OV-LINC00511, si-LINC00511, β-Ele + OV-LINC00511 et β-Ele + si-LINC00511.
    3. Lorsque la densité cellulaire atteint environ 70 %, effectuez la transfection plasmidique et l’interférence comme décrit à l’étape 3.3. Après 24 h de transfection, exposer le groupe de traitement à de l’β-Ele (40 μg/mL), tout en fournissant un milieu frais au groupe témoin. Culture des deux groupes pendant 24 heures supplémentaires.
    4. Par la suite, prélever les granules cellulaires par centrifugation à 1675 × g pendant 5 min. Lyser chaque groupe de cellules avec 500 μL de tampon de lyse RIPA contenant 1 mM de PMSF sur de la glace pendant 30 min (voir le tableau des matériaux pour plus de détails).
  2. Centrifugez les lysats cellulaires à 13 400 × g pendant 10 min à 4 °C et recueillez le surnageant. Mesurez les concentrations de protéines à l’aide du kit de dosage de concentration en protéines BCA (voir la table des matériaux pour plus de détails). Séparez des quantités égales d’échantillons de protéines par 10 % de SDS-PAGE et transférez-les sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (PVDF) par électrophorèse.
  3. Immerger les membranes dans une solution bloquante (lait écrémé à 5 %/solution saline tamponnée au Tris avec 0,1 % de Tween-20 (TBST)) pendant 2 h à température ambiante et les incuber pendant la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre GLUT1, PKM2, LDHA, β-caténine, GSK-3β (1:1000) et β-actine (1:2000, voir le tableau des matériaux pour plus de détails).
    1. Le lendemain, lavez les membranes trois fois avec du TBST, 5 min chacune, à température ambiante en secouant doucement.
  4. Le lendemain, incuber les membranes avec des solutions d’anticorps secondaires (IgG anti-lapin de chèvre marquées HRP, 1:2000) et agiter doucement à température ambiante pendant 1 h.
  5. Enfin, ajoutez 0,1 mL/cm2 de solution chromogène ECL disponible dans le commerce pour couvrir entièrement les membranes PVDF. Incuber 1 min à température ambiante avant l’exposition. Visualisez et analysez les bandes à l’aide d’un système de chimiluminescence amélioré (voir la Table des matériaux pour plus de détails). Reportez-vous à la figure 4C et à la figure 5B.
    REMARQUE : Les déchets chimiques générés au cours des procédures expérimentales doivent être collectés dans des conteneurs de déchets dangereux désignés et éliminés par des services de gestion des déchets dangereux certifiés conformément aux politiques de l’établissement.

10. Analyse statistique 

REMARQUE : Toutes les expériences ont été réalisées dans trois répétitions biologiques indépendantes (n = 3).

  1. Organisez les données expérimentales par groupe et saisissez-les dans le logiciel GraphPad Prism (version 8.0.2 ; voir la table des matériaux pour plus de détails). Effectuer la visualisation des données et l’analyse statistique de la signification conformément aux directives du logiciel. Les données de mesure ont été exprimées en moyenne ± en écart-type. Les différences statistiques entre les groupes ont été évaluées à l’aide de l’ANOVA à un facteur avec calcul de l’ampleur de l’effet η² (êta-carré), suivie du test de comparaisons multiples de Tukey26. Considérez **P < 0,01 comme statistiquement significatif.

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Résultats

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β-Ele supprime significativement la prolifération des cellules A549/DDP

Dans cette expérience, les concentrations d’administration de β-Ele et de DDP ont été déterminées sur la base des résultats de nos études précédentes20,21. Les cellules A549/DDP ont été traitées avec du β-Ele, seul ou associé au DDP, afin de disséquer son impact sur la chimiorésistan...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude s’est concentrée sur le problème clinique critique de la résistance au cisplatine dans le cancer du poumon. Le cancer du poumon, responsable du plus grand nombre de décès par cancer dans le monde, continue d’avoir un taux de survie à cinq ans inférieur à 20 %29,30. Le cisplatine, en tant que pierre angulaire des médicaments de chimiothérapie à base de platine, est un agent anticancéreux efficace à large spectre qui in...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le financement de cette étude a été fourni par la Fondation provinciale des sciences naturelles de Jilin dans le cadre de l’attribution n°. YDZJ202401058ZYTS.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cellules A549/DDPProcellRéférence : CL-0519Lien URL :https ://www.procell.com.cn/p/a549-ddp--cl-0519
Un établi d’une propreté exceptionnelleSuzhou Antai AirtechSW-CJ-2FDLien URL :http ://www.sz-antai.com
Kit de dosage de la concentration en protéines BCASolarbioRéf. PC0020Liens : https ://www.solarbio.com
Centrifugeuse de paillasseThermoPico17Liens : https ://www.thermofisher.com
Chambre de culture cellulaireThermo3111Liens : https ://www.thermofisher.com
Boîte de culture cellulaireBIOFILTCD000100Lien : http ://www.biofil.com.cn
Analyseur de chimiluminescenceQinxiang Instruments  ;4300Liens URL : https ://www.clinx.cn/about_us
CisplatineAladinC295225-250 mgLiens URL : https ://www.aladdin-e.com/
Instrument de séquençage de gènes DNBSEQ-T7MGI Tech CO., LtdT7Liens : https ://www.mgitech.cn/
EasyPure  ; Kit d’ADN micro génomiqueTransGen BiotechRéférence EE181-01Liens URL : https ://www.transgen.com/
Solution chromogène ECLSolarbioPE0010Liens : https ://www.solarbio.com
Kit de détection EDUBeyotimeRéf. C0071SLiens URL : https ://www.beyotime.com
Instrument marqué aux enzymesÉquipement de décraquageHBS-1096ALiens URL : https ://www.detiebio.cn/
Sérum fœtal bovin FBS)CLARKFB15015Liens URL : https ://zn.clarkbio.com/
Tampon Frag/Prime  ;Oui11277ESLiens URL : https ://www.yeasen.com/products/detail/2151
GeneMapper  ; Logiciels  ; 6ThermoVersion 6Logiciel d’analyse de fragments. Liens : https ://www.thermofisher.cn/  ;   ;
Plateforme GenReaderBeijing Yuewei Gene Technology Co., Ltd.https://yyigou.com/product/detail/0000037250.htmlAnalyseur génétique automatisé utilisé pour l’électrophorèse capillaire
Kit de test de glucoseBiographie de JianchengRéf. A154-1-1Lien URL :http ://www.njjcbio.com
GLUT1 Anticorps polyclonalGroupe ProteintechRéférence 21829-1-APLiens URL : https ://www.ptglab.com
Prisme GraphPadLogiciel GraphPadÉdition 8.0.2Liens URL : https ://www.graphpad.com
GSK-3&beta ; AnticorpsAffinitéAF5016Liens URL : https ://www.affbiotech.com
Le F-12K de HamProcellPM150910Liens : https ://www.procell.com.cn/
Perles de sélection d’ADN Hieff NGSOui12601ESLiens URL : https ://www.yeasen.com/products/detail/939
Kit maître d’isolement de l’ARNm HieffNGSOui12603ZHLiens : https ://www.yeasen.com/products/detail/1119
IgG anti-lapin de chèvre labellisée HRPServicebioGB23303Lien URL : https ://www.servicebio.cn
Kit de test de lactateBiographie de JianchengA019-2-1Lien URL :http ://www.njjcbio.com
Anticorps polyclonal spécifique de la LDHAGroupe Proteintech19987-1-APLiens URL : https ://www.ptglab.com
Cycleur léger 96RocheLC96Liens URL : https ://lifescience.roche.com
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019Liens URL : https ://www.thermofisher.com/invitrogen
Opti-MEMGibco31985-070Liens : https ://www.thermofisher.com/gibco
Pénicilline-streptomycine (P/S)BiosharpRéf. BL505ALiens : https ://www.biosharp.cn/
Anticorps polyclonal spécifique de PKM2Groupe ProteintechRéférence 15822-1-APLiens URL : https ://www.ptglab.com
PMSF  ;BeyotimeST506Liens URL : https ://www.beyotime.com
Kit de réactifs PrimeScript RT (Perfect Real Time)TakaraRR037ALiens URL : https ://www.takarabio.com
Lysat RIPABeyotimeP0013BLiens URL : https ://www.beyotime.com
Plateforme de séquençageBGIDNBSEQ-T7Liens URL : https ://www.bgi.com/global
Prémix vert TB Ex TaqTakaraRR420ALiens URL : https ://www.takarabio.com
Testeur d’acide nucléique à l’état de tracesInstrument d’AoshengNano-100Lien URL :http ://www.hzaosheng.com
TRIzon PaICanvax BiotechCW0597SLiens URL : https ://www.canvaxbiotech.com
TrypsineBiosharpRéf. BL501ALiens : https ://www.biosharp.cn/
Kit d’ARN ultra-pur (DNase I)Canvax BiotechCW0597SLiens URL : https ://www.canvaxbiotech.com
Anticorps anti-actine bêtaGroupe ProteintechRéférence 60008-1-IGLiens URL : https ://www.ptglab.com
Anticorps &bêta ;-caténine  ;AffinitéDF6794Liens URL : https ://www.affbiotech.com
&beta ;-ElemeneSigmaRéférence 63965-25MGLiens : https ://www.sigmaaldrich.com

Références

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