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Article de méthode

Perfectionnement de OnePot PURE et production brute de ribosomes pour une synthèse acellulaire reproductible des protéines

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DOI :

10.3791/68826

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22 août 2025

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1Centre for Engineering Biology, Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Biophoundry Inc.

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole mis à jour pour la production du système OnePot « Protein synthesis Using Recombinant Elements » (PURE) et des ribosomes bruts pour la synthèse des protéines acellulaires, en mettant l’accent sur le contrôle de la croissance cellulaire afin de minimiser les variations d’un lot à l’autre.

Résumé

Des progrès récents ont permis de produire le système acellulaire de synthèse de protéines à l’aide d’éléments recombinants (PURE) dans des laboratoires individuels, de manière économique et avec une charge de travail réduite. Cependant, la préparation des 36 composants protéiques et du ribosome, qui composent PURE, reste une entreprise complexe, avec beaucoup de possibilités de variation et d’erreur. Nous présentons une procédure détaillée et actualisée de fabrication de PURE basée sur le protocole OnePot récemment publié, qui implique la régulation d’un certain nombre d’étapes clés, en particulier, l’inoculation de cultures à l’aide de stocks de glycérol normalisés en densité optique (OD), la surveillance minutieuse de la croissance cellulaire et le contrôle des concentrations finales de glycérol. En utilisant cette approche, nous rapportons des préparations reproductibles de PURE à partir de plusieurs réplications biologiques et utilisateurs. Ce protocole sert de référence et de point de départ à d’autres laboratoires pour fabriquer et dépanner leurs propres systèmes PURE, augmentant ainsi la démocratisation des nombreuses applications que PURE permet, telles que la construction ascendante de systèmes biomoléculaires et le développement de cellules synthétiques.

Introduction

La synthèse acellulaire des protéines (CFPS) est devenue une technologie pour diverses applications, notamment la biofabrication, la biodétection et le diagnostic, le prototypage de parties et de voies génétiques et métaboliques, l’ingénierie rapide des protéines et l’éducation 1,2. Les systèmes CFPS utilisant des composants purifiés, développés à l’origine sous le nom de système PURE (Protein synthesis Using Recombinant Elements)system 3, offrent un certain nombre d’avantages par rapport à leurs alternatives à base de lysats. Les systèmes PURE ont une composition définie, composée de 36 facteurs protéiques, du ribosome E. coli 70S et d’un mélange défini de substrats chimiques, y compris des nucléosides triphosphates (NTP), des acides aminés et des ARNt, qui peuvent être adaptés à volonté à l’application requise. Ils sont donc très adaptés à des études telles que l’incorporation non canonique d’acides aminés, la modélisation mécaniste et la construction ascendante de systèmes biomoléculaires et de cellules synthétiques1. Bien que PURE soit disponible auprès de fournisseurs commerciaux, son coût (0,34 $ à 1,63 $ par réaction de 1 μL) est prohibitif pour l’expérimentation à grande échelle ; et la stratégie alternative de production de PURE en interne a jusqu’à présent été entravée par des protocoles à forte intensité de main-d’œuvre impliquant la purification parallèle de 36 protéines et ribosomes4, qui sont difficiles à réaliser de manière robuste et reproductible, en particulier pour les utilisateurs inexpérimentés.

Les développements récents ont aidé à la production artisanale de PURE. Par exemple, Wang et al. ont conçu des souches d’E. coli pour inclure des marqueurs hexa-histidine intégrés génomiquement sur la machinerie de traduction, facilitant ainsi une purification en une seule étape5. Les gènes codant pour toutes les protéines PURE ont été assemblés en un petit nombre de plasmides, qui ont également été utilisés pour réduire le travail de purification6. Villareal et al. ont conçu d’élégants consortiums de souches PURE, qui équilibrent l’expression afin de produire des protéines au bon rapport, tout en permettant une purification en une seule étape7.

Le système innovant OnePot PURE développé par Lavickova et al. est très prometteur en termes de facilité d’utilisation 8,9. Dans ce système, les souches originales de PURE sont co-cultivées et purifiées via une seule étape de chromatographie. Bien qu’il ne soit pas possible de définir avec précision la composition du système PURE résultant, les auteurs ont démontré que plusieurs lots du système sont largement reproductibles et qu’un niveau de contrôle approximatif peut être atteint en faisant varier le volume d’inoculation de chaque souche. Le compromis entre un contrôle précis de la composition et la facilité de production sera acceptable pour de nombreux utilisateurs, étant donné que le rendement global de synthèse des protéines du système OnePot est similaire à celui obtenu dans le commerce. Cependant, bien qu’il existe des protocoles détaillés pour le système OnePot, il a été difficile de reproduire complètement les résultats de Lavickova et al. dans d’autres laboratoires. Par exemple, une instabilité du vecteur d’expression, des souches à croissance lente et une protéolyse ont été observées10.

Dans ce travail, nous présentons un protocole OnePot PURE détaillé et affiné, qui contrôle la croissance cellulaire en utilisant des stocks de glycérol standardisés et des ajustements de milieux, donne des conseils sur le suivi de la croissance et de la récolte OD, et normalise la quantité de glycérol dans la purification finale. Deuxièmement, nous présentons une procédure optimisée de purification des ribosomes bruts en utilisant uniquement l’ultracentrifugation différentielle, qui équilibre le compromis entre l’activité des ribosomes et le coût et la complexité des méthodes plus sophistiquées.

Bien que cela introduise plus d’étapes dans le protocole OnePot, ils offrent à l’utilisateur une plus grande possibilité de dépanner la procédure de manière plus approfondie si nécessaire, ainsi que de la modifier selon ses besoins. Nous démontrons la reproductibilité du processus en montrant plusieurs réplicats biologiques effectués par plusieurs utilisateurs dans le même laboratoire. Nous constatons que le contrôle des composants PURE et de la préparation des ribosomes est crucial pour garantir des performances CFPS élevées du système.

La préparation de PURE et des ribosomes prend chacune 4 ou 5 jours, respectivement, et peut être effectuée soit séquentiellement par un utilisateur, soit simultanément par deux utilisateurs. La préparation PURE implique 4 x 500 mL de culture liquide, chacun produisant ~2 g de pastille cellulaire et ~1 mL de protéines PURE à une concentration de ~15 mg/mL. La préparation des ribosomes implique 4 × 500 mL = 2 L de culture liquide, ce qui permet d’obtenir un total de ~3 g de pastille cellulaire et de produire ~1 mL de ribosomes bruts à une concentration de ~17 μM. Le protocole actuel produit des systèmes PURE avec des rendements de synthèse allant jusqu’à ~100 μg/mL de GFP ou ~130 μg/mL de mCherry sur 2 h de réaction par lots11, ce qui se compare favorablement au OnePot d’origine ainsi qu’aux systèmes commerciaux (~140-160 μg/mL)8,12. Il s’agit donc d’un point de départ approprié pour une optimisation plus poussée par la supplémentation ou la modulation de composants sensibles tels que les sels, les agents d’encombrement et les facteurs protéiques individuels.

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Protocole

Le protocole est divisé en trois parties. Par souci de concision et de clarté, nous mettons l’accent sur les changements importants spécifiques à ce travail et, par conséquent, nous référençons des détails qui sont les mêmes que ceux qui existent dans d’autres publications.

Les travaux préliminaires ne doivent être effectués qu’une seule fois. Les quatre sections consistent à préparer des stocks de glycérol et des plaques de démarrage pour les protéines PURE, ainsi qu’à vérifier et à mesurer les temps d’expression des souches. L’utilisation de plaques de départ élimine la variabilité associée à l’inoculation directe à partir de stocks de glycérol grattés. Il est crucial de s’assurer que ce travail est effectué en profondeur avant de passer à l’étape de fabrication. En raison du grand nombre de stocks de glycérol différents impliqués dans la préparation de PURE, il est essentiel de vérifier l’intégrité du plasmide et l’expression de chaque souche avant d’essayer de produire le système.

Un schéma du flux de travail est présenté à la figure 1 et un calendrier recommandé au tableau 1. Les matériaux requis et les étapes d’utilisation sont indiqués dans le tableau des matériaux, et le contour des zones tampons et des milieux requis à chaque étape est résumé dans la figure supplémentaire S1.

1. Travaux préliminaires

  1. Génération de stocks de glycérol
    REMARQUE : Tous les plasmides sont disponibles auprès d’Addgene.
    1. Générer des stocks de glycérol à 25 % p/v de toutes les souches énumérées au tableau 2, conformément aux procédures normalisées9, et les stocker dans des flacons cryogéniques à -80 °C.
  2. Préparation des plaques de démarrage PURE (pendant la nuit)
    1. Préparez 20 mL de milieu LB complété par 100 μg/mL d’ampicilline (LB+AMP).
    2. Étiquetez 36x tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 mL de #1-#36.
    3. Ajoutez 500 μL de LB+AMP dans chaque tube. Inoculez chaque tube avec la souche correspondante à l’aide d’une pointe de pipette pour gratter une petite quantité du stock de glycérol d’origine. Assurez-vous que les stocks de glycérol ne dégèlent pas. Vortex pour bien mélanger.
    4. Aliquote 300 μL de chaque tube inoculé dans le puits correspondant d’une plaque stérile de 1 mL 96 à puits profonds, selon la disposition illustrée à la figure 2.
      REMARQUE : Dans toutes les étapes ultérieures impliquant des plaques, maintenez la même disposition de plaque partout.
    5. Incuber la plaque pendant la nuit dans un agitateur à 37 °C, 1 000 tr/min pendant 15 h.
    6. Le lendemain, préparer 25 mL de milieu LB complété par 100 μg/mL d’ampicilline (LB+AMP) et 15 mL de glycérol stérile à 50 % (v/v).
    7. Transférez 30 μL de chaque culture de la plaque à puits profonds dans le fond d’une plaque optique à 96 puits, à l’aide d’une pipette multicanaux. Ajouter 270 μL de milieu LB+AMP dans chaque puits contenant des cultures, pour obtenir une dilution de 10x de chaque culture.
    8. Mesurez la DO600 de chaque culture à l’aide d’un lecteur de plaques. Calculer le volume de chaque culture nécessaire pour inoculer 650 μL de LB+AMP frais à une DO de départde 600 de 0,2. Une feuille de calcul pour faciliter les calculs est fournie dans le tableau supplémentaire S1.
    9. Préparez trois nouvelles plaques stériles de 1 mL 96. Dans une boîte, ajouter 650 μL de LB+AMP à 36 puits, et inoculer chaque puits avec le volume calculé de culture pendant la nuit pour obtenir une DOde 600 = 0,2.
    10. Transvasez 300 μL de culture inoculée dans chacune des deux autres plaques. Une plaque sera la culture, et l’autre sera utilisée pour surveiller la DO. Incuber les deux plaques dans un agitateur à plaques à 37 °C, 1000 tr/min, jusqu’à ce que les cultures atteignentOD 600 ~ 1 (~1,5-2 h). Surveiller la DO à 1 h, puis de nouveau au besoin, en prélevant des échantillons de 30 μL de la deuxième plaque et en ajoutant à 270 μL de LB+AMP pour une dilution de 10x.
    11. Lorsque les puits individuels atteignentOD 600 ~ 1, retirez-les de l’agitateur. Ajouter un volume égal de glycérol stérile à 50 % (v/v) à chaque culture pour obtenir une concentration finale de600 DO = 0,5 dans du glycérol à 25 %. Mélangez bien et conservez ces tubes sur de la glace. Il s’agit des stocks de travail principaux.
    12. Aliquote un maximum de 40 μL de chaque stock maître dans des plaques de PCR à 96 puits, en conservant le modèle de puits d’origine. Répartir dans autant de plaques que possible en fonction de la capacité de stockage. Scellez avec des joints à plaque d’aluminium et stockez ces plaques de départ PURE à -80 °C.
      REMARQUE : Ces plaques de départ doivent être décongelées au maximum 3x. Remplacer par des plaques neuves si vous dépassez cette limite pour maintenir l’intégrité de la déformation et la reproductibilité.
  3. Détermination des temps de croissance de la culture de démarrage (pendant la nuit)
    1. Décongelez une plaque de départ PURE sur de la glace.
    2. Ajouter 50 μL d’ampicilline à 100 mg/mL à 50 mL de milieu stérile LB dans un tube conique stérile (LB+AMP).
    3. Étiquetez 36 tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 ml de #1 à #36 et ajoutez 1 ml de LB+AMP dans chaque tube.
    4. Ajouter 10 μL de chacun des stocks de glycérol dans le tube étiqueté correspondant et bien mélanger par vortex.
    5. Ajouter 300 μL de la culture inoculée de chaque tube dans le puits correspondant d’une plaque stérile à puits profond de 1 mL 96. Scellez les plaques avec un joint de plaque respirant et incubez la plaque de culture dans un agitateur à 1000 tr/min, 37 °C. Déterminez et enregistrez le temps qu’il faut aux cultures pour atteindre DO600 ~ 2-3 sans dépasser DO600 = 3. Établissez ce paramètre avant de continuer.
      REMARQUE : Dans notre laboratoire, cela prend 15 h.
  4. Essai d’expression de souches PURE
    1. Préparez 38 mL de milieu LB complété par 100 μg/mL d’ampicilline (LB+AMP), 10 mM de stock IPTG et 1x réactif d’extraction de protéines.
    2. Décongelez une plaque de départ PURE sur de la glace.
    3. Ajouter 1 mL de LB+AMP dans chacun des 36 puits d’une plaque stérile de 2 mL 96 puits profonds. Inoculer chaque puits avec 20 μL de la culture de démarrage correspondante. Incuber la plaque dans un agitateur à plaques à 1000 tr/min, 37 °C, pendant environ 1 h, ou jusqu’à ce que la DO600 = 2 soit atteinte.
    4. Induire l’expression des protéines en ajoutant 10 μL de 10 mM d’IPTG dans chaque puits, pour une concentration finale d’IPTG de 0,1 mM. Poursuivre l’incubation pendant 3 h à 1000 tr/min, 37 °C.
    5. À la fin de la période d’expression de 3 h, transférez 700 μL de chaque culture dans 36 tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 mL. Centrifugeuse à 20 000 × g pendant 10 min à 4 °C. Jetez soigneusement le surnageant.
    6. Remettre chaque pastille en suspension dans 70 μL de 1x réactif d’extraction de protéines. Incuber pendant 30 min à température ambiante sous une légère agitation pour permettre la lyse cellulaire.
    7. Lysat par centrifugation à 20 000 × g pendant 10 min à 4 °C pour granuler la fraction insoluble.
    8. Effectuez une purification à petite échelle de chaque protéine à l’aide de billes magnétiques Ni-NTA conformément aux instructions du fabricant.
    9. Analyser les protéines purifiées à l’aide de SDS-PAGE pour confirmer l’expression de chaque protéine et/ou la contamination croisée entre les souches9.
      REMARQUE : Les souches qui expriment la protéine présenteront des bandes distinctes sur SDS-PAGE correspondant au poids moléculaire attendu de la protéine cible. Si aucune bande n’est détectée, il se peut que la souche n’exprime pas la protéine. Dans de tels cas, isolez et séquencez le plasmide pour confirmer l’identité et l’intégrité de la séquence, et remplacez-le si nécessaire.

2. Purification protéinée OnePot PURE (4 jours)

REMARQUE : Une seule préparation du système PURE nécessite le traitement de 500 ml de culture liquide. Il est conseillé de produire simultanément 4 préparations de 500 ml pour produire quatre lots PURE indépendants en un seul passage. Ces lots peuvent ensuite être quantifiés indépendamment ou combinés le cas échéant. Le protocole de 4 jours peut être raccourci à 3 jours en effectuant l’étape d’incubation de la résine pendant la nuit, mais cela implique un long troisième jour. Les deux options sont détaillées ci-dessous.

  1. Jour 1 : préparation du matériel et croissance des cultures de démarrage
    1. Préparer les solutions mères et les tampons pour la préparation PURE comme décrit dans le tableau supplémentaire S2 et la figure supplémentaire S1.
      REMARQUE : Préparez les supports et les tampons nécessaires immédiatement avant l’exécution de chaque partie du protocole et ne les stockez que pendant le nombre maximum de jours avant l’utilisation comme indiqué.
    2. Décongelez une plaque de départ PURE sur de la glace.
    3. Ajouter 50 μL d’ampicilline à 100 mg/mL à 50 mL de milieu stérile LB dans un tube conique stérile de 50 mL (LB+AMP).
    4. Étiquetez 36 tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 mL de #1 à #36 et ajoutez 1 mL LB+AMP dans chaque tube.
    5. Ajouter 10 μL de chacun des stocks de glycérol dans le tube étiqueté correspondant et bien mélanger par vortex.
      REMARQUE : Pour suivre facilement l’inoculation de chaque souche, après avoir ajouté la souche dans chaque tube, éjectez la pointe de la pipette dans le puits correspondant de la plaque de départ PURE. Répétez ce processus pour toutes les variétés. Une fois terminé, retirez soigneusement les pointes de pipette de la plaque avant de la refermer avec du papier d’aluminium et du ruban adhésif autoclave, et de les stocker à -80°C.
    6. Ajouter 300 μL de la culture inoculée de chaque tube dans le puits correspondant d’une plaque stérile de 1 mL à 96 puits profonds, à l’exception de la souche #25 (EF-Tu). Scellez les plaques avec un joint de plaque respirant. Incuber la plaque de culture dans un agitateur à 1 000 tr/min, 37 °C, pendant 14 h.
    7. Ajouter 1 mL de culture inoculée du tube #25 à 10 mL de LB dans un tube conique de 50 mL pour préparer la culture de démarrage EF-Tu. Incuber le tube dans un incubateur à 260 tr/min, 37 °C pendant 14 h.
      REMARQUE : La souche #25, EF-Tu, est nécessaire à une concentration beaucoup plus élevée que les autres composants et est donc traitée séparément, comme décrit dans le protocole original8.
    8. Placez 2 L de milieu stérile 2x YTP dans une bouteille en verre de 2 L et placez-le dans un incubateur statique à 37 °C pour préchauffer pendant la nuit.
  2. Jour 2 : croissance et granulation
    1. Préparez les réactifs requis :
      1. 2 L de milieux YTP préchauffés stériles (à partir du jour 1)
      2. 2 mL d’ampicilline à 100 mg/mL
      3. 100 mM IPTG, stérile
      4. 100 mL de PBS, stérile, glacé
      5. Média de 10 ml LB
    2. Transférez 30 μL de chaque culture de démarrage de la plaque de démarrage à puits profonds et du tube de démarrage EF-Tu dans le fond d’une plaque optique à 96 puits, à l’aide d’une pipette multicanaux.
    3. Ajouter 270 μL de milieu LB dans chaque puits contenant des cultures, pour obtenir une dilution de 10x de chaque culture.
    4. Mesurez la DO600 de chaque culture à l’aide d’un lecteur de plaques. Toutes les souches doivent être à OD600 = 2-3.
      REMARQUE : Si une culture a envahi au-dessus deDO 600 = 3, diluer àDO 600 = 3 en utilisant 2x YTP+AMP (tableau supplémentaire S1). La dilution des démarreurs envahis par la végétation peut prendre du temps et être source d’erreurs. Il est donc conseillé d’établir le temps d’incubation exact nécessaire pour atteindre la DO600 2-3, comme décrit dans la section 1.3 des travaux préliminaires.
    5. Transvaser 500 mL de milieu préchauffé 2x YTP et 500 μL d’ampicilline à 100 mg/mL dans un flacon stérile à chicanes de 2,5 L (2x YTP+AMP).
    6. Dans un seul tube conique stérile de 15 ml, ajoutez 55 μL de chaque culture de la plaque de culture de démarrage et 1675 μL de la culture EF-Tu. Bien mélanger par vortex.
      REMARQUE : Il s’agit de la culture OnePot qui combine toutes les souches PURE ensemble. C’est à ce stade que des systèmes d’éjection (ΔPURE) peuvent être créés en omettant certaines souches, ou en ajoutant d’autres composants nécessitant une co-épuration.
    7. Ajoutez le contenu de ce tube dans le flacon à chicanes de 2,5 L contenant 500 ml de 2x YTP+AMP. Répétez les étapes 5 à 7 pour obtenir 4x cultures indépendantes.
    8. Incuber les flacons à 260 tr/min, 37 °C, pendant 1,5 à 2 h, jusqu’à ce que la pardo600 = 0,2-0,3 soit de 2 à 0,3.
    9. Une fois que la DO600 = 0,2-0,3 est atteinte, inoculer chaque fiole avec 500 μL de 100 mM d’IPTG, pour une concentration finale d’induction de 0,1 mM d’IPTG.
    10. Incuber les cultures pendant 3 h supplémentaires à 260 tr/min, 37 °C.
    11. Pendant l’incubation, peser et étiqueter quatre tubes coniques stériles de 50 mL.
    12. Prérefroidir les centrifugeuses à 4 °C si nécessaire, puis étiqueter et prérefroidir quatre flacons de centrifugation en copolymère de polypropylène.
    13. Placez quatre bouteilles en verre étiquetées de 500 ml dans un bain d’eau glacée.
    14. À la fin de l’incubation de 3 h, décantez soigneusement chaque culture dans une bouteille en verre sur de la glace pour terminer la croissance.
      REMARQUE : Le transfert des cultures dans des bouteilles refroidies est essentiel pour arrêter rapidement la croissance : placer des flacons chauds directement dans le bain d’eau glacée n’entraînera pas une fin efficace de la croissance. Toutes les étapes subséquentes sont effectuées sur glace, sauf indication contraire.
    15. Ajouter 250 mL de chaque culture dans les flacons de centrifugation correspondants et centrifuger à 3 220 × g, 4 °C, pendant 10 min, tout en gardant les 250 mL restants dans le bain d’eau glacée.
    16. Décantez soigneusement le surnageant et séchez-le sur du papier absorbant.
    17. Ajouter les 250 ml restants de chaque culture dans les flacons de centrifugation correspondants, puis centrifuger à nouveau à 3 220 × g, 4 °C, pendant 10 min.
    18. Décantez soigneusement le surnageant et séchez-le sur du papier absorbant.
    19. Ajoutez 20 ml de PBS stérile et glacé dans chaque flacon de centrifugation et remettez complètement la pastille de cellule en suspension.
    20. Transférez chaque remise en suspension dans les tubes coniques de 50 mL préparés.
    21. Centrifuger les tubes à 2 000 × g, 4 °C, pendant 8 min.
    22. Retirez le surnageant en le décantant soigneusement.
    23. Centrifugez à nouveau les tubes à 2 000 × g, 4 °C, pendant 2 min.
    24. Éliminer le surnageant résiduel par pipetage et maintenir les granules de cellules sur de la glace.
    25. Chaque tube contient maintenant la pastille cellulaire d’une seule culture de 500 ml. Pesez chaque tube, calculez la masse des granules de cellule (généralement, ~2 g) en soustrayant le poids à vide de chaque tube, et notez.
    26. Congelez les granules et conservez-les à -80 °C jusqu’à la lyse.
      REMARQUE : Optionnellement, le protocole peut être complété en 3 jours, en procédant directement à l’étape de lyse à ce stade.
  3. Jour 3 : lyse, purification et dialyse
    1. Préparez les réactifs requis :
      1. Préparez 50 mL de tampon de remise en suspension.
      2. Préparez 0,5 M de PTCE.
    2. Décongeler les granules de cellules sur de la glace.
    3. Aliquote 50 mL de tampon de remise en suspension dans un tube conique de 50 mL et ajouter 100 μL de PTCE 0,5 M. Bien mélanger par vortex.
    4. Remettre en suspension les pastilles de cellules dans le tampon de remise en suspension + TCEP à raison de 2 mL pour 1 g de pastilles de cellules. Tourbillonnez soigneusement pour remettre en suspension.
    5. Répartissez la remise en suspension cellulaire dans des tubes coniques de 50 mL de sorte que chaque tube ait 5 mL de suspension. Étiquetez les tubes au besoin pour garder une trace des 4 cultures indépendantes. Conserver sur de la glace.
    6. Lyse des cellules par sonication à 30 % d’amplitude, 20 secondes de marche, 20 secondes de repos, pendant 10 cycles dans un bain d’eau glacée à l’aide d’une sonde de sonication refroidie (Figure 3A,B).
      REMARQUE : Environ 1000 J d’énergie doivent être transférés dans chaque tube pendant la sonication. Utilisez un support sécurisé pour maintenir le tube en place pendant la sonication afin d’assurer la cohérence du transfert d’énergie.
    7. Répartissez le lysat dans des tubes de microcentrifugation stériles de 2 ml, de sorte que chaque tube contienne 1 ml de lysat. Répétez les étapes 2.3.6 et 2.3.7 pour analyser les quatre cultures. Les étapes suivantes sont réalisées pour 4 lysats en parallèle.
    8. Centrifugeuse à 15 923 × g, 4 °C, pendant 20 min.
    9. Pendant la centrifugation, laver et équilibrer 5 mL de résine de purification des protéines (préparer quatre colonnes pour les quatre lysats) :
      1. Ajouter 2 mL de résine de purification de protéines fraîches dans une colonne de chromatographie à écoulement gravitaire.
      2. Lavez deux fois la colonne avec 30 ml d’eau distillée stérile pour éliminer l’éthanol de stockage.
      3. Compléter 30 mL de tampon de remise en suspension avec 60 μL de PTCE 0,5 M jusqu’à une concentration finale de 1 mM.
      4. Comme la colonne a un volume de 30 ml, versez des tampons directement dans la colonne pour la remplir. En vous assurant que la soupape est fermée, équilibrez la colonne en ajoutant 30 mL de tampon de suspension + TCEP.
      5. Ouvrez la vanne pour permettre à ~25 ml de tampon de s’écouler, avant de fermer la vanne de colonne, en laissant ~5 ml de tampon au-dessus du lit de résine pour éviter le dessèchement. La colonne est maintenant prête à l’emploi.
    10. Après la centrifugation, mélanger tous les surnageants clarifiés sans granulés de chaque culture dans 4 tubes coniques frais de 50 mL sur de la glace.
    11. Remettez la résine en suspension dans les 5 mL restants de tampon de remise en suspension + TCEP dans chaque colonne, et ajoutez du tampon et de la résine dans chacun des tubes coniques contenant le surnageant de lysat.
    12. Fermez et fermez le couvercle avec du Parafilm et incubez dans une rôtissoire à 4 °C pendant 5 h.
      REMARQUE : Si la lyse a été effectuée immédiatement après la croissance, ce lysat peut être incubé avec de la résine pendant la nuit.
    13. Préparez les réactifs requis :
      1. Ajouter le PTCE à une concentration finale de 1 mM dans les tampons de lavage et d’élution et les conserver à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
      2. Gardez de l’éthanol à 20 % (v/v) prêt.
    14. Après l’incubation, pulsez brièvement les tubes dans une centrifugeuse pour recueillir la résine au fond du tube.
    15. Remettez la résine en suspension à l’aide d’une pipette et rajoutez-la dans la colonne de purification des protéines.
    16. Une fois que la résine s’est installée dans un lit au bas de la colonne, laissez passer le tampon.
      REMARQUE : En option, collectez le flux et les lavages pendant la purification des protéines pour analyse via SDS-PAGE afin de dépanner la procédure de purification
    17. Colonne de lavage avec un volume de colonne de tampon de lavage + TCEP.
    18. Ajoutez 5 mL de tampon d’élution + TCEP dans la colonne, remettez la résine en suspension à quelques reprises avec une pipette et incubez pendant 10 min.
    19. Après l’incubation, recueillir l’élution dans un tube de bijoux étiqueté de 5 mL et le conserver sur de la glace.
    20. Nettoyez et stockez la résine de purification des protéines :
      1. Une fois l’élution terminée, laver la colonne avec 30 ml de tampon d’élution pour éliminer les protéines liées restantes.
      2. Rincez la résine avec 30 mL d’eau distillée stérile, répétée 3 fois.
      3. Passez une fois 30 ml d’éthanol à 20 % (v/v) dans la colonne.
      4. Remplissez la colonne avec de l’éthanol à 20 % et fermez-la avec un couvercle ou un parafilm. Conserver à 4 °C jusqu’à la prochaine utilisation.
        REMARQUE : Seul le nettoyage est requis - n’essayez pas de retirer le nickel de la résine. La résine nettoyée peut être réutilisée dans les préparations standard du système PURE ; cependant, pour les variantes du système ΔPURE, utilisez toujours de la résine fraîche pour éviter la contamination croisée.
    21. Faites tremper une cassette de dialyse de 15 mL et 2 kDa dans le tampon HT (sans PTCE) pendant 10 min.
    22. Ajouter 5 mL de solution protéique éluée dans la cassette de dialyse.
    23. Retirez autant d’air que possible de la cassette avant de remettre le couvercle.
    24. Dialysez 5 ml de protéine éluée contre 1 L de Buffer HT (sans TCEP) pendant 2 h, puis 1 L de Buffer HT frais pendant une nuit à 4 °C en agitant doucement.
      REMARQUE : Si vous combinez des élutions provenant de plusieurs purifications, jusqu’à 10 ml d’élution peuvent être dialysés contre 2 L de Buffer HT pendant 2 h, suivis de 2 L supplémentaires de Buffer HT pendant la nuit à 4 °C. Si l’incubation de la résine a été effectuée pendant la nuit, la dialyse peut être effectuée pendant la journée en utilisant un protocole de 2 h suivi de 4 h, suivi immédiatement des étapes de concentration en protéines ci-dessous.
  4. Jour 4 : concentration et stockage
    1. Préparation des réactifs requis :
      1. Préparez le tampon HT Refresh + TCEP.
      2. Préparez le bouillon-60 + TCEP.
    2. Une fois la dialyse terminée, prélever 5 mL de l’échantillon dialysé de la cassette et répartir 500 μL d’aliquotes dans 5 tubes de microcentrifugation stériles de 2 mL.
    3. Tourner pour granuler les protéines précipitées à 14 000 × g, 4 °C, pendant 10 min.
    4. Recombinez le surnageant sans pastilles et ajoutez-le à une unité de filtration centrifuge MWCO de 3 kDa, puis complétez le volume avec 10 ml de Buffer HT Refresh + TCEP.
    5. Centrifuger à 3 220 × g, 4 °C, pendant 30 min OU jusqu’à ce que le volume de l’échantillon soit réduit à 1,5 mL.
      REMARQUE : La précipitation des protéines pendant les étapes de concentration peut réduire considérablement la performance globale du CFPS. Après chaque cycle de centrifugation de 30 minutes, utilisez une pipette de 1 mL pour remettre l’échantillon en suspension dans le tube filtrant centrifuge afin de déloger les protéines précipitées du fond du filtre.
    6. Retirer l’échantillon de l’unité centrifuge et répartir des aliquotes de 500 μL dans 3 tubes de microcentrifugation stériles de 2 ml.
    7. Tourner pour granuler les protéines précipitées à 14 000 × g, 4 °C, pendant 10 min.
    8. Recombinez le surnageant sans pastilles dans un tube de microcentrifugation frais et stérile sur de la glace.
    9. Déterminer la concentration des protéines en solution à l’aide d’un test de Bradford, en suivant les instructions du fabricant.
    10. Concentrer la solution protéique en l’ajoutant à un filtre MWCO frais de 3 kDa et en centrifugeant à 14 862 × g, 4 °C, pendant 15 minutes OU jusqu’à ce que le volume de l’échantillon soit atteint pour obtenir une concentration finale de 25-30 mg/mL.
    11. Retirer l’échantillon de l’unité centrifuge et répartir 500 μL d’aliquotes dans des tubes de microcentrifugation stériles de 2 mL.
    12. Tourner pour granuler les protéines précipitées à 14 000 × g, 4 °C, pendant 10 min.
    13. Déterminez la concentration en protéines à l’aide d’un test Bradford. Ne passez à l’étape suivante que si la concentration est comprise entre 25 et 30 mg/mL.
    14. Recombinez le surnageant sans granulés dans un nouveau tube de microcentrifugation sur de la glace.
    15. Ajouter un volume égal de Stock-60 + TCEP à la solution protéique concentrée et mélanger par pipetage doux.
    16. Déterminez la concentration finale en protéines à l’aide d’un test Bradford.
      REMARQUE : La protéine est maintenant dans le tampon HT + 30 % de glycérol, et toute dilution supplémentaire avec Stock-30 ne modifie pas la concentration de glycérol.
    17. Au besoin, diluer l’échantillon avec du Stock-30 + PTCE pour obtenir une concentration finale d’environ 12,5 mg/mL.
    18. Aliquote de la solution protéique PURE dans des tubes PCR à 20 μL d’aliquotes, congélation instantanée dans de l’azote liquide et stockage à -80 °C.
      REMARQUE : Il est crucial de déterminer la concentration de protéines avec précision avant d’ajouter Stock-60, car la concentration des solutions protéiques contenant du glycérol peut entraîner des performances CFPS incohérentes, en raison de quantités variables de glycérol dans la réaction finale CFPS. Stock-60 ne doit donc être ajouté qu’après avoir confirmé que la concentration en protéines se situe dans la plage optimale de 25-30 mg/mL.

3. Préparation brute des ribosomes (5 jours)

REMARQUE : Le protocole de purification des ribosomes a été optimisé pour le traitement de 2 L (4 flacons de 500 ml) de culture liquide, ce qui permet d’obtenir un total de ~3 g de pastille cellulaire et de produire ~1 mL de ribosomes bruts à une concentration de 15 à 24 μM.

  1. Jour 1 : préparation et croissance des cultures de démarrage
    1. Préparez des solutions mères et des tampons pour la préparation des ribosomes comme décrit dans le tableau supplémentaire S2 et la figure supplémentaire S1.
      REMARQUE : préparez les supports et les tampons nécessaires immédiatement avant l’exécution de chaque partie du protocole et ne les stockez que pendant le nombre maximum de jours avant l’utilisation comme indiqué.
    2. Préparez deux tubes coniques de 50 ml : ajoutez 10 ml de média LB dans un tube et 5 ml de média LB dans l’autre.
    3. Retirez le stock de glycérol de BL21(DE3) du congélateur à -80 °C et placez-le sur de la glace, en vous assurant que les étapes suivantes sont terminées avant que le stock ne décongèle.
    4. Inoculez les 10 mL de milieu LB en grattant les cellules du stock de glycérol, pour créer une « mini-culture » LB. Incuber à 37 °C, 220 tr/min, avec l’autre tube (non inoculé) pour vérifier la contamination du milieu, car toutes les croissances se font sans antibiotique.
    5. Remplacez le stock de glycérol dans le congélateur à -80 °C.
    6. Placez 2,2 L de bouillon Terrific stérile (TB) dans des bouteilles en verre stériles et conservez-le dans un incubateur statique à 37 °C pour préchauffer pendant la nuit.
  2. Jour 2 : croissance et granulation
    1. Retirez les cultures de l’incubateur et assurez-vous qu’il n’y a pas de contamination dans le tube non inoculé ou le flacon de milieu préchauffé avant de procéder.
    2. Préparez une dilution 10x en ajoutant 100 μL de la culture de mini-culture à 900 μL de LB dans une cuvette de 1 cm, et mesurez la DO600 à l’aide d’un spectrophotomètre (vérifiez qu’elle est ~4-6).
    3. Ajouter 200 mL de TB préchauffé dans une fiole conique stérile de 500 mL et inoculer avec un volume approprié de mini-culture pour obtenir une DO de départde 600 = 0,05 (tableau supplémentaire S1). C’est la « midi-culture ».
    4. Incuber la culture midi à 37 °C, 220 tr/min jusqu’àOD 600 = 1, ce qui devrait prendre environ 1,5 à 2 h.
    5. Ajouter 500 ml de TB dans chacune des 4 fioles stériles de 2,5 L défrichées. Inoculer chacun d’eux avec un volume approprié de midi-culture pour obtenir une DO de départde 600 = 0,05 (tableau supplémentaire S1). Ce sont les 4 'maxi-cultures'.
    6. Incuber les maxi-cultures à 37 °C, 220 tr/min jusqu’àOD 600 = 0,7-0,8, ce qui devrait prendre environ 1,5-2 h.
    7. Entre-temps, étiquetez et placez quatre bouteilles de centrifugation en copolymère de polypropylène propre et 4 bouteilles en verre propres de 500 ml sur de la glace pour refroidir.
      REMARQUE : Mesurez la densité maximale de culture toutes les 15 minutes après 1 h de croissance pour éviter de dépasser DO600 = 0,7.
    8. Une fois que la DO600 = 0,7 est atteinte, transférez rapidement les cultures dans des bouteilles en verre refroidies et placez-les dans un bain d’eau glacée pendant 20 minutes pour terminer la croissance.
      REMARQUE : Le transfert des cultures dans des bouteilles refroidies est essentiel pour arrêter rapidement la croissance : placer les flacons directement dans le bain d’eau glacée n’entraînera pas une fin efficace de la croissance. Toutes les étapes subséquentes sont effectuées sur glace, sauf indication contraire.
    9. Pendant que les cultures refroidissent dans le bain d’eau glacée, prérefroidissez la centrifugeuse pour la granulation cellulaire et placez 500 ml de solution PBS sur de la glace pour refroidir.
    10. Après 20 min, transférez 250 mL de chaque culture dans la bouteille de centrifugation prérefroidie correspondante, et centrifugez à 3 220 × g, 4 °C, pendant 10 min, tout en gardant les 250 mL restants sur de la glace.
    11. Décantez soigneusement le surnageant et séchez-le sur du papier absorbant.
    12. Ajouter les 250 ml restants de chaque culture dans le flacon de centrifugation correspondant, puis centrifuger de nouveau à 3 220 × g, 4 °C, pendant 10 min.
    13. Retirez le surnageant en le transvasant et séchez les bouteilles sur du papier absorbant avant de remettre les granulés de cellule sur de la glace.
    14. Ajoutez 30 ml de PBS stérile et glacé dans chaque flacon de centrifugation et remettez complètement la pastille de cellule en suspension.
    15. Pesez et étiquetez 4 tubes coniques propres de 50 ml.
    16. Transférez la suspension cellulaire dans les 4 tubes coniques de 50 ml.
    17. Centrifuger à nouveau à 3 220 × g, 4 °C, pendant 10 min.
    18. Retirez le surnageant par décantation et séchez les tubes sur du papier absorbant avant de remettre les granules de cellules sur de la glace.
    19. Ajoutez 30 mL de PBS stérile et glacé dans chaque tube conique et remettez complètement la pastille en suspension par vortex.
    20. Centrifuger à nouveau à 3 220 × g, 4 °C, pendant 10 min.
    21. Retirez le surnageant par décantation et séchez les tubes sur du papier absorbant avant de remettre les granules de cellules sur de la glace.
    22. Ajoutez 30 mL de PBS stérile et glacé dans chaque tube conique et remettez complètement la pastille en suspension par vortex.
    23. Centrifuger à nouveau à 3 220 × g, 4 °C, pendant 10 min.
    24. Retirez le surnageant par décantation et séchez les bouteilles sur du papier absorbant avant de remettre les granulés de cellule sur de la glace.
    25. Centrifuger une dernière fois à 3 220 × g, 4 °C, pendant 2 min.
    26. Éliminer tout excès de surnageant par pipetage.
    27. Pesez et notez la masse de chaque tube conique. La masse des granulés cellulaires est la différence entre ces valeurs et le poids à vide des tubes (doit être de ~1 g).
    28. Congelez les granulés à l’aide d’azote liquide et conservez-les à -80 °C.
  3. Jour 3 : lyse, ultracentrifugation et trempage du tampon B
    1. Décongeler les granules de cellules sur de la glace.
    2. Ajouter 50 ml de tampon de ribosome A dans un tube conique propre.
    3. Prélever 100 μL de tampon de ribosome A dans le tube conique et l’ajouter à un flacon de DTT sans poids. Dissoudre complètement la pastille de DTT pour obtenir une crosse de DTT de 0,5 M.
      REMARQUE : Préparez les stocks DTT de 0,5 M suivants comme décrit ici, mais en utilisant le tampon approprié pour chaque étape.
    4. Ajouter 100 μL de DTT 0,5 mL dans le tube conique de 50 mL pour obtenir une concentration finale de 1 mM de DTT dans le tampon de ribosome A de 50 mL. Garder la solution sur de la glace.
    5. Remettre en suspension chaque pastille cellulaire dans le tampon de ribosome A + DTT, à raison de 2 mL pour 1 g de pastille cellulaire, en faisant un vortex complet. Combinez toutes les cellules remises en suspension dans un seul tube conique pour vérifier le volume total de boue remise en suspension, qui doit être de 10 mL à partir de 2 L de culture. Si nécessaire, complétez le volume à 10 ml avec un tampon de ribosome A + DTT supplémentaire.
    6. Divisez la suspension en 2 échantillons de 5 ml dans des tubes coniques séparés.
    7. Lyser les cellules de chaque tube par sonication à 30 % d’amplitude, 20 s en marche, 20 s en arrêt pendant 10 cycles (durée totale du programme de 3 min 20 s), dans un bain d’eau glacée, à l’aide d’une sonde de sonication refroidie (figures 3A, 3C).
      REMARQUE : Environ 1 000 J d’énergie doivent être transférés par tube pendant la sonication. Utilisez un support sécurisé pour maintenir le tube en place pendant la sonication afin d’assurer la cohérence du transfert d’énergie.
    8. Complétez le volume de chaque échantillon lysé à 25 mL avec le tampon de ribosome A + DTT, et agitez brièvement pour mélanger.
    9. Transférez le contenu dans 2 tubes de centrifugation S30 refroidis.
    10. Centrifugeuse à 30 000 × g pendant 1 h à 4 °C (Figure 3E).
    11. Récupérez un maximum de 75 % du surnageant sans granulés (pour éviter la contamination membranaire par le granulé) de chaque tube S30 dans deux tubes S30 prérefroidis propres.
    12. Centrifugeuse à 30 000 × g pendant 30 min à 4 °C.
    13. Récupérez un maximum de 75 % du surnageant sans granules dans deux tubes coniques propres de 50 ml, et complétez le volume de chacun à 25 ml avec le tampon de ribosome A + DTT.
    14. Transférez l’échantillon dans deux tubes S100 propres et pré-réfrigérés.
      REMARQUE : Assurez-vous que les tubes sont équilibrés avec précision (différence maximale de 0,01 g entre les tubes opposés) avant l’ultracentrifugation et qu’ils sont remplis à un volume de 25 ml (capacité maximale du tube S100).
    15. Centrifugeuse à 100 000 × g pendant 4 h à 4 °C (Figure 3F).
    16. Trente minutes avant la fin de l’essai S100, préparez un stock de DTT de 0,5 M à l’aide du tampon de ribosome B glacé selon les instructions ci-dessus, et générez une solution finale de 1 mM de DTT dans 50 mL de tampon de ribosome B.
    17. Retirer le surnageant des tubes d’ultracentrifugation par décantation. Ajouter 5 mL de tampon ribosomique B + DTT glacé dans chaque tube S100 contenant des pastilles ribosomiques. Conservez le reste du tampon ribosomique B + DTT à 4 °C pour une utilisation le lendemain.
    18. Incuber les tubes sur de la glace dans une chambre froide pour laisser la pastille de ribosome tremper dans le tampon de ribosome B + DTT pendant la nuit.
      REMARQUE : Assurez-vous que la pastille de ribosome est complètement immergée dans le tampon de ribosome B + DTT. Cela peut être réalisé en plaçant des tubes dans la glace à un angle (figure 3D).
  4. Jour 4 : ultracentrifugation et trempage du tampon C
    1. Le lendemain, ajoutez 5 ml supplémentaires de tampon de ribosome B + DTT glacé dans chaque tube S100 contenant la pastille de ribosome trempée pendant la nuit.
    2. Essayez doucement de remettre la pastille en suspension par pipetage. À l’aide de la pointe de la pipette, grattez la pastille de la paroi du tube et remettez-la en suspension de cette manière. Transférez le contenu dans deux tubes S30 pré-refroidis propres.
    3. Ajoutez 10 ml supplémentaires de tampon de ribosome B + DTT glacé dans chaque tube S100 contenant la pastille de ribosome, et répétez les étapes de remise en suspension comme ci-dessus.
    4. Assemblez la remise en suspension dans le même tube S30 que précédemment.
    5. Centrifugeuse à 30 000 × g pendant 1 h à 4 °C (Figure 3G).
    6. Récupérez un maximum de 75 % du surnageant sans granules dans deux tubes coniques propres de 50 ml, et complétez le volume à 25 ml avec le tampon de ribosome B + DTT.
    7. Transférez cet échantillon dans deux tubes S100 propres et pré-réfrigérés.
      REMARQUE : Assurez-vous que les tubes sont équilibrés avec précision avant l’ultracentrifugation et qu’ils sont remplis à un volume de 25 ml (capacité maximale du tube S100).
    8. Centrifugeuse à 100 000 × g pendant 4 h à 4 °C (Figure 3H).
    9. Trente minutes avant la fin de l’exploitation S100, préparez un stock de DTT de 0,5 M à l’aide du tampon de ribosome C glacé selon les instructions ci-dessus, et générez une solution finale de 1 mM de DTT dans 5 mL de tampon de ribosome C. Gardez ce tampon sur de la glace.
    10. Après l’ultracentrifugation, jeter le surnageant et éliminer tout tampon résiduel par pipetage. Travaillez rapidement pour éviter de laisser la pastille à découvert par le tampon pendant trop longtemps.
    11. Ajouter 400 μL de tampon de ribosome C + DTT glacé dans chaque tube d’ultra-centrifugeuse contenant des pastilles ribosomiques.
    12. Incuber les tubes sur de la glace dans une chambre froide pour laisser la pastille de ribosome tremper dans le tampon de ribosome C + DTT pendant la nuit.
      REMARQUE : Assurez-vous que la pastille de ribosome est complètement immergée dans le tampon de ribosome C + DTT. Cela peut être réalisé en plaçant des tubes dans la glace à un angle.
  5. Jour 5 : collecte
    1. Le lendemain, remettez doucement la pastille de ribosome en suspension à l’aide d’une pipette de 1 mL et en agitant doucement pour dissoudre complètement la pastille de ribosome halo clair.
      REMARQUE : La pastille de ribosome doit se dissoudre complètement dans le tampon à ce stade : il ne doit pas y avoir de pastille insoluble à ce stade, mais s’il reste une pastille jaune insoluble, n’essayez pas de la remettre en suspension : ne remettez en suspension que la pastille de ribosome halo clair.
    2. Transvaser la solution de ribosome dans deux tubes de microcentrifugation stériles de 2 mL et centrifuger à 20 000 × g pendant 10 min à 4 °C pour granuler toute matière insoluble restante.
    3. Prélever le surnageant sans granulés dans un tube propre et le stocker sur de la glace (figure 3I).
    4. Créez une dilution 100x de la solution de ribosome en ajoutant 2 μL à 198 μL de tampon de ribosome C, en trois exemplaires.
    5. Mesurer la concentration d’ARN à 260 nm ; 10 unités d’absorbance de l’échantillon dilué équivalent à 24 μM de ribosomes13.
    6. Les solutions de ribosomes aliquotes (p. ex., dans des aliquotes de 50 μL, selon les besoins de l’utilisateur), sont congelées instantanément dans de l’azote liquide à une concentration maximale de 24 μM et se conservent à -80 °C jusqu’à leur utilisation.
      REMARQUE : Le protocole doit conduire à environ 1 mL de ribosomes à une concentration de 12 à 18 μM. Si les ribosomes sont trop dilués, la concentration peut être obtenue à l’aide d’un filtre MWCO de 3 kDa8.

4. Mise en place d’expériences CFPS

  1. Travaux préliminaires
    1. Préparer le modèle d’ADN (linéaire ou plasmidique) selon les protocoles établis9.
      REMARQUE : Dans notre laboratoire, nous utilisons des modèles d’ADN basés sur le système d’expression T7p14 optimisé pour l’expression acellulaire14. Les produits PCR purifiés peuvent être utilisés comme modèles linéaires. Il est important de noter que les plasmides doivent être nettoyés après la miniprep et que les différents kits commerciaux donnent des résultats variables15.
    2. Préparez une solution énergétique 5x comme décrit dans le tableau 3.
    3. Préparez la solution matricielle 6x comme décrit dans le Tableau 4.
  2. Mise en place et surveillance d’une réaction PURE
    REMARQUE : Ce protocole décrit la configuration d’une mesure en trois exemplaires à l’aide d’un mixage maître. Le nombre de réactions peut être augmenté ou réduit selon les besoins, à l’aide de la feuille de calcul donnée dans le tableau supplémentaire S3, mais nous recommandons un minimum de répétitions triples pour une seule condition expérimentale.
    1. La décongélation a nécessité des aliquotes de PURE, des ribosomes, de la solution énergétique et de la solution matricielle sur glace.
    2. Préparez un mélange maître pour une seule série de réactions triples dans un tube de PCR, totalisant 17 μL, comme le montre le tableau 5, en assemblant les composants dans l’ordre suivant : solution énergétique, protéines PURE, ribosomes, solution matricielle, eau sans nucléases à 17 μL.
    3. Réglez la pipette à 5,1 μL et aspirez doucement la solution 5 à 6 fois pour mélanger, en assurant l’homogénéité.
    4. À l’aide du même réglage de pipette (5,1 μL), chargez le mélange principal dans trois puits individuels d’une plaque optique de 384 puits. Évitez de pousser la pipette au-delà de la première butée pour éviter la formation de bulles. Laissez un espace de puits entre chaque réplication pour minimiser la diaphonie de fluorescence.
    5. Scellez la plaque à l’aide d’un joint adhésif pour plaque d’étanchéité.
    6. Procéder à l’incubation en aval ou aux mesures du lecteur de plaques, au besoin.
      REMARQUE : Lorsque vous incorporez des composants supplémentaires contenant du glycérol (par exemple, des protéines d’amplification), assurez-vous que le volume final de ces composants ne dépasse pas 10 % du volume de réaction. Par exemple, un composant contenant 30 % de glycérol doit être limité à 1,7 μL par 17 μL de mélange maître.
      Ne centrifugez pas la plaque à 384 puits après le chargement. La centrifugation peut provoquer la séparation des composants riches en glycérol (par exemple, le système PURE), ce qui entraîne des niveaux d’expression incohérents. La conception de la plaque prend en charge des réactions de petit volume, et un pipetage minutieux garantit un décantation adéquate sans centrifugation.

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Résultats

Le flux de travail pour les préparations PURE et ribosome est illustré à la figure 1, et un calendrier recommandé pour le travail est présenté dans le tableau 1. En règle générale, les réactions sont surveillées par la production de protéines fluorescentes telles que la GFP ou la mCherry, et les lectures RFU peuvent être converties en concentrations par étalonnage11. Cependant, les ren...

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Discussion

Nous avons présenté une procédure détaillée qui nous a permis d’obtenir des systèmes PURE reproductibles sur plusieurs lots et utilisateurs dans le même laboratoire. Pour y parvenir, un certain nombre d’étapes essentielles sont nécessaires.

La première étape importante consiste à garantir l’intégrité des 36 souches PURE : en plus du séquençage de tous les plasmides, il est essentiel de réaliser un essai d’expression pour vérifier que toutes les souches sont co...

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Déclarations de divulgation

SL est cofondateur et directeur technique de Biophoundry Inc., qui développe une technologie acellulaire pour l’ingénierie des phages.

Remerciements

NL, SL, AB et NZ sont soutenus par l’UKRI Future Leaders Fellowship (MR/V027107/1) de NL. SL est également soutenu par Biophoundry Inc. SY est soutenu par une bourse de doctorat du Darwin Trust de l’Université d’Édimbourg. CW est soutenu par une bourse de doctorat BBSRC Eastbio. Les auteurs remercient A. Pompa pour son aide dans l’utilisation de l’ultracentrifugeuse, qui a été soutenue par le financement de la Wellcome Discovery Research Platform for Hidden Cell Biology [226791]. De plus, nous remercions B. Lavickova et S. J. Maerkl pour leur aide dans la mise en place du protocole OnePot original. Dans le but du libre accès, l’auteur a appliqué une licence Creative Commons Attribution (CC BY) à toute version du manuscrit accepté par l’auteur découlant de cette soumission. La figure 1 a été partiellement créée dans BioRender. Laohakunakorn, N. (2025) [https://BioRender.com/wj65i81].

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2x YouTubeSigmaY2377-250G
Acides aminésSigmaLAA21-1KT
Acétate d’ammonium sans ARNaseThermo ScientificAM9070G
chlorure d’ammoniumSigma09718-1KG
AmpicillineSigmaA8351-5G
BL21(DE3) E. coli compétentONÉC2527H
bouteille, centrifugeuse (Nalgene)Thermo Scientific3120-9500Bouteille de copolymère en polypropylène
bouteille, verre (Duran) 250 mL, 500 mL, 1 L, 2 LVWR215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596
Analyse Bradford, Quick Start 1x Réactif de colorantBio-Rad5000205
centrifugeuseThermo ScientificHeraeus Megafuge 16R
centrifugeuse, microEppendorf5424R  ;
Colonne chromatographieBio-Rad7321010
Phosphate de créatineSigma27920
Cuvettes, semi-micro 1,6 mLFisherbrandFB55147
di-sodium hydrogène orthophophosphate dihydratéFisher ChemicalS/4450/60
cassette dialyse, Slide-A-Lyzer G3, MWCO 2 kDa, 15 mLThermo ScientificA52962
Orthophosphate d’hydrogène dipotassique anhydreFisher ChemicalP/5240/60
TNT sans peséeThermo ScientificA39255
Unité de filtre, MWCO centrifuge de 3kDa Amicon Ultra 15EMD MilliporeUFC900324
flasque, 500 mLVWR214-1133
flasque, déflecteur 2,5 L  ;TunairSS-5013
Acide foliniqueSigmaF7878-100MG
glycérolSigmaG5516-1L
HclFisherbrandH/1200/PB17
Tampon HEPES, solution 1 M pH 7,3Thermo ScientificBP299
ImidazoleSigmaI2399-500G
incubateurEppendorfNew Brunswick Innova & reg ; 42
IPTGThermo ScientificR0392
Pellets KOHThermo ScientificP1767-500G
L-Glutamique hémimagnésium sel tétrahydrateSigma49605-250G
Acide L-glutamique monopotassium sel monohydrateSigma49601-500G
Tétrahydrate d’acétate de magnésiumSigmaM5661-50G
chlorure de magnésiumFluka63020-1L
Installation de brassage magnétiqueStuartUS152
NanodropThermo ScientificNanodrop 2000
NEBExpress Ni-NTA Perles de chargeurONÉS1423S
ParafilmSigmaP7543-1EA
pipette, Eppendorf Research Plus multicanal 30-300 & micro ; LEppendorf3125000052
Joint adhésif de plaque pour lecteur de plaqueExcelScientificSTR-SEAL-PLT (Stérile)
Joint respirant à plaqueStarlabE2796-3005
Joint en feuille d’aluminiumExcelScientificFCS-25
Lecteur de plaquesBioTekSynergie H1
Vibrateur de plaquesAllshengMBI100-4A
Plate, puits 384Thermo Scientific242764
plaque, puits profond 96 1 mLThermo Scientific736-0601
plaque, puits profond 96 2 mLSarstedt82.1972.002
PCR à plaque, 96 puitsSarstedt721,978
Plaque, puits optique 96Thermo Scientific10057581
chlorure de potassiumSigmaP5405-500G
Orthophosphate de dihydrogène potassiqueFisher ChemicalP/4800/53
Réactif d’extraction de protéines (BugBuster)EMD Millipore70584-3
Résine de purification des protéines (cOmplete)Roche5893682001
Shaker à rôtiStarlabRM-Multi 1
chlorure de sodiumFisher ChemicalS/3105/70
sonde de sonication, FisherBrand 15-50 mLThermo Scientific12931181
SonicatorFisher ScientificFB120
spectrophotomètreJenwayGenova Plus
SpermidineSigmaS2626-1G
TCEP 0,5 MSupelco646547
Thermo Fisher NTP, Tris tamponnéThermo ScientificR1481
ARNt provenant d’E. coli MRE600Roche10109541001
TryptoneFormediumTRP02
tube, 0,2 mL de qualité PCRSarstedt72,737,002
tube, bijoux Sterilin 7 mL polystyrèneThermo Scientific129A
tube, conique (Falcon) 15 mLSarstedt62.554.502
tube, conique (Falcon) 50 mLSarstedt62.547.254
tube, microcentrifugeuse (Eppendorf) 1,5 mLSarstedt72.690.001
tube, microcentrifuge (Eppendorf) 2 mLSarstedt72.695.700
tube, centrifugation S100 & nbsp ;Beckman-Coulter355619
tube, centrifugation S30 & nbsp ;Thermo Scientific3118-0050
UltracentrifugeBeckman-CoulterOptima XPN-100
Rotor d’ultracentrifugeBeckman-CoulterRotor à angle fixe 70Ti
Eau distillée ultrapure sans DNase/RNaseThermo Scientific10977049
VortexerVWR444-2791
extrait de levureOxoïdeLP0021T

Références

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