Article de méthode

Plate-forme d’imagerie sans lentille déployable sur le terrain pour une analyse rapide sans marquage de l’activation des cellules tueuses naturelles

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DOI :

10.3791/68834

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8 août 2025

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1Department of Electronics and Information Engineering, Korea University, 2Department of Biotechnology and Bioinformatics, Korea University, 3Metaimmunetech Inc., 4Department of Gastroenterology and Hepatology, Guro Hospital, Korea University College of Medicine, 5Department of Laboratory Medicine, Anam Hospital, Korea University College of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode sans marquage pour l’analyse rapide sur cellule unique du nombre et de l’activité des cellules tueuses naturelles (NK) à l’aide de la technologie d’imagerie des ombres sans lentille. Cette méthode quantifie les changements morphologiques dans les cellules NK individuelles par l’analyse informatisée de leurs modèles de diffraction.

Résumé

Les cellules tueuses naturelles (NK) sont d’importants effecteurs de l’immunité innée qui éliminent les cellules infectées par le virus et les cellules malignes. La surveillance de l’activité des cellules NK est essentielle pour évaluer la fonction immunitaire. Cependant, les méthodes conventionnelles, telles que la cytométrie en flux, nécessitent beaucoup de main-d’œuvre et de temps. Ce protocole décrit une technique sans marquage pour l’analyse rapide de l’activité des cellules tueuses naturelles (NK) à l’aide de la technologie d’imagerie par ombre sans lentille (LSIT). Les cellules NK isolées du sang périphérique et stimulées par un activateur exclusif ont été analysées à l’aide de la plateforme LSIT en 5 minutes. La plate-forme LSIT capture des images holographiques, appelées images d’ombre, créées par l’interférence de la lumière avec les cellules NK, et surveille leur état d’activation en analysant les changements dans les paramètres d’ombre. Les paramètres clés dérivés des images d’ombre, y compris la distance crête à crête (PPD) et l’écart-type de la largeur maximale secondaire (WSM-SD), reflétaient quantitativement la morphologie cellulaire et la complexité interne. Ces paramètres ont été intégrés dans le paramètre d’ombre combiné (CSP) et l’indice d’immunité innée (I3) pour fournir une évaluation et une quantification complètes de l’activité des cellules NK en fonction des changements morphologiques dans les cellules. I3, calculé comme la variation en pourcentage de la CSP après l’activation, a servi de mesure directe de l’activité des cellules NK. Les cellules NK d’individus en bonne santé ont systématiquement montré des valeursI3 significativement plus élevées que celles d’individus immunodéprimés. La plateforme LSIT permet un profilage immunitaire rapide et rentable, adapté au diagnostic sur le lieu d’intervention.

Introduction

La morphologie cellulaire apparaît comme un indicateur clé des mécanismes moléculaires. Il fournit non seulement une représentation visuelle de la structure cellulaire, mais offre également des informations précieuses sur les processus et les fonctions sous-jacents des cellules individuelles1. L’analyse de la forme, de la taille et de l’activité des cellules immunitaires au niveau de la cellule unique fournit des informations cruciales sur leur comportement, leur hétérogénéité et leurs rôles dans la santé et la maladie 2,3,4,5,6.

Parmi ces cellules cruciales figurent les cellules tueuses naturelles (NK), qui sont un composant central du système immunitaire inné 7,8. Ils éliminent les cellules infectées par le virus et les cellules cancéreuses et régulent la réponse immunitaire adaptative par la libération de cytokines 9,10,11. Le cancer, les infections virales et les immunodéficiences réduisent souvent le nombre de cellules NK et altèrent leurs fonctions 12,13,14. Par conséquent, l’activation des cellules NK sert de biomarqueur important et fournit des informations sur la santé globale du système immunitaire. Par conséquent, l’évaluation rapide de l’activation des cellules NK sur une seule cellule est essentielle pour le pronostic, le diagnostic, la surveillance de la maladie et la stratification des patients 15,16,17,18.

Actuellement, l’activité des cellules NK est évaluée en fonction de leur capacité cytotoxique (capacité à tuer les cellules cibles) et de leur production de cytokines 19,20,21,22. Méthodes conventionnelles de mesure de la cytotoxicité à médiation cellulaire23, telles que les tests de libération de chrome 51 (51Cr)24,25, les tests de cytométrie en flux26,27 et les tests immuno-enzymatiques (ELISA) pour quantifier l’interféron-gamma (IFN-γ) sécrété par les cellules NK après stimulation 28,29,30 ont plusieurs limitations. Il s’agit notamment du manque de normalisation, de la longueur des protocoles (p. ex., l’incubation ELISA de nuit), de la dépendance à l’égard de l’étiquetage cellulaire et des coûts élevés de l’équipement 31,32,33. Ces défis mettent en évidence la nécessité de méthodes innovantes qui offrent des résultats rapides, une rentabilité, une analyse sans étiquette et un débit élevé. De plus, l’évaluation de l’activation des cellules NK au niveau de la cellule unique fournit des informations détaillées sur l’hétérogénéité de la population et les réponses cellulaires individuelles à la stimulation.

Parmi les technologies émergentes visant à surmonter ces limitations, la technologie d’imagerie des ombres sans lentille (LSIT) est une solution particulièrement efficace 34,35,36. LSIT, une holographie numérique en ligne (DIH) simplifiée, permet une analyse rapide, sans marquage et à haut débit de l’activation des cellules NK à une résolution de cellule unique 37,38,39. Le DIH capture les modèles d’interférence entre la lumière laser diffusée et un faisceau de référence colinéaire sur un capteur numérique pour reconstruire des informations tridimensionnelles (3D) sur des objets microscopiques40,41. Le LSIT simplifie cette approche en utilisant une LED partiellement cohérente, un microsténopé et un capteur CMOS pour capturer les motifs de diffraction (c’est-à-dire les images d’ombre) des cellules 42,43,44,45. La raison d’être de cette technique est basée sur l’observation que l’activation des cellules immunitaires provoque souvent des changements morphologiques, y compris des variations de la taille, de la forme, de la granularité cytoplasmique et de la structure nucléaire des cellules 46,47,48,49,50. Le LSIT est très sensible à ces changements, qui ont un effet direct sur les motifs de diffraction 51,52,53.

S’appuyant sur la sensibilité du LSIT à ces changements morphologiques et à leurs effets sur les modèles de diffraction, ce protocole présente une nouvelle méthode pour la quantification rapide et précise du nombre de cellules NK et de l’activité fonctionnelle au niveau de la cellule unique à l’aide de la plateforme NK Cellytics, ci-après dénommée plateforme LSIT54. Comme le montre la figure 1A, la plate-forme LSIT intègre le traitement des échantillons, l’activation et l’imagerie des ombres dans un flux de travail multicanal compact. Les cellules NK ont été isolées du sang total, stimulées à l’aide d’un cocktail de stimulateur d’activation (ASC) spécialement formulé et chargées sur une puce de test dédiée. L’ASC induit des changements morphologiques dans les cellules NK dans l’heure suivant l’exposition, tels que l’augmentation de la taille des cellules et de la complexité interne, qui peuvent être détectés avec précision à l’aide de la plateforme LSIT55,56.

La plate-forme LSIT utilise une source lumineuse LED et un capteur CMOS pour capturer les motifs DIH (ombres) des cellules individuelles (Figure 1B). Un algorithme spécial analyse ensuite ces motifs d’ombre et extrait des paramètres clés, tels que la distance crête à crête (PPD), qui est en corrélation avec la taille de la cellule, et l’écart-type de la largeur du maximum secondaire (WSM-SD), qui est en corrélation avec la complexité et l’irrégularité du cytoplasme (Figure 1C,D). En comparant les valeurs avant et après stimulation, la plateforme calcule des indices composites : le paramètre d’ombre combiné (CSP = PPD × WSM-SD) et l’indice d’immunité innée (I³), qui reflètent le pourcentage de variation de CSP après activation. La raison de l’introduction de la CSP est que l’activation immunitaire implique à la fois l’élargissement des cellules et l’augmentation de la complexité cytoplasmique. Se fier à un seul des deux critères peut manquer l’activation limite ou être affecté par le bruit, comme des débris ou un éclairage irrégulier. Le CSP améliore la classification en exigeant des changements cohérents dans les deux mesures. Ces indices classifient les états d’activation de différentes populations cellulaires sans marquage fluorescent ni traitement d’échantillons complexes.

Ce protocole est particulièrement utile pour les chercheurs et les cliniciens qui ont besoin d’une méthode rapide, quantitative et sans marquage pour surveiller les changements morphologiques induits par l’activation dans les cellules immunitaires. Il convient à la recherche immunologique fondamentale, au dépistage préclinique des médicaments et à l’évaluation des immunothérapies, et peut être utilisé comme outil de diagnostic ou de pronostic dans les contextes cliniques où l’évaluation rapide de l’état immunitaire est essentielle. Cette méthode nécessite des populations cellulaires isolées, l’accès à la plateforme LSIT et un cocktail d’activation spécifique de cellules NK.

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Protocole

Toutes les recherches ont suivi les directives de l’établissement et ont été approuvées par le comité d’examen institutionnel de l’hôpital Anam de l’Université de Corée (numéro d’approbation : 2021AN0040). Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Prélèvement et manipulation des échantillons

REMARQUE : Manipulez tous les échantillons de sang humain en utilisant les précautions de biosécurité standard et l’équipement de protection individuelle approprié.

  1. Prélever le sang total périphérique du patient dans un tube d’héparine stérile de manière aseptique.
  2. Retournez doucement le tube 8 à 10 fois pour mélanger l’anticoagulant avec le sang.
  3. Analysez l’échantillon de sang immédiatement après le prélèvement. Si l’analyse est retardée, stocker l’échantillon dans un tube hépariné à une température de 2 à 8 °C et l’utiliser dans les 48 heures.
    REMARQUE : Ne congelez pas le sang total. Utilisez des échantillons frais pour préserver l’intégrité cellulaire.

2. Isolement et activation des cellules NK

REMARQUE : Ce protocole présente un flux de travail optimisé et complet pour l’isolement et l’activation des cellules NK directement à partir du sang total humain à l’aide du kit de préparation NK, qui se compose du kit NK Sep pour l’isolement des cellules et du kit d’activation NK pour la stimulation. Ce kit intègre la sélection négative et la stimulation à base de billes magnétiques pour permettre une évaluation phénotypique rapide via une plateforme de cytométrie d’imagerie sans lentille.

  1. Configuration pré-test
    1. Sortez les kits du réfrigérateur et amenez-les à température ambiante (15-28 °C).
      REMARQUE : Le kit NK Sep comprend les composants suivants :
      a) Couvercle vert : Tube à réaction contenant le cocktail d’anticorps.
      b) Couvercle rouge : Tube de séparation 1 contenant des particules magnétiques dans le milieu de dilution (1,5 mL).
      c) Couvercle violet : tube de séparation 2 contenant les particules magnétiques.
      (d) Couvercle gris : Tube de récupération (propre et vide).
      Le kit d’activation NK comprend les composants suivants :
      a) Véhicule : Huit tubes transparents dans un sac en aluminium scellé.
      b) ASC : Huit tubes jaunes dans un sac en aluminium scellé.
      Retirez uniquement les tubes requis des sacs scellés. Refermez et réfrigérez tous les composants inutilisés.
    2. Préparez le matériel nécessaire : séparateur magnétique, pipettes à pointes stériles et un incubateur calibré ou un bloc chauffant réglé à 37 °C.
  2. Procédure d’isolement des cellules NK
    1. Ajoutez 0,5 mL de sang total dans le tube de réaction avec le capuchon vert contenant le cocktail d’anticorps. Mélangez doucement en retournant le tube 2-3 fois et incubez pendant 5 min.
    2. Transférez tout le contenu dans le tube de séparation 1 avec un capuchon rouge. Mélangez doucement 2-3 fois.
    3. Placez le tube sur un séparateur magnétique et incubez pendant 10 min à température ambiante.
    4. Une fois l’aimant en place, transférez environ 1,5 mL du surnageant dans le tube séparateur 2 à capuchon violet. Mélangez doucement 2-3 fois.
    5. Placez le tube de séparation deux sur le support magnétique et incubez pendant 10 min.
    6. Avec l’aimant toujours attaché, transférez environ 1,0 mL du surnageant dans un tube de récupération avec un couvercle gris. Mélangez soigneusement.
  3. Activation des cellules NK
    1. Ajoutez 100 μL de la suspension isolée de la cellule NK dans le tube du véhicule et 100 μL supplémentaires dans le tube ASC
    2. Mélangez soigneusement le contenu des deux tubes.
    3. Incuber les tubes à 37 °C pendant 1 h.
      REMARQUE : Utilisez un bloc chauffant calibré pour maintenir une température d’incubation constante.

3. Imagerie et analyse avec la plateforme LSIT

REMARQUE : Les cellules doivent être analysées immédiatement après l’incubation. S’il n’est pas possible d’effectuer une analyse immédiate, stocker les cellules incubées à une température de 2 à 8 °C et les analyser dans les 6 heures. La plateforme LSIT évalue la morphologie et le nombre de cellules dans des échantillons de sang humain à l’aide de DIH. Pour analyser l’activité immunitaire, des cellules NK non stimulées et stimulées par ASC ont été chargées sur une lame spéciale, insérées dans le dispositif et automatiquement imagées.

  1. Configuration et étalonnage de l’appareil
    REMARQUE : Effectuez toujours un étalonnage en arrière-plan avant d’analyser un échantillon.
    1. Allumez la plateforme LSIT. Assurez-vous que la LED, le ventilateur et la caméra fonctionnent.
    2. Démarrez le logiciel LSIT Capture . Connectez-vous en saisissant votre identifiant et votre mot de passe.
    3. Allez dans Paramètres et sélectionnez Calibrer.
    4. Appuyez sur le bouton Ouvrir de l’écran tactile ou utilisez le bouton physique de la porte coulissante pour ouvrir la porte. Lorsque le tiroir s’ouvre, retirez la glissière d’étalonnage et rangez-la.
    5. Assurez-vous qu’aucune lame de test n’est présente. Fermez le tiroir.
      REMARQUE : Utilisez uniquement des lingettes optiques pour nettoyer les surfaces des diapositives.
    6. Cliquez sur Définir l’arrière-plan pour calibrer l’intensité optique.
    7. Replacez la glissière d’étalonnage et fermez le tiroir.
    8. Cliquez sur Démarrer l’étalonnage.
      REMARQUE : Si du liquide est renversé sur l’appareil, éteignez-le immédiatement. Essuyez-le. Ne démontez pas l’appareil.
  2. Préparation et chargement des lames de dosage
    1. Retirez une lame de test de sa poche, étiquetez-la avec les données de l’échantillon et placez-la sur une surface propre et plane.
    2. Pipeter 10 μL de l’échantillon véhicule (non stimulé) dans les canaux A et B.
    3. Pipeter 10 μL de l’échantillon stimulé par ASC dans les canaux C et D.
      REMARQUE : Évitez la formation de bulles et le remplissage excessif.
    4. Appuyez sur Ouvrir pour éjecter le tiroir, retirer la glissière d’étalonnage et la placer dans une boîte de rangement.
    5. Insérez la lame de test préparée et appuyez sur Fermer.
  3. Acquisition d’images : Test Menu 1 - Activité des cellules NK
    REMARQUE : Si l’acquisition de l’image échoue, vérifiez l’éclairage et le volume d’échantillon. Recalibrez si nécessaire.
    1. Connectez-vous au système LSIT et sélectionnez le test d’activité des cellules NK sur l’écran principal.
    2. Entrez l’ID de l’échantillon ou utilisez le lecteur de codes-barres.
      REMARQUE : Pour récupérer l’ID de l’échantillon à partir de la liste archivée, utilisez le bouton Récupérer.
    3. Appuyez sur Capture pour démarrer l’enregistrement.
    4. Après avoir capturé l’image, cliquez sur Analyser
    5. Vérifiez l’activité des cellules NK ( %) et le nombre de cellules affichées à l’écran.
      REMARQUE : Les résultats valides sont affichés numériquement. Si I3 est inférieur à la plage, « ≤100 % » s’affiche. Au-dessus de la plage, « >300 % » s’affiche.
    6. Téléchargez les résultats sur une clé USB ou imprimez-les à l’aide du menu de l’écran tactile.
  4. Acquisition d’images : Menu de test 2 - comptage de cellules
    1. Sélectionnez l’option Comptage de cellules sous le menu Test 2 de l’interface principale.
    2. Chargez 10 μL de l’échantillon sur un nouveau canal de lame de test.
    3. Insérez la diapositive, fermez le tiroir et entrez l’ID de l’échantillon.
    4. Entrez le facteur de dilution s’il y a lieu.
    5. Appuyez sur Compter.
      REMARQUE : Si le résultat se situe dans la plage de test, le nombre de cellules NK s’affiche sous forme de valeur numérique sur l’écran du système. Pour les résultats inférieurs à la plage de test, « ≤ 10 cellules/μL » s’affiche, pour les résultats supérieurs à « > 1 000 cellules/μL ».
    6. Affichez les résultats sous forme de cellules/μL.
      REMARQUE : Basculez le champ de résultat noir pour afficher le nombre réel de cellules dans les images.
    7. Examinez les résultats et téléchargez-les ou imprimez-les.
      REMARQUE : Assurez-vous que le facteur de dilution correct est entré pour obtenir des résultats précis.

4. Nettoyage post-analyse

  1. Ouvrez le tiroir à l’aide du bouton Ouvrir ou de l’interrupteur à bascule physique.
  2. Retirez la glissière utilisée.
  3. Remettez la glissière d’étalonnage dans le tiroir pour protéger le capteur.
  4. Fermez le tiroir.
  5. Éliminez les tubes, embouts et lames usagés conformément à la réglementation sur les déchets de laboratoire.

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Résultats

Suivant ce protocole, la plateforme LSIT permet une évaluation quantitative et sans marquage de l’activation des cellules NK en fonction des changements morphologiques dans les cellules. La figure 2A montre des préparations de cytospin de cellules NK primaires colorées à l’Hema-3 provenant de donneurs sains après une incubation de 2 heures avec ou sans ASC. L’activation par ASC entraîne des changements marqués, principalement l’élargissement des cellules et une augmentation de la complexité ...

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Discussion

Ce protocole présente une méthode standardisée et sans marquage pour quantifier l’activation des cellules NK qui combine l’isolement et l’activation des cellules à l’aide du NK Prep Kit, avec une analyse via la plateforme LSIT. Il offre une alternative rapide et quantitative aux tests conventionnels tels que la libération de 51Cr, la cytométrie en flux et l’ELISA. Le protocole a été développé pour les laboratoires équipés de la plateforme LSIT et fournit des résultats...

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Déclarations de divulgation

I.L., S.H., H.S.J. et S.S. sont affiliés à Metaimmunetech Inc., une société impliquée dans le développement et la commercialisation de la plateforme LSIT présentée dans cette étude. Plus précisément, H.S.J. est le fondateur et PDG, S.H. est le PDG et S.S. est le directeur technique de l’entreprise. Cependant, les auteurs affirment que les résultats et les interprétations de ce manuscrit sont rapportés objectivement et ne sont pas influencés par des intérêts commerciaux de quelque nature que ce soit. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par les programmes de recherche en sciences fondamentales de la Fondation nationale de la recherche (NRF) de Corée (Grant# : RS-2024-00353675, Grant# : 2021R1I1A3056109), le programme de soutien ITRC (Information Technology Research Center) supervisé par l’IITP (Institute for Information and Communications Technology Planning and Evaluation) et le Commercialization Promotion Agency for R&D Outcomes (COMPA) financé par le ministère des Sciences et des TIC (MSIT), Corée (Subvention # : IITP-2025-RS-2023-00258971 (50 %), Subvention # : 2710084652), le programme de soutien de l’Institut coréen de promotion des sciences et technologies marines (KIMST) financé par le ministère des Océans et des Pêches, Corée (Subvention # : 20210660), et la subvention de l’Université coréenne. Les auteurs remercient Metaimmunetech Inc. pour leur collaboration, basée sur la technologie transférée de l’Université de Corée, dans le développement du dispositif Cellytics NK.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes de microcentrifugation de 1,7 mlAXYGENMCT-175-CStérile, sans DNase/RNase
Lame d’essaiMetaimmunetechAS050-GDiapositive dédiée pour le système Cellytics
50 diapositives dans une boîte
Système Cellytics avec logicielMetaimmunetechCS001Plate-forme d’imagerie des ombres sans objectif
Centrifugeuse (rotor à godet oscillant)LABOGÈNE1580R300&ndash ; 500 & fois ; Gamme G
Capteur d’image CMOSInclus avec l’appareil CellyticsIntégréUtilisé pour l’imagerie par diffraction
Centrifugeuse CytospinNasco CoréeCentrifugeuse TXT3 CytoPour la coloration par cytospin
Bloc chauffant numérique (37 ° ; C)Daihan ScientificDH. WHB00349Pour l’incubation cellulaire
Kit ELISA (IFN-&gamma ;)R& Système DDIF50CIFN-&gamma humain ; Kit ELISA
Cytomètre en flux Guava easyCyteMillipore0500-5005Pour l’analyse de l’expression de CD107a
Pack de statistiques Hema 3ThermoFisher122-911Pour la coloration par cytospin
IL-12 (humain recombinant)R& Système DComposante de l’ASC
IL-2 (Humain recombinant)Peprotech200-02Composante de l’ASC
Rack de séparation magnétiqueMetaimmunetechM13R8Pour la séparation des billes
Lames de microscopeMarienfeld1000612Pour les préparations de cytospin
Kit d’activation NKMetaimmunetechMIT2301V, MIT2301APour l’activation des cellules NK
NK Sep KitMetaimmunetechMIT2301-500Pour l’isolement des cellules NK
PE Souris Anti-Humain CD107a, 100testBD biosciences555801Pour l’analyse de l’expression de CD107a
Ouverture du sténopéInclus avec l’appareil CellyticsIntégréUtilisé dans le chemin d’éclairage LSIT
Pipettes (2 po ; 20 et micro ; L, 20&ndash ; 200 et micro ; L)AXYGENT-200-YVolume réglable
Diapositive d’étalonnage des ombresMetaimmunetechAS050-GPour l’étalonnage de l’appareil.
1 Lame d’étalonnage dans 1 boîte de lames d’essai
Mélangeur VortexMerck  ;SI-0246APour la remise en suspension

Références

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