Imagerie de cellules vivantes de la ségrégation chromosomique au cours de la méiose d’ovocytes de souris

Résumé

Ici, nous résumons les techniques d’imagerie de cellules vivantes pour étudier la ségrégation des chromosomes dans les ovocytes de souris, en utilisant H2B-RFP pour la chromatine et SiR-Tubuline pour la visualisation du fuseau. Nous détaillons la préparation des échantillons, la micro-injection, la culture, la configuration de l’imagerie et l’analyse, offrant un guide pratique pour obtenir une imagerie à haute résolution et peu phototoxique de la dynamique des chromosomes méiotiques.

Résumé

Une ségrégation chromosomique précise au cours de la méiose ovocytaire est essentielle pour assurer un bon développement embryonnaire et prévenir les troubles liés à l’aneuploïdie. L’imagerie de cellules vivantes combinée à des techniques de marquage par fluorescence est devenue une approche puissante pour étudier la dynamique des chromosomes méiotiques avec une résolution spatio-temporelle élevée. Dans ce protocole, nous résumons les méthodologies clés pour visualiser la ségrégation chromosomique dans les ovocytes de souris vivantes, en nous concentrant sur l’utilisation de l’histone H2B-RFP pour le marquage de la chromatine et de la tubuline SiR pour le suivi du fuseau. Nous décrivons les procédures de préparation d’échantillons, de micro-injection d’ARNm, de culture d’ovocytes, de configuration de la chambre d’imagerie de cellules vivantes et de paramètres de microscopie confocale, toutes optimisées pour obtenir une imagerie à haute résolution tout en minimisant la phototoxicité. De plus, nous soulignons des considérations expérimentales critiques telles que la phototoxicité, le traitement d’images et l’analyse quantitative des événements méiotiques. En fournissant une évaluation complète des méthodologies actuelles, ce protocole sert de guide pratique pour les chercheurs qui cherchent à étudier la dynamique des chromosomes dans les ovocytes vivants et à améliorer la précision et la reproductibilité des études méiotiques.

Introduction

Une visualisation précise de la dynamique chromosomique et du fuseau au cours de la méiose ovocytaire est essentielle pour comprendre les mécanismes qui régissent la maturation des gamètes femelles et le risque d’aneuploïdie 1,2,3,4,5. Les ovocytes de mammifères subissent une série hautement coordonnée d’événements méiotiques, notamment la dégradation des vésicules germinales (GVBD), la condensation des chromosomes, l’assemblage du fuseau et la division asymétrique

Protocole

Toutes les expériences doivent être menées conformément aux protocoles approuvés par le comité local d’éthique animale. Les procédures expérimentales doivent respecter strictement les principes des 3R : remplacement, réduction et raffinement. Les souris doivent être logées dans une animalerie accréditée dans des conditions environnementales normalisées (22 °C, 60 % d’humidité) avec un libre accès à la nourriture et à l’eau.

1. Prélèvement et préparation des ovocytes

REMARQUE : Tout l’équipement et les réactifs doivent être stériles. Effectuer toutes les manipulatio....

Résultats

Comme le montre la figure 4A,B, ce protocole permet une imagerie de cellules vivantes de haute qualité des chromosomes (H2B-RFP) et des microtubules fusiformes (SiR-tubuline) dans les ovocytes, fournissant ainsi des informations spatio-temporelles complètes tout au long de la maturation méiotique.

Le canal H2B-RFP de la figure 4A révèle tous les aspects du mouvement des chromosomes, de l’alignement initial après GVBD .......

Discussion

Le protocole présenté ici décrit une méthode robuste pour la micro-injection et l’imagerie de cellules vivantes d’ovocytes de souris, permettant de visualiser la dynamique des chromosomes au cours de la méiose avec une haute résolution temporelle et spatiale. La manipulation méticuleuse des ovocytes à chaque étape de la procédure, de la collecte et de la micro-injection à l’imagerie, est essentielle au succès de cette approche. Les ovocytes sont très sensibles aux fluctuations environnem.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringues de 1 ml	Terumo	SS+01T Tuberculine	Seringues pour des injections précises de PMSG.
Gel d’agarose	Invitrogen	16500500	Utilisé pour l’électrophorèse sur gel d’ADN et d’ARN afin de séparer les acides nucléiques par taille, afin de conformer la séquence H2B-RFP
Brûleur à alcool	LabTek	LW15557-01	Utilisé pour la stérilisation et la préparation de pipittes buccaux.
Milieu de culture bactérienne (bouillon LB)	Sigma-Aldrich	N° L3022	Milieu standard utilisé pour la culture d’E. coli et d’autres cultures bactériennes.
Boîtes de culture cellulaire (35 × ; 10 mm et 60 × ; 15 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430165, CLS430166	Utilisé pour la culture d’ovocytes ; Disponible en différentes tailles.
Centrifugeuse (paillasse)	Eppendorf	5424R	Une centrifugeuse compacte pour de petits volumes d’échantillons couramment utilisée dans les laboratoires de recherche.
Tubes à centrifuger (15 ml et 50 ml)	Corning	352096, 352070	Tubes plus grands pour la centrifugation, couramment utilisés pour le traitement des cellules et des protéines.
Chloroforme	Sigma-Aldrich	Réf. C2432	Solvant couramment utilisé dans les protocoles de biologie moléculaire, en particulier dans l’extraction de l’ADN/ARN.
Incubateur à CO2	Sanyo  ;	(modèle : MCO-18AIC)	Incubateur conçu pour maintenir une atmosphère contrôlée de CO2 pour la culture d’ovocytes.
Aiguilles ultra-fines jetables (27 G × ; 1/2")	Hanke Sass Loup	4710004012	Aiguilles fines pour le prélèvement d’ovocytes
DNase I (sans RNase)	Thermo Fisher Scientific	La norme EN0521	Enzyme utilisée pour éliminer l’ADN contaminant des préparations d’ARN.
Bloc chauffant sec	Instruments de subvention  ;	(modèle : QBD4)	Bloc utilisé pour chauffer des échantillons ou des réactions à des températures précises sans avoir besoin d’eau.
Éthanol (grade biologie moléculaire)	Sigma-Aldrich	E7023	Utilisé pour la précipitation de l’ADN et de l’ARN, ainsi que dans les procédures de stérilisation.
Ciseaux de dissection fins	Met-App Instruments scientifiques et chirurgicaux	2235	Utilisé pour la dissection précise des ovocytes de souris
Pinces fines	Met-App Instruments scientifiques et chirurgicaux	2127	Utilisé pour la dissection précise des ovocytes de souris
Système d’électrophorèse sur gel	Bio-Rad	1645050	Système permettant d’effectuer l’électrophorèse d’acides nucléiques ou de protéines dans des gels.
Sulfate de gentamicine	Sigma-Aldrich	G1264	Antibiotique utilisé pour prévenir la contamination bactérienne dans les cultures cellulaires.
Pipettes Pasteur en verre (230 mm)	VWR	6121702	Pipettes en verre utilisées pour pipette buccale d’ovocytes
IBMX	Sigma-Aldrich	I5879	Inhibiteur de la phosphodiestérase utilisé pour prévenir la GVBD
Microscope inversé	Nikon		Un microscope conçu pour observer des cellules ou des organismes vivants sous la boîte de culture.
Huile minérale légère adaptée à la culture d’embryons de souris	Sigma-Aldrich	M5310	Utilisé pour couvrir les ovocytes en culture afin d’empêcher l’évaporation et de maintenir la température.
Chlorure de lithium	Sigma-Aldrich	L9650	Utilisé dans les méthodes de précipitation de l’ARN.
Système d’imagerie de cellules vivantes	Leica	LAS X	Système d’imagerie conçu pour l’observation en temps réel de cellules vivantes à l’aide de techniques de microscopie avancées.
Milieu M16 (pour la culture in vitro)	Sigma-Aldrich	Référence M7292	Un milieu conçu pour la culture d’ovocytes et d’embryons de souris et d’autres applications in vitro.
Tubes de microcentrifugation (0,6 ml et 1,6 ml)	Neptune	3735.X, 3745.X	Tubes de petit volume pour la centrifugation, souvent utilisés dans les protocoles de biologie moléculaire et de biochimie.
Tubes de microcentrifugation (sans RNase)	Eppendorf / Neptune	022431081 (Eppendorf)	Les tubes sans RNASE pour l’ARN empêchent la dégradation de l’ARN.
Aiguilles de micro-injection	Sutter Instruments	P-30 Extracteur de pipette	Aiguilles pour une micro-injection précise dans les ovocytes
Système de micro-injection	Appareil de Harvard	FemtoJet, PicoPump	Systèmes utilisés pour injecter de l’ARNc dans les ovocytes de souris avec une grande précision.
Kit de mini-préparation	Qiagen	27106 (Kit de mini-préparation QIAprep)	Un kit pour isoler l’ADN plasmidique à partir de cultures bactériennes pour des applications de biologie moléculaire.
Ensemble de tube d’aspirateur buccal	Sigma-Aldrich	A5177	pour ovocytes d’aspiration
Peinture en granulés	Merck Millipore	69049-3	Un produit pour visualiser la formation de granulés pendant la centrifugation.
Phénol :Chloroforme :Alcool isoamylique	Thermo Fisher Scientific	15593031	Une solution utilisée dans l’extraction H2B-RFP pour la séparation de phases.
Plasmide codant pour H2B-RFP	Addgene	Plasmide #20972  ;	Plasmide utilisé pour le marquage des chromosomes avec la protéine de fluorescence rouge (RFP)  ;
Le PMSG	Prospec	HOR-272	Pour la superovalation de la souris
Protéinase K	Thermo Fisher Scientific	EO0491	Enzyme utilisée pour digérer les protéines, couramment utilisée dans les procédures d’extraction d’ADN/ARN.
Restriction enzyme NotI	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre (NEB)	R3189S	Enzyme de restriction utilisée dans les applications de clonage d’ADN et de biologie moléculaire, pour la linéarise plasmidique H2B-RFP.
Inhibiteur de la RNase (facultatif)	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre (NEB)	M0314S	Enzyme utilisée pour prévenir la dégradation de l’ARN lors d’expériences liées à l’ARN.
Gants sans RNase	VWR / Fisher Scientific	Varie selon la taille	Gants traités pour prévenir la contamination par la RNase, utilisés dans les protocoles de manipulation de l’ARN.
Pointes de pipette sans RNase	Axygen / Thermo Fisher	T-300-R-S	Pointes de pipette conçues pour être exemptes de contamination par la RNase pour les applications liées à l’ARN.
Eau sans RNase	Thermo Fisher Scientific	Référence AM9932	Eau purifiée pour éliminer les enzymes RNase, essentielles au travail de l’ARN pour éviter la dégradation.
FDS (10 %)	Sigma-Aldrich	L3771	Dodécylsulfate de sodium utilisé pour dénaturer les protéines dans l’électrophorèse et d’autres expériences.
SiR-Tubuline	Spirochrome	SC002	Colorant fluorescent qui se lie spécifiquement à la tubuline pour l’imagerie de cellules vivantes du fuseau
Acétate de sodium (3 M)	Sigma-Aldrich	S7899	Utilisé comme tampon et pour la précipitation de l’ADN dans les procédures de biologie moléculaire.
Spectrophotomètre	Thermo Fisher (NanoDrop)	ND-ONE-W	Instrument utilisé pour quantifier les acides nucléiques, les protéines et d’autres substances en mesurant l’absorbance.
Stéréomicroscope	Leica Microsystems  ;	; M165C	Un microscope conçu pour l’observation d’échantillons en trois dimensions à faible grossissement, utile pour les dissections.
Unité de filtre à seringue (0,22-& micro ; m)	Merck	SLGP033RS	Utilisé pour la filtration stérile de liquides, en particulier dans les applications de microbiologie et de biologie moléculaire.
Seringues et aiguilles	Terumo	Seringues à tuberculine SS+01T	utilisé pour une livraison précise du PMSG.
T7 mMESSAGE mMACHINE Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1344	Kit de transcription in vitro de l’ARN à partir d’un promoteur T7 pour la préparation d’ARNc H2B-RFP.
Bain-marie / bloc chauffant	Instruments de subvention	QBD4	Utilisé pour maintenir des températures précises dans des expériences nécessitant de la chaleur.