Article de méthode

Imagerie de cellules vivantes de la ségrégation chromosomique au cours de la méiose d’ovocytes de souris

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DOI :

10.3791/68847

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10 octobre 2025

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1The Christopher Chen Oocyte Biology Research Laboratory, UQ Centre for Clinical Research, The University of Queensland

Dans cet article

Résumé

Ici, nous résumons les techniques d’imagerie de cellules vivantes pour étudier la ségrégation des chromosomes dans les ovocytes de souris, en utilisant H2B-RFP pour la chromatine et SiR-Tubuline pour la visualisation du fuseau. Nous détaillons la préparation des échantillons, la micro-injection, la culture, la configuration de l’imagerie et l’analyse, offrant un guide pratique pour obtenir une imagerie à haute résolution et peu phototoxique de la dynamique des chromosomes méiotiques.

Résumé

Une ségrégation chromosomique précise au cours de la méiose ovocytaire est essentielle pour assurer un bon développement embryonnaire et prévenir les troubles liés à l’aneuploïdie. L’imagerie de cellules vivantes combinée à des techniques de marquage par fluorescence est devenue une approche puissante pour étudier la dynamique des chromosomes méiotiques avec une résolution spatio-temporelle élevée. Dans ce protocole, nous résumons les méthodologies clés pour visualiser la ségrégation chromosomique dans les ovocytes de souris vivantes, en nous concentrant sur l’utilisation de l’histone H2B-RFP pour le marquage de la chromatine et de la tubuline SiR pour le suivi du fuseau. Nous décrivons les procédures de préparation d’échantillons, de micro-injection d’ARNm, de culture d’ovocytes, de configuration de la chambre d’imagerie de cellules vivantes et de paramètres de microscopie confocale, toutes optimisées pour obtenir une imagerie à haute résolution tout en minimisant la phototoxicité. De plus, nous soulignons des considérations expérimentales critiques telles que la phototoxicité, le traitement d’images et l’analyse quantitative des événements méiotiques. En fournissant une évaluation complète des méthodologies actuelles, ce protocole sert de guide pratique pour les chercheurs qui cherchent à étudier la dynamique des chromosomes dans les ovocytes vivants et à améliorer la précision et la reproductibilité des études méiotiques.

Introduction

Une visualisation précise de la dynamique chromosomique et du fuseau au cours de la méiose ovocytaire est essentielle pour comprendre les mécanismes qui régissent la maturation des gamètes femelles et le risque d’aneuploïdie 1,2,3,4,5. Les ovocytes de mammifères subissent une série hautement coordonnée d’événements méiotiques, notamment la dégradation des vésicules germinales (GVBD), la condensation des chromosomes, l’assemblage du fuseau et la division asymétrique6. Bien que l’imagerie à point temporel fixe ait fourni des instantanés précieux de ces processus, elle manque de résolution temporelle et ne peut pas capturer les événements transitoires ou rapides qui se produisent entre les intervalles d’échantillonnage. En revanche, l’imagerie de cellules vivantes de chromosomes et de microtubules marqués par fluorescence offre une approche puissante pour surveiller ces processus dynamiques en temps réel 2,3,7. Cela permet d’observer directement le moment, la durée et la séquence des événements méiotiques dans les ovocytes individuels, et d’identifier des événements transitoires qui pourraient autrement passer inaperçus dans des échantillons fixes. Cependant, le maintien de la viabilité et de l’intégrité physiologique des ovocytes lors de la micro-injection et de l’imagerie nécessite une manipulation méticuleuse et des conditions optimisées8.

Ce protocole décrit un flux de travail complet pour la micro-injection d’ovocytes au stade de la vésicule germinale de souris (GV) avec de l’ARNc H2B-RFP, permettant le marquage fluorescent de la chromatine, suivi d’une imagerie confocale en accéléré des chromosomes et du comportement du fuseau tout au long de la méiose4. La méthode intègre des étapes clés telles que l’amorçage hormonal, l’isolement des ovocytes, la micro-injection dans des conditions de température contrôlée et l’imagerie en direct à l’aide de la microscopie confocale avec contrôle de l’environnement 4,9. L’objectif général de cet article est de présenter un flux de travail robuste et reproductible pour la visualisation en temps réel de la dynamique chromosomique et du fuseau dans des ovocytes de souris vivantes, fournissant une plate-forme pour l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à la régulation méiotique et au risque d’aneuploïdie.

Bien que ce protocole offre une résolution temporelle et spatiale élevée, il repose sur l’expression de rapporteurs exogènes, qui peuvent ne pas reproduire complètement la dynamique des protéines endogènes et pourraient potentiellement interférer avec les processus méiotiques natifs s’ils sont surexprimés. Les chercheurs devraient tenir compte de ces limites et valider les résultats en utilisant des approches complémentaires dans la mesure du possible.

Ce protocole est conçu pour soutenir les études portant sur les mécanismes méiotiques, les erreurs de ségrégation des chromosomes et l’impact des perturbations génétiques ou environnementales sur la qualité des ovocytes. Il fournit une plate-forme solide pour la recherche fondamentale et les applications translationnelles en biologie de la reproduction.

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Protocole

Toutes les expériences doivent être menées conformément aux protocoles approuvés par le comité local d’éthique animale. Les procédures expérimentales doivent respecter strictement les principes des 3R : remplacement, réduction et raffinement. Les souris doivent être logées dans une animalerie accréditée dans des conditions environnementales normalisées (22 °C, 60 % d’humidité) avec un libre accès à la nourriture et à l’eau.

1. Prélèvement et préparation des ovocytes

REMARQUE : Tout l’équipement et les réactifs doivent être stériles. Effectuer toutes les manipulations d’ovocytes à l’aide d’une pipette buccale sous stéréomicroscope (voir Tableau des matériaux). Recouvrez toutes les gouttelettes du milieu de culture d’huile minérale (figure 1A-E).

  1. Stimulation hormonale
    1. Injecter par voie intrapéritonéale à des souris femelles âgées de 3 à 4 semaines 5 unités internationales (UI) de gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG ; voir tableau des matières) 46 à 48 h avant le prélèvement des ovocytes.
      REMARQUE : Les souris B6CBAF1 (progéniture F1 de C57BL / 6J × CBA / CaCrl) sont préférées en raison de leur rendement ovocytaire supérieur et de leurs caractéristiques de maturation favorables.
  2. Préparation des milieux de culture
    1. Filtrez les médias M2 et M16 (voir tableau des matériaux) à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm. Compléter avec IBMX jusqu’à une concentration finale de 100 μM en diluant à partir d’un stock de 100 mM.
    2. Préparez 5 à 6 gouttelettes de M2-IBMX (~30 μL chacune) et 3 gouttelettes de M16-IBMX dans des boîtes de culture de tissus en plastique de 35 mm. Recouvrir toutes les gouttelettes d’huile minérale. Placez les boîtes M2-IBMX sur un bloc chaud à 37 °C (Figure 1A) et les boîtes M16-IBMX dans un incubateur à 37 °C à 5 % de CO2 pendant au moins 30 minutes avant l’isolement des ovocytes (Figure 1C).
    3. Préparez une boîte supplémentaire contenant 800 à 1 000 μL de M2-IBMX (sans huile) pour la dissection des ovaires. Placer sur une plaque chauffante à 37 °C montée sur un stéréomicroscope (Figure 1B).
  3. Isolement des ovocytes
    1. Souris sacrifiées par luxation cervicale. Essuyez le bas-ventre avec de l’éthanol à 70 %, puis faites une petite incision horizontale dans la peau et le péritoine pour entrer dans la cavité péritonéale. Prolongez l’incision en écartant les bords de l’incision avec les doigts.
    2. À l’aide d’une pince, balayez l’intestin pour exposer les ovaires dans la partie supérieure de l’abdomen, située au pôle supérieur des reins. À l’aide de pinces fines et de micro-ciseaux, excisez soigneusement les ovaires tout en évitant d’endommager les tissus. Transférez immédiatement les ovaires dans un tube de 1,5 mL contenant 100 à 200 μL de milieu M2-IBMX préchauffé.
    3. Transférez les ovaires dans 1 mL de milieu M2-IBMX préchauffé et passez-les à une platine de microscope de dissection chauffée (figure 1B). Retirez soigneusement le tissu adipeux et les restes oviductaux.
      REMARQUE : Manipulez les ovaires doucement pour éviter d’endommager les follicules ou les ovocytes. Maintenir les ovaires dans un milieu chaud pendant le transfert de la salle animalière au laboratoire.
    4. Libérer des complexes cumulus-ovocytes (COC) en perforant les follicules à l’aide d’une aiguille de 27 G (Figure 1A-B). Recueillir les COC et les transférer dans des gouttelettes de 25 à 30 μL de M2-IBMX (figure 1D).
    5. Dissocier les cumulus par pipetage répété à l’aide d’une pipette Pasteur en verre à calibre étroit (Figure 1E).
      REMARQUE : Bien que le pipetage buccal soit couramment utilisé pour la manipulation des ovocytes, les pipettes mécaniques ou les micromanipulateurs offrent des alternatives, en particulier dans les environnements où le pipetage buccal est limité ou impossible. Ces alternatives ont été utilisées avec succès dans des protocoles similaires10,11.
    6. Identifiez et sélectionnez les ovocytes adultes au stade GV en fonction d’un diamètre plus grand et d’un GV situé au centre à l’aide d’un stéréomicroscope à un grossissement de 20x à 40x. Transférer dans 30 μL de gouttelettes M2-IBMX fraîches sur un bloc chaud à 37 °C, à l’abri de la lumière.
      REMARQUE : Maintenir les ovocytes à 37 °C tout au long de toutes les procédures afin de préserver l’intégrité physiologique. Préchauffez tous les supports et utilisez des platines à température contrôlée pour toutes les manipulations et micro-injections au microscope.
    7. Laisser les ovocytes récupérer pendant 20 min sur un étage chauffé à 37 °C avant la microinjection.

2. Préparation de l’ARNc H2B-RFP

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes avec des gants dans un environnement propre et sans RNase. N’utilisez que de l’eau et des réactifs exempts de RNase, et de préférence en présence d’inhibiteurs de la RNase.

  1. Vérification du séquençage du plasmide H2B-RFP (voir la Table des matériaux) par séquençage de Sanger à l’aide d’amorces flanquant l’insert. Amplifiez le plasmide en transformant E . coli compétent (p. ex., DH5α), en sélectionnant une seule colonie et en la cultivant dans un bouillon LB avec des antibiotiques appropriés. Purifiez le plasmide à l’aide d’un kit de préparation midi ou maxi standard. Pour des procédures détaillées, voir Green et Sambrook12.
  2. Purifiez l’ADN plasmidique à l’aide d’un kit miniprep commercial selon les instructions du fabricant. Quantifiez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre.
  3. Linéariser 2 à 4 μg d’ADN plasmidique en aval de l’insert à l’aide d’une enzyme de restriction appropriée qui coupe une fois dans le squelette du vecteur (NotI a été utilisé pour H2B-RFP). Mettre en place la réaction de digestion en utilisant le tampon approprié et la concentration enzymatique décrite dans le tableau 1 et incuber à 37 °C pendant 1 à 2 h. Confirmer la linéarisation complète par électrophorèse sur gel d’agarose. Plusieurs bandes indiquent une digestion incomplète. Si vous utilisez un kit commercial, suivez les instructions du fabricant.
    REMARQUE : Choisissez une enzyme de restriction qui coupe précisément en aval de l’insert et dans des conditions de digestion optimales. Vérifiez la linéarisation en appliquant une petite aliquote sur un gel d’agarose.
  4. Éliminer la contamination par la RNase en incubant la réaction de digestion avec 1 μL de protéinase K (10 μg/mL), 5,3 μL de SDS à 10 % et 50 μL d’eau exempte de nucléases à 50 °C pendant 1 h.
    REMARQUE : Cette étape est essentielle pour éliminer les contaminants de la RNase et des protéines. N’utilisez que des réactifs sans RNase et maintenez des conditions de travail propres.
  5. Extraire l’ADN digéré avec de l’alcool phénol :chloroforme :isoamylique (25:24:1), suivi d’une extraction au chloroforme.
    REMARQUE : Pour réduire au minimum la toxicité et simplifier la manipulation des échantillons, des méthodes commerciales de purification sur colonne ou à base de billes (p. ex., membrane de silice ou systèmes à billes magnétiques) peuvent également être utilisées à la place de l’extraction au phénol ou au chloroforme.
  6. Précipitez l’ADN en ajoutant de l’acétate de sodium 3M et de l’éthanol à 100 %. Incuber à −80 °C pendant au moins 2 h.
  7. Granuler l’ADN par centrifugation à 12 000-14 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Lavez la pastille avec de l’éthanol à 70 %, centrifugez-la à nouveau à la même vitesse pendant 5 minutes à 4 °C, séchez-la brièvement à l’air libre (2 à 5 minutes) et mettez-la en suspension dans 6 μL d’eau exempte de RNase.
    REMARQUE : Après la précipitation de l’éthanol et la centrifugation, une pastille translucide ou blanche visible doit se former au fond du tube. Si aucune pastille n’est observée, répétez la centrifugation à une vitesse plus élevée ou réévaluez la concentration d’ADN.
  8. Effectuez la transcription in vitro à l’aide du kit T7 mMESSAGE mMACHINE (voir Tableau 2), en suivant le protocole du fabricant.
  9. Incuber la réaction de transcription à 37 °C pendant au moins 2 h. Prolonger l’incubation si la longueur du transcrit dépasse 5 kb.
  10. Retirer l’ADN matrice par traitement à la DNase en utilisant 1 U de DNase I par volume de réaction de 10 μL, incubé à 37 °C pendant 15 min.
  11. Purifier l’ARNc synthétisé à l’aide d’une précipitation de chlorure de lithium13. Après précipitation et centrifugation, une pastille translucide ou blanche visible doit se former au fond du tube. Lavez la pastille d’ARN avec de l’éthanol à 70 %.
  12. Remettre en suspension la dernière pastille d’ARNc dans 20 μL d’eau exempte de RNase. Mesurez la concentration d’ARN et confirmez la présence et la longueur de la queue poly(A) en effectuant une RT-PCR suivie d’un séquençage du produit de PCR. Aliquote l’ARNc en volumes de 1 μL et stockez-le à −80 °C.

3. Préparation et micro-injection d’ovocytes

REMARQUE : Tout au long de la procédure, maintenez les ovocytes à 37 °C à l’aide d’un milieu préchauffé et de platines de microscope à température contrôlée pour préserver la qualité des ovocytes.

  1. Préparation
    1. Décongeler les aliquotes de l’ARNc H2B-RFP sur de la glace, centrifuger brièvement et diluer à la concentration souhaitée (p. ex., 250 ng/μL).
      REMARQUE : La concentration optimale d’ARNc peut varier en fonction de la construction, du système d’expression et des objectifs expérimentaux. Nous recommandons de titrer la concentration d’ARNc (par exemple, dans la plage de 50 à 300 ng/μL) pour minimiser les artefacts de surexpression tout en assurant un signal suffisant. Les utilisateurs doivent également surveiller la progression méiotique (p. ex., GVBD, formation du fuseau et extrusion du corps polaire) comme lecture fonctionnelle de la santé et de la viabilité des ovocytes après l’expression du construct. Il a été rapporté que les concentrations d’injection d’ARNc varient généralement de 0,2 à 1 μg/μL, avec des résultats optimaux souvent obtenus à 0,5 μg/μL 2,3,4,5,7,8,9.
    2. Préparez des aiguilles de microinjection à partir de capillaires en verre borosilicaté (diamètre extérieur = 1,5 mm, diamètre intérieur = 0,86 mm, longueur = 100 mm) à l’aide d’un extracteur de pipette (figure 2A).
      REMARQUE : Nous utilisons un extracteur de pipette vertical (voir Tableau des matériaux ; Figure 2A). Optimisez les paramètres de tirage de manière empirique. La pointe de l’aiguille doit être suffisamment fine pour minimiser les dommages aux ovocytes, mais suffisamment large pour éviter l’obstruction et permettre une distribution en douceur de l’ARNc.
    3. Chargez 0,5 à 1,5 μL de solution d’ARNc dans la pointe de l’aiguille à l’aide d’embouts de microchargeur sans RNase. Retirez toutes les bulles d’air avant l’injection.
  2. Configuration de la parabole de micro-injection
    1. Préparez une boîte de micro-injection avec 100 μL de milieu M2-IBMX et recouvrez complètement d’huile minérale pour éviter l’évaporation et les changements d’osmolarité.
  3. Microinjection d’ovocytes
    1. Montez les pipettes de maintien et d’injection sur le système de micromanipulateur (Figure 2B,C).
    2. Placez la boîte de micro-injection sur la platine du microscope. À l’aide d’une pipette buccale, transférez les ovocytes dans la gouttelette M2-IBMX.
    3. Amenez les pipettes de maintien et d’injection dans le même plan horizontal que les ovocytes.
    4. Prélever un ovocyte en utilisant une aspiration douce à l’aide de la pipette de retenue (figures 2B et C).
    5. Insérez l’aiguille d’injection à travers la zone pellucide et l’oulemme, en ciblant le cytoplasme et en évitant le noyau.
    6. Délivrer l’ARNc H2B-RFP à l’aide d’une brève impulsion de capacité négative à travers un électromètre intracellulaire (Figure 2B-E). Maintenez le volume d’injection à environ 5 % du volume de l’ovocyte. Une injection réussie est généralement visible sous la forme d’une dispersion petite mais distincte du cytoplasme. Ajustez la pression et le moment de l’injection pour éviter d’endommager la membrane.
    7. Retirez l’aiguille rapidement et en douceur au même angle pour minimiser la déchirure de la membrane.
    8. Libérez l’ovocyte de la pipette de retenue et repositionnez-le dans une zone distincte de la boîte pour distinguer les ovocytes injectés des ovocytes non injectés (Figure 2F). Pour cette configuration, organisez le flux de travail en gardant les ovocytes non injectés en haut de la boîte et en déplaçant les ovocytes injectés vers le bas.
    9. Répétez les étapes 3.3.4 à 3.3.8 pour tous les ovocytes restants. Les taux de survie après l’injection varient selon la technique et les propriétés de l’ARNm. Attendez-vous à une viabilité de 60 à 80 %.
  4. Manipulation post-injection
    1. Transférez les ovocytes injectés dans une gouttelette fraîche de milieu M16-IBMX dans une boîte de culture propre.
    2. Incuber à 37 °C pendant 1 à 4 h pour permettre l’expression de H2B-RFP. Ajustez la durée d’incubation en fonction de la concentration d’ARNc, de la taille du transcrit et de l’efficacité de l’expression.

4. Imagerie en accéléré des chromosomes marqués par H2B-RFP pendant la méiose

  1. Préparation de l’équipement et des milieux
    1. Préchauffez la platine confocale, l’incubateur et la chambre environnementale à 37 °C pendant ≥ 30 minutes avant utilisation (Figure 3A). Allumez le contrôleur de gaz et lancez le flux de gaz pour maintenir la chambre à 5 % de CO2 et O2 ambiant. Assurez-vous que la chambre est humidifiée pour favoriser la santé des ovocytes pendant l’imagerie prolongée de cellules vivantes.
    2. Préparer les gouttes de culture : Placer 5 à 6 gouttes de 50 μL de milieu M16 complété par SiR-Tubuline (concentration finale de 100 nM) dans une boîte de Pétri de 35 mm. Recouvrir d’huile minérale. Dans une autre boîte d’imagerie à fond de verre, placez trois gouttes de 5 μL de M16 + SiR-Tubuline et recouvrez-les d’huile minérale. Préchauffer les deux plats à 37 °C pendant ≥ 30 min avant utilisation.
  2. Transfert et lavage des ovocytes
    1. Lavage des ovocytes : Transférez les ovocytes injectés séquentiellement à travers les gouttes M16 + SiR-Tubulin de 50 μL pour éliminer l’IBMX résiduel (5 lavages recommandés). Effectuez les lavages en douceur pour éviter d’endommager les ovocytes.
      REMARQUE : L’IBMX résiduel peut inhiber la reprise de la méiose, il est donc essentiel qu’un lavage en profondeur soit effectué.
    2. Transfert final : Après les lavages, transférez 15 à 20 ovocytes dans la goutte de 5 μL de M16 + SiR-Tubuline dans la boîte d’imagerie à fond de verre préchauffée.
  3. Configuration du microscope
    1. Montage de la parabole d’imagerie : Placez la parabole à fond de verre sur la platine du microscope confocal (Figure 3A). Laisser les ovocytes se stabiliser pendant ~10 min.
    2. Positionnement de la scène : à l’aide de l’imagerie en fond clair, centrez les ovocytes dans le champ de vision. Enregistrez les positions à l’aide d’un logiciel de microscope.
      REMARQUE : Dans cette étude, nous avons utilisé un microscope confocal Leica TCS SP8 avec un objectif HC PL APO 20x/1.0 NA à immersion dans l’eau. Cependant, d’autres systèmes confocaux et objectifs avec des spécifications similaires peuvent être utilisés en fonction de la disponibilité.
    3. Configuration de la pompe à eau pour les objectifs d’immersion dans l’eau : Si vous utilisez une lentille d’objectif d’immersion dans l’eau, faites fonctionner le système de pompe à eau pour fournir de l’eau par intermittence à des intervalles de 5 à 10 minutes. Ce flux périodique maintient la colonne d’eau entre l’objectif et la boîte d’imagerie à fond de verre, empêchant le dessèchement et assurant des conditions d’imagerie stables pendant les expériences à long terme. Pour les objectifs à immersion dans l’huile, cette configuration de débit d’eau n’est pas requise.
  4. Paramètres d’imagerie
    1. Passez en mode balayage laser. Réglez les intensités laser comme suit : 561 nm à 0,5 % (~100 μW à l’objectif) pour H2B-RFP (chromosomes) ; 633 nm à 3 % (~300 μW à l’objectif) pour SiR-Tubuline (microtubules fusiformes ; Figures 3B et E).
      REMARQUE : Suivez les directives de sécurité laser appropriées. Minimisez l’exposition au laser pour protéger la viabilité de l’échantillon.
  5. Acquisition de la pile Z
    1. Acquérez des piles Z d’une longueur de 30 à 50 m avec un pas de 2 à 4 m (Figure 3B, C).
    2. Capturez des images à des intervalles de 5 à 10 minutes en utilisant une vitesse de balayage de 600 Hz (Figure 3B,D). La durée totale de l’imagerie peut s’étendre de 12 à 16 heures, selon le stade méiotique surveillé, et est limitée par la phototoxicité et la tolérance des ovocytes à la culture in vitro prolongée.
  6. Acquisition séquentielle d’images
    1. Sur les systèmes de microscope, effectuez un balayage séquentiel avec deux détecteurs HyD : H2B-RFP : Excitation à 561 nm ; émission collectée à 580-630 nm ; Excitation SiR-tubuline à 633 nm ; à 650-700 nm (figure 3E).
  7. Lancement de l’imagerie time-lapse
    1. Avant de commencer l’acquisition à long terme en accéléré, vérifiez la qualité du signal en prenant une image de test. Les signaux fluorescents doivent être répartis uniformément : H2B-RFP doit marquer distinctement la chromatine et SiR-tubuline doit mettre en évidence les structures des microtubules sans bruit de fond excessif. Confirmez la stabilité de l’autofocus et le photoblanchiment minimal lors de courtes séquences d’imagerie préliminaires.
    2. Démarrez l’imagerie time-lapse en cliquant sur Démarrer.
      REMARQUE : Le GVBD, marquant l’entrée de la phase M, se produit généralement 60 à 90 minutes après le lavage de l’IBMX (Figure 4A). Dans cette configuration, les ovocytes C57BL/6 extrudent le premier corps polaire environ 8 à 9 heures après le GVBD (Figure 4A). Le moment peut varier selon la souche de souris et les conditions de culture.

5. Traitement post-imagerie

  1. Ouvrez le fichier d’imagerie dans un logiciel d’analyse d’images en sélectionnant Fichier > Ouvrir et en choisissant le fichier .lif dans la session d’imagerie.
  2. Générez des projections Z pour les canaux H2B RFP et SiR-Tubulin en sélectionnant Traitement > Générer une projection. Définissez le type de projection sur Projection d’intensité maximale. Sélectionnez les canaux RFP et SiR Tubulin, puis cliquez sur Exécuter.
    REMARQUE N’effectuez pas de projection Z pour le canal DIC, car cela peut entraîner une image floue. Au lieu de cela, identifiez et sélectionnez le plan DIC qui est le plus net. Utilisez cette image DIC focalisée en combinaison avec les projections d’intensité maximale des canaux H2B-RFP et SiR-Tubulin pour obtenir une visualisation optimale.
  3. Extrayez un seul plan focal en fond clair. Revenez à Outils de traitement et sélectionnez Modifier > recadrer. Choisissez le canal Fond clair, utilisez le curseur Z pour trouver le plan focal optimal, puis cliquez sur Appliquer.
  4. Fusionnez les images de projection et en fond clair en ouvrant Outils de processus, en sélectionnant Fusionner > Ajouter des couches. Ajoutez la projection RFP, la projection SiR-Tubulin et l’image en fond clair unique. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’ensemble fusionné , puis cliquez sur Appliquer.
  5. Exportez l’image fusionnée finale en sélectionnant Fichier > Exporter > image. Choisissez le format TIFF pour une sortie non compressée de haute qualité.
    REMARQUE : L’exportation au format TIFF est recommandée pour l’analyse en aval et la préparation des figures.

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Résultats

Comme le montre la figure 4A,B, ce protocole permet une imagerie de cellules vivantes de haute qualité des chromosomes (H2B-RFP) et des microtubules fusiformes (SiR-tubuline) dans les ovocytes, fournissant ainsi des informations spatio-temporelles complètes tout au long de la maturation méiotique.

Le canal H2B-RFP de la figure 4A révèle tous les aspects du mouvement des chromosomes, de l’alignement initial après GVBD ...

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Discussion

Le protocole présenté ici décrit une méthode robuste pour la micro-injection et l’imagerie de cellules vivantes d’ovocytes de souris, permettant de visualiser la dynamique des chromosomes au cours de la méiose avec une haute résolution temporelle et spatiale. La manipulation méticuleuse des ovocytes à chaque étape de la procédure, de la collecte et de la micro-injection à l’imagerie, est essentielle au succès de cette approche. Les ovocytes sont très sensibles aux fluctuations environnem...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par le Fonds de dotation du professeur Christopher Chen, le financement de démarrage de la Faculté de médecine de l’Université du Queensland et les subventions de projet du Conseil national de la santé et de la recherche médicale (APP1078134 et APP1103689) à H.A.H.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringues de 1 mlTerumoSS+01T TuberculineSeringues pour des injections précises de PMSG.
Gel d’agaroseInvitrogen16500500Utilisé pour l’électrophorèse sur gel d’ADN et d’ARN afin de séparer les acides nucléiques par taille, afin de conformer la séquence H2B-RFP
Brûleur à alcoolLabTekLW15557-01Utilisé pour la stérilisation et la préparation de pipittes buccaux.
Milieu de culture bactérienne (bouillon LB)Sigma-AldrichN° L3022Milieu standard utilisé pour la culture d’E. coli et d’autres cultures bactériennes.
Boîtes de culture cellulaire (35 × ; 10 mm et 60 × ; 15 mm)Sigma-AldrichCLS430165, CLS430166Utilisé pour la culture d’ovocytes ; Disponible en différentes tailles.
Centrifugeuse (paillasse)Eppendorf5424RUne centrifugeuse compacte pour de petits volumes d’échantillons couramment utilisée dans les laboratoires de recherche.
Tubes à centrifuger (15 ml et 50 ml)Corning352096, 352070Tubes plus grands pour la centrifugation, couramment utilisés pour le traitement des cellules et des protéines.
ChloroformeSigma-AldrichRéf. C2432Solvant couramment utilisé dans les protocoles de biologie moléculaire, en particulier dans l’extraction de l’ADN/ARN.
Incubateur à CO2Sanyo  ;(modèle : MCO-18AIC)Incubateur conçu pour maintenir une atmosphère contrôlée de CO2 pour la culture d’ovocytes.
Aiguilles ultra-fines jetables (27 G × ; 1/2")Hanke Sass Loup4710004012Aiguilles fines pour le prélèvement d’ovocytes
DNase I (sans RNase)Thermo Fisher ScientificLa norme EN0521Enzyme utilisée pour éliminer l’ADN contaminant des préparations d’ARN.
Bloc chauffant secInstruments de subvention  ;(modèle : QBD4)Bloc utilisé pour chauffer des échantillons ou des réactions à des températures précises sans avoir besoin d’eau.
Éthanol (grade biologie moléculaire)Sigma-AldrichE7023Utilisé pour la précipitation de l’ADN et de l’ARN, ainsi que dans les procédures de stérilisation.
Ciseaux de dissection finsMet-App Instruments scientifiques et chirurgicaux2235Utilisé pour la dissection précise des ovocytes de souris
Pinces finesMet-App Instruments scientifiques et chirurgicaux2127Utilisé pour la dissection précise des ovocytes de souris
Système d’électrophorèse sur gelBio-Rad1645050Système permettant d’effectuer l’électrophorèse d’acides nucléiques ou de protéines dans des gels.
Sulfate de gentamicineSigma-AldrichG1264Antibiotique utilisé pour prévenir la contamination bactérienne dans les cultures cellulaires.
Pipettes Pasteur en verre (230 mm)VWR6121702Pipettes en verre utilisées pour pipette buccale d’ovocytes
IBMXSigma-AldrichI5879Inhibiteur de la phosphodiestérase utilisé pour prévenir la GVBD
Microscope inverséNikonUn microscope conçu pour observer des cellules ou des organismes vivants sous la boîte de culture.
Huile minérale légère adaptée à la culture d’embryons de sourisSigma-AldrichM5310Utilisé pour couvrir les ovocytes en culture afin d’empêcher l’évaporation et de maintenir la température.
Chlorure de lithiumSigma-AldrichL9650Utilisé dans les méthodes de précipitation de l’ARN.
Système d’imagerie de cellules vivantesLeicaLAS XSystème d’imagerie conçu pour l’observation en temps réel de cellules vivantes à l’aide de techniques de microscopie avancées.
Milieu M16 (pour la culture in vitro)Sigma-AldrichRéférence M7292Un milieu conçu pour la culture d’ovocytes et d’embryons de souris et d’autres applications in vitro.
Tubes de microcentrifugation (0,6 ml et 1,6 ml)Neptune3735.X, 3745.XTubes de petit volume pour la centrifugation, souvent utilisés dans les protocoles de biologie moléculaire et de biochimie.
Tubes de microcentrifugation (sans RNase)Eppendorf / Neptune022431081 (Eppendorf)Les tubes sans RNASE pour l’ARN empêchent la dégradation de l’ARN.
Aiguilles de micro-injectionSutter InstrumentsP-30 Extracteur de pipetteAiguilles pour une micro-injection précise dans les ovocytes
Système de micro-injectionAppareil de HarvardFemtoJet, PicoPumpSystèmes utilisés pour injecter de l’ARNc dans les ovocytes de souris avec une grande précision.
Kit de mini-préparationQiagen27106 (Kit de mini-préparation QIAprep)Un kit pour isoler l’ADN plasmidique à partir de cultures bactériennes pour des applications de biologie moléculaire.
Ensemble de tube d’aspirateur buccalSigma-AldrichA5177pour ovocytes d’aspiration
Peinture en granulésMerck Millipore69049-3Un produit pour visualiser la formation de granulés pendant la centrifugation.
Phénol :Chloroforme :Alcool isoamyliqueThermo Fisher Scientific15593031Une solution utilisée dans l’extraction H2B-RFP pour la séparation de phases.
Plasmide codant pour H2B-RFPAddgenePlasmide #20972  ;Plasmide utilisé pour le marquage des chromosomes avec la protéine de fluorescence rouge (RFP)  ;
Le PMSGProspecHOR-272Pour la superovalation de la souris
Protéinase KThermo Fisher ScientificEO0491Enzyme utilisée pour digérer les protéines, couramment utilisée dans les procédures d’extraction d’ADN/ARN.
Restriction enzyme NotIBiolabs de la Nouvelle-Angleterre (NEB)R3189SEnzyme de restriction utilisée dans les applications de clonage d’ADN et de biologie moléculaire, pour la linéarise plasmidique H2B-RFP.
Inhibiteur de la RNase (facultatif)Biolabs de la Nouvelle-Angleterre (NEB)M0314SEnzyme utilisée pour prévenir la dégradation de l’ARN lors d’expériences liées à l’ARN.
Gants sans RNaseVWR / Fisher ScientificVarie selon la tailleGants traités pour prévenir la contamination par la RNase, utilisés dans les protocoles de manipulation de l’ARN.
Pointes de pipette sans RNaseAxygen / Thermo FisherT-300-R-SPointes de pipette conçues pour être exemptes de contamination par la RNase pour les applications liées à l’ARN.
Eau sans RNaseThermo Fisher ScientificRéférence AM9932Eau purifiée pour éliminer les enzymes RNase, essentielles au travail de l’ARN pour éviter la dégradation.
FDS (10 %)Sigma-AldrichL3771Dodécylsulfate de sodium utilisé pour dénaturer les protéines dans l’électrophorèse et d’autres expériences.
SiR-TubulineSpirochromeSC002Colorant fluorescent qui se lie spécifiquement à la tubuline pour l’imagerie de cellules vivantes du fuseau
Acétate de sodium (3 M)Sigma-AldrichS7899Utilisé comme tampon et pour la précipitation de l’ADN dans les procédures de biologie moléculaire.
SpectrophotomètreThermo Fisher (NanoDrop)ND-ONE-WInstrument utilisé pour quantifier les acides nucléiques, les protéines et d’autres substances en mesurant l’absorbance.
StéréomicroscopeLeica Microsystems  ;  ; M165CUn microscope conçu pour l’observation d’échantillons en trois dimensions à faible grossissement, utile pour les dissections.
Unité de filtre à seringue (0,22-& micro ; m)MerckSLGP033RSUtilisé pour la filtration stérile de liquides, en particulier dans les applications de microbiologie et de biologie moléculaire.
Seringues et aiguillesTerumoSeringues à tuberculine SS+01Tutilisé pour une livraison précise du PMSG.
T7 mMESSAGE mMACHINE KitThermo Fisher ScientificAM1344Kit de transcription in vitro de l’ARN à partir d’un promoteur T7 pour la préparation d’ARNc H2B-RFP.
Bain-marie / bloc chauffantInstruments de subventionQBD4Utilisé pour maintenir des températures précises dans des expériences nécessitant de la chaleur.

Références

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Ovocytes de sourismarquage par fluorescencehistone H2B RFPSiR Tubulinemicroscopie confocalemicroinjection d ARNmsuivi du fuseau

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