Article de méthode

Quantification de l’absorption des acides gras endothéliales à l’aide d’analogues d’acides gras fluorescents

DOI :

10.3791/68859

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15 août 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Union College, 2Department of Biology, University of North Carolina Chapel Hill, 3Department of Pathology & Laboratory Medicine and McAllister Heart Institute, University of North Carolina Chapel Hill

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole détaille un test in vitro permettant de mesurer l’absorption cellulaire des lipides dans les cellules endothéliales lors d’une stimulation avec des analogues fluorescents BODIPY-C12 et BODIPY-C16 d’acides gras saturés à longue et très longue chaîne. Cette méthode est efficace et adaptable à d’autres types de cellules, offrant une approche utile pour étudier le métabolisme des lipides.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules endothéliales (CE) jouent un rôle central dans la régulation du transport des acides gras (AG) de la circulation sanguine vers les tissus métaboliques, mais les outils permettant de quantifier l’absorption des AGA par EC de manière fiable et évolutive restent limités. Ici, nous présentons un test rapide, quantitatif et rentable pour mesurer l’absorption de FA dans les CE à l’aide d’analogues fluorescents de FA (BODIPY-C12 et BODIPY-C16), qui permettent d’étudier la dynamique d’absorption spécifique à la longueur de la chaîne dans un format de plaque à 96 puits. Le protocole intègre des contrôles positifs (3-hydroxyisobutyrate, lactate) et négatifs (niclosamide) et est validé dans les lignées EC primaires (HUVECs) et immortalisées (EA.hy926). Le test détecte l’absorption de l’AF en fonction du temps et de la dose, avec des résultats normalisés en fonction du nombre de cellules à l’aide de la coloration nucléaire de Hoechst et corrigés pour le bruit de fond à l’aide de contrôles appropriés. Il peut être adapté à une variété de types de cellules, de modalités d’imagerie et de conditions expérimentales, y compris l’imagerie de cellules vivantes et les formats de chasse d’impulsions. Par rapport à la coloration lipidique traditionnelle ou aux traceurs radiomarqués, cette méthode offre une sécurité, une vitesse et une polyvalence améliorées tout en capturant l’absorption dynamique de l’AF dans les cellules vivantes. Ce test fournit une plate-forme solide pour étudier la régulation du transport endothélial des lipides et sa contribution aux maladies métaboliques.

Introduction

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Pour que les nutriments véhiculés par le sang, tels que les lipides, pénètrent dans les tissus métaboliques, tels que les muscles squelettiques, ils doivent d’abord traverser la barrière des cellules endothéliales (CE) qui comprend les parois des vaisseaux sanguins capillaires. Alors que l’on a longtemps cru que les acides gras (AG) se diffusaient simplement à travers cette barrière pour atteindre les tissus sous-jacents, des preuves émergentes suggèrent que les CE régulent activement ce processus par le biais de mécanismes de transport spécialisés développés pour déplacer les molécules hydrophobes dans les mondes aqueux, extra- et intracellulaires1.

Dans la circulation sanguine, les AF existent soit sous forme d’acides gras libres (AGL) liés à l’albumine, soit sont emballés dans des lipoprotéines riches en triglycérides (TRL) telles que les chylomicrons et les lipoprotéines de très basse densité (VLDL)2. À la surface luminale des CE, la lipoprotéine lipase (LPL) hydrolyse les TRL pour libérer les AGL qui sont absorbés. Une variété de protéines sont impliquées dans le transport de l’AF, y compris CD36, qui effectue l’absorption réelle de l’AF dans la cellule ; les protéines de transport d’acides gras (FATPs) et les acyl-CoA synthétases (ACSL), qui interviennent dans le transport vectoriel ; les protéines de liaison aux graisses (FABP), qui agissent comme des chaperons lipophiles, et d’innombrables autres, dont certaines restent encore à découvrir et classées 2,3. Le tissu sous-jacent utilise également des mécanismes similaires pour absorber la graisse transportée, bien que les isoformes spécifiques présentes diffèrent souvent en fonction du type de cellule.

Des études récentes ont montré que les CE se coordonnent avec les cellules voisines par le biais d’une signalisation paracrine pour moduler le transport des FA dans les tissus cibles. Par exemple, les myocytes squelettiques sécrètent un ensemble de facteurs paracrines tels que le 3-hydroxyisobutyrate (3-HIB), le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire B (VEGFB) et l’apeline pour favoriser le transport de l’AF par l’endothélium 4,5,6 voisin. Il est intéressant de noter que le système endocrinien peut également être impliqué, comme c’est le cas lorsque l’insuline stimule les adipocytes à libérer du lactate, ce qui stimule également les CE à absorber les FA7.

Les CE agissent donc comme des gardiens modulateurs des graisses, suggérant qu’ils jouent un rôle clé dans les troubles métaboliques des lipides tels que les maladies cardiovasculaires ou le diabète de type 2. Des preuves récentes ont montré que les CE eux-mêmes accumulent des gouttelettes lipidiques (LD) en réponse à une surcharge de graisse, agissant potentiellement comme un tampon qui régule l’apport d’acides gras aux tissus sous-jacents 8,9. Dans le cas d’une consommation élevée de graisses, comme c’est le cas avec les régimes modernes, une accumulation excessive de ces LD peut contribuer à un dysfonctionnement vasculaire et à des maladies, y compris l’hypertension10. Dans l’ensemble, une meilleure compréhension de la façon dont les CE absorbent et transportent les AF pourrait nous fournir de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter les maladies transmises par les lipides.

Dans cette étude, nous décrivons un test simple, rapide et rentable pour mesurer l’absorption endothéliale des FA à l’aide d’analogues fluorescents à longue chaîne des FA BODIPY-C12 et BODIPY-C16. Ces réactifs sont assez peu coûteux et assez sûrs, en particulier par rapport aux acides gras radioactifs ou marqués à des isotopes lourds, qui ont été traditionnellement utilisés pour mesurer l’absorption cellulaire des graisses11,12. Il est important de noter que ces réactifs sont distincts du colorant BODIPY « libre » non conjugué, qui s’accumule passivement dans les régions hydrophobes de la cellule, principalement dans les LDs13. En revanche, la conjugaison de BODIPY à une chaîne d’acides gras aliphatiques (par exemple, C12 ou C16) produit une molécule qui imite structurellement les acides gras natifs à longue chaîne. Cette modification permet de mesurer de manière ciblée l’absorption dynamique des acides gras dans les cellules, plutôt que de refléter le stockage intracellulaire des lipides ou la formation de gouttelettes.

L’une des principales forces de cette approche est sa flexibilité. Les chercheurs peuvent utiliser d’autres types de cellules, des temps d’incubation variables et une gamme d’analogues de l’AF conjugués à BODIPY pour étudier l’absorption dépendante de la longueur de la chaîne, ou même des lipides naturellement fluorescents comme l’acide gras cis-parinarique14. Dans l’ensemble, ce protocole fournira aux chercheurs un moyen facile de tester l’absorption cellulaire des FA dans de multiples conditions et ouvrira la voie à des réponses à des questions fondamentales sur le métabolisme des lipides, la biologie endothéliale et les maladies métaboliques (Figure 1).

Protocole

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Toutes les cellules endothéliales d’origine humaine (HUVEC) utilisées dans cette étude ont été obtenues à partir de sources anonymisées disponibles dans le commerce, conformément aux lignes directrices des établissements et des fournisseurs pour l’utilisation éthique du matériel biologique humain. Effectuez toutes les étapes dans un environnement stérile sous une hotte à flux laminaire. Voir le tableau des matériaux pour une liste de tous les réactifs et équipements.

1. Revêtement en gélatine d’une plaque à 96 puits

  1. Préparez une solution de gélatine à 0,1 % en diluant 25 ml de gélatine à 2 % dans 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  2. Bien mélanger et stériliser par filtre à l’aide d’un filtre sous vide de 0,2 μm (ou autoclave).
  3. Ajouter 100 μL par puits de gélatine à 0,1 % dans une plaque noire à fond transparent à 96 puits.
  4. Incuber à 37 °C pendant au moins 30 min ou idéalement toute la nuit.

2. Ensemencement cellulaire

  1. Préparez une suspension unicellulaire de CE dans un milieu complet.
    1. Préparez un milieu complet en complétant le milieu de base approprié avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine (v/v pour les deux).
      REMARQUE : Le milieu basal différera en fonction du type de cellule spécifique ; dans cette étude, le milieu de croissance endothéliale (EGM-2) et le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) ont été utilisés pour les cellules HUVECs et EA.hy926, respectivement.
  2. Pipeter 100 μL de suspension cellulaire dans chaque puits à une densité d’ensemencement qui permet aux cellules d’atteindre la confluence le lendemain.

3. Préparation et application du réactif de traitement

  1. Préparez tous les réactifs dans du PBS divalent (avec Ca2+ et Mg2+) et préchauffez-les à 37 °C.
    1. Préparez le 3-HIB (contrôle positif) comme solution de travail de 20 mM. Dissoudre la solution mère à 1 M dans de l’eau bi-distillée et la conserver à 4 °C.
    2. Préparez le lactate (contrôle positif) sous forme de solution d’action de 20 mM. Dissoudre la solution mère à 1 M dans de l’eau bi-distillée et la conserver à 4 °C.
    3. Préparer le niclosamide (témoin négatif) à une concentration finale de 1 μM. Dissoudre la solution mère à 10 mM dans du DMSO. Humidifiez vos produits en plus petits volumes pour éviter les cycles de gel-dégel et conservez-les à -20 °C.
  2. Lavez les cellules une fois avec du PBS divalent préchauffé.
  3. Ajouter 50 μL par puits du réactif de traitement approprié (3-HIB, lactate ou niclosamide) et incuber à 37 °C pendant 30 min (pour le niclosamide) ou 60 min (pour le 3-HIB et le lactate).

4. BODIPY-FA : PRÉPARATION ET APPLICATION DU COMPLEXE BSA

  1. Préparez des complexes BODIPY-FA : BSA à des concentrations finales de 0,5 μM, 1 μM ou 2 μM dans le PBS, en utilisant un rapport molaire FA : BSA de 2:1. Pour une solution BODIPY-FA de 2 μM, incuber avec un BSA sans FA de 1 μM dans PBS. Pour 1 μM BODIPY-FA, utilisez 0,5 μM BSA, et ainsi de suite. Protégez toujours les complexes de la lumière pendant l’incubation.
  2. Incuber le mélange à température ambiante pendant 10 min avant utilisation.
  3. Ajouter 50 μL du complexe aux puits traités.
    REMARQUE : N’utilisez que les 10 colonnes du milieu pour éviter les effets de bord. Réservez des colonnes extérieures comme contrôles d’autofluorescence, en ajoutant uniquement du PBS à ces puits.
  4. Incuber la plaque à 37 °C pendant 1 min, 5 min ou 10 min.

5. Extinction de fluorescence et détection de signal intracellulaire

  1. Préparez 1 μM de BSA sans FA dans du PBS comme tampon de lavage et préchauffez à 37 °C.
  2. Retirez BODIPY-FA : BSA et lavez toute la plaque deux fois avec 50 μL de BSA préchauffé sans FA de 1 μM dans du PBS. Effectuez chaque lavage pendant 1,5 min.
  3. Ajouter 50 μL de bleu de trypan à 0,08 % pour éteindre la fluorescence extracellulaire.
  4. Mesurez immédiatement la fluorescence intracellulaire à l’aide d’un lecteur de microplaques avec les paramètres suivants : Excitation : 488 nm, Émission : 515 nm, Coupure : 495 nm, Mode : Lecture par le bas.
    REMARQUE : Soustrayez le bruit de fond d’autofluorescence à l’aide des puits de la colonne externe contenant des cellules qui n’ont pas été traitées avec BODIPY-FA à l’étape 4.

6. Coloration nucléaire de Hoechst pour la normalisation cellulaire

  1. Retirez la solution de Trypan Blue et lavez-la délicatement avec du PBS.
    REMARQUE : Les cellules peuvent être quelque peu fragiles et sujettes à la desquamation. Soyez prudent lors du lavage.
  2. Ajouter 4 μg/mL de Hoechst dans un milieu à 10 % et incuber 30 min à 37 °C.
    REMARQUE : Le temps d’incubation de Hoechst peut nécessiter une optimisation. Selon le type de cellule, 5 à 60 min peuvent être nécessaires pour obtenir un marquage nucléaire uniforme et une intensité de signal suffisante. N’ajoutez pas de Hoechst aux colonnes extérieures.
  3. Lavez l’assiette une fois avec du PBS.
  4. Ajoutez du PBS frais et mesurez la fluorescence Hoechst à l’aide des paramètres suivants : Excitation : 350 nm, Émission : 461 nm, Coupure : 455 nm, Mode : Lecture par le bas.
    REMARQUE : Soustrayez le fond d’autofluorescence Hoechst à l’aide des puits de colonne externes.
  5. Normalisez la fluorescence de BODIPY-FA en fonction du nombre de cellules en divisant les valeurs corrigées de l’autofluorescence de l’étape 5.3 par les valeurs de Hoechst correspondantes obtenues à l’étape 6.4. Utilisez des valeurs corrigées de l’arrière-plan pour les signaux BODIPY et Hoechst.
    REMARQUE : Les valeurs finales représentent l’absorption de BODIPY-FA normalisée en nombre de cellules, corrigée pour l’autofluorescence dans les canaux BODIPY et Hoechst.

7. Analyse statistique

  1. Effectuez une analyse statistique pour la figure 2 à l’aide de l’ANOVA à deux facteurs pour évaluer les effets du temps, de la concentration et de leur interaction. Appliquez le test post hoc de Tukey pour des comparaisons multiples.
  2. Pour les figures 3 et 4, utilisez le test t bilatéral non apparié de Student lorsque vous comparez deux conditions. Pour les expériences impliquant trois conditions ou plus, utilisez l’ANOVA à un facteur suivie du test de Dunnett pour les comparaisons multiples.

Résultats

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Comme l’illustre la figure 1, cet essai utilise un format de plaque de 96 puits où les CE sont ensemencés directement dans les puits. Les AF marqués BODIGY sont conjugués à l’albumine sérique bovine (BSA) et appliqués à la fois aux puits expérimentaux et aux puits témoins. Avant le traitement par AF, les CE peuvent être manipulées par des traitements pharmacologiques ou des perturbations génétiques telles que la transfection de siRNA ou l’édition de gènes CRISPR. De manière cruciale, ces manipulations permettent également d’inclure des contrôles positifs et négatifs appropriés pour assurer la fiabilité du test.

Une nette augmentation dépendante de la dose et du temps du signal intracellulaire de BODIPY-C12 a été observée après l’incubation de BODIPY-C12 à 0,5 μM, 1 μM et 2 μM pendant 1 min, 5 min et 10 min dans les cellules HUVEC et EA.hy926 (Figure 2). Pour tenir compte des variations potentielles du nombre de cellules par puits, les valeurs de BODIPY-C12 ont été normalisées en fonction de la coloration nucléaire de Hoechst et mesurées par fluorescence. L’autofluorescence de fond a été corrigée à l’aide de puits de contrôle no-BODIPY et no-Hoechst.

Pour valider la reproductibilité et la gamme des essais, des modulateurs connus du métabolisme des acides gras ont été testés dans des EC EA.hy926 à l’aide de BODIPY-C12 (Figure 3). Un traitement de 1 h avec des concentrations croissantes de lactate (0 mM, 5 mM, 20 mM) ou de 3-HIB (0 mM, 5 mM, 20 mM) a amélioré l’absorption de BODIPY-C12 de manière dose-dépendante, confirmant leur rôle de régulateurs positifs de l’absorption de l’AF. À l’inverse, il a été démontré précédemment que le niclosamide chimique peut inhiber l’absorption des acides gras par le découplage mitochondrial15. En effet, des résultats similaires ont été reproduits ici, car 30 min de traitement au niclosamide (1 μM) ont significativement réduit le signal BODIPY-C12 par rapport au contrôle du véhicule, validant son utilité en tant que contrôle négatif. Bien que ces données soient normalisées à Hoechst pour tenir compte de toute différence dans le nombre de cellules, aucun de ces traitements n’a modifié la viabilité cellulaire ou les valeurs de fluorescence de Hoechst.

Afin d’évaluer l’adaptabilité de l’essai à différents analogues d’acides gras, BODIPY-C16, qui peut être considéré comme un substitut d’un acide gras à très longue chaîne, a été administré à des HUVEC, et son absorption a été mesurée après des incubations de 5 minutes (figure 4). Il a été observé que le traitement au lactate (0 mM, 10 mM, 20 mM) augmentait le signal BODIPY-C16 de manière dose-dépendante, tandis que le niclosamide (1 μM) réduisait le signal, reflétant les résultats observés avec BODIPY-C12.

Dans l’ensemble, ce test a permis une quantification robuste et reproductible de l’absorption des FA dans les CE primaires (HUVEC) et immortalisées (EA.hy926). De plus, ces résultats démontrent la polyvalence du test sur les AF de différentes longueurs de chaîne, ainsi que la validité des contrôles positifs et négatifs.

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Figure 1 : Schéma du dosage de l’absorption des acides gras à l’aide d’acides gras marqués BODIPY. Les cellules endothéliales sont ensemencées dans une plaque noire à fond transparent de 96 puits et incubées avec des analogues d’acides gras (AG) conjugués à BODIPY pour permettre l’absorption intracellulaire. Après l’incubation, la fluorescence extracellulaire est éteinte avec du bleu de trypan, et le signal intracellulaire est mesuré à l’aide d’un lecteur de microplaques à fluorescence à lecture par le bas. La coloration nucléaire de Hoechst est appliquée après la mesure de la fluorescence pour quantifier le nombre de cellules pour la normalisation. Un traitement pharmacologique ou des perturbations génétiques peuvent être appliqués avant l’incubation de BODIPY-FA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Quantification de l’absorption de BODIPY-C12 dans les cellules endothéliales primaires et immortalisées. (A) Augmentation de l’absorption de BODIPY-C12 en fonction du temps et de la concentration dans les HUVEC après des incubations de 1 min, 5 min et 10 min à 0,5 μM, 1 μM et 2 μM de BODIPY-C12 complexés à 0,25 μM, 0,5 μM et 1 μM de BSA sans FA, respectivement. (B) Les cellules EA.hy926 ont montré une absorption similaire de BODIPY-C12 en fonction du temps et de la dose dans des conditions identiques. L’intensité moyenne de la fluorescence a été normalisée en fonction des noyaux colorés à Hoechst (nombre de cellules) et des témoins sans BODIPY. L±'analyse statistique a été effectuée à l’aide de l’ANOVA à deux facteurs pour évaluer les effets du temps, de la concentration et de leur interaction, suivie du test a posteriori de Tukey pour les comparaisons multiples. Des effets principaux significatifs ont été observés pour le temps (p < 0,0001), la concentration (p < 0,0001) et leur interaction (p = 0,0443). Les comparaisons par paires statistiquement significatives identifiées par le test de Tukey sont indiquées sur le graphique à barres comme suit : *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 et ****p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Validation du dosage à l’aide de témoins positifs et négatifs dans EA.hy926. (A) Un traitement au lactate de 1 h (0 mM, 5 mM, 20 mM) a augmenté l’absorption de BODIPY-C12 de manière dose-dépendante. (B) Un traitement 3-HIB de 1 h (0 mM, 5 mM, 20 mM) a également augmenté l’absorption de l’AF. (C) Un traitement au niclosamide de 30 minutes (1 μM) a significativement supprimé l’absorption de BODIPY-C12 par rapport au témoin du véhicule (DMSO). L’intensité moyenne de la fluorescence a été normalisée en fonction des noyaux colorés à Hoechst (nombre de cellules) et des témoins sans BODIPY. Les données sont présentées sous forme de ± moyenne SD. 2 μM BODIPY-C12 (complexé à 1 μM de BSA sans acides gras) a été incubé pendant 5 min pour toutes les expériences. Les statistiques pour (A) et (B) ont été déterminées à l’aide de l’ANOVA à un facteur avec le test de Dunnett pour les comparaisons multiples, et pour C à l’aide du test T bilatéral non apparié de Student. p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Validation du dosage à l’aide de BODIPY-C16 dans les HUVEC. (A) Traitement au lactate (0 mM, 10 mM, 20 mM pendant 1 h) augmentant l’absorption de BODIPY-C16 de manière dose-dépendante. (B) Le traitement au niclosamide (1 μM pendant 1 h) a significativement réduit le signal BODIPY-C16 par rapport au témoin traité par véhicule. L’intensité moyenne de la fluorescence a été normalisée en fonction des noyaux colorés à Hoechst (nombre de cellules) et des témoins sans BODIPY. Les données sont présentées sous forme de ± moyenne SD. 2 μM BODIPY-C16 (complexé à 1 μM de BSA sans acides gras) a été incubé pendant 5 min pour toutes les expériences. Les statistiques de (A) ont été déterminées à l’aide de l’ANOVA à un facteur avec le test de Dunnett pour les comparaisons multiples, et pour B à l’aide du test T bilatéral non apparié de Student. *p < 0,05, ***p < 0,001 et ****p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

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Ce test offre une méthode rapide, quantitative et rentable pour mesurer l’absorption de FA dans les CE à l’aide d’un format à plaque de 96 puits et d’analogues fluorescents à longue chaîne de FA. En incorporant à la fois des contrôles positifs et négatifs et en validant les CE primaires (HUVECs) et immortalisées (EA.hy926), ce protocole démontre sa robustesse, sa reproductibilité et sa large applicabilité.

Les analyses basées sur la fluorescence ont permis de découvrir les régulateurs paracrines du transport des lipides endothéliaux, comme mentionné précédemment 4,5,7. Ces exemples montrent comment un système standardisé peut continuer à élucider de manière fiable la régulation du transport des lipides induite par les métabolites dans un cadre in vitro contrôlé. Le protocole décrit ici établit des paramètres clés pour des mesures fiables de l’absorption des FA, y compris l’utilisation de BODIPY-C12 et BODIPY-C16 à des concentrations multiples (0,5 à 2 μM) et des temps d’incubation multiples (1 min, 5 min et 10 min). Il a également détecté efficacement une augmentation de l’absorption en réponse au 3-HIB et au lactate, ainsi qu’une réduction de l’absorption après un traitement par le niclosamide, confirmant à la fois sa sensibilité et sa gamme dynamique. Bien qu’optimisé ici pour les CE, ce test peut être facilement adapté à d’autres types de cellules tels que les adipocytes, les myotubes ou les hépatocytes en ajustant les ratios BODIPY : BSA et les conditions de traitement. Il peut également être modifié pour l’imagerie de cellules vivantes à l’aide de plaques compatibles ou adapté dans un format de chasse d’impulsions pour évaluer la rétention, le métabolisme ou l’efflux intracellulaires des FA.

Par rapport à d’autres approches, cette méthode offre des avantages distincts : elle est évolutive, quantitative et adaptable à différentes longueurs de chaîne AF. De plus, il est rentable, n’implique qu’une poignée d’étapes et ne nécessite pas d’instruments plus complexes qu’un lecteur de microplaques ordinaire, ce qui permet à de nouveaux utilisateurs, y compris des étudiants, de maîtriser rapidement ce protocole. Enfin, contrairement aux méthodes basées sur la microscopie qualitative ou aux colorants finaux comme Oil Red O, qui reflètent le contenu lipidique cumulé, ce protocole capture l’absorption de l’AF en temps réel sans nécessiter de fixation ou de lyse.

Néanmoins, plusieurs limites sont à noter. L’utilisation d’un système de culture statique 2D ne récapitule pas entièrement la complexité physiologique de l’environnement vasculaire. Des facteurs clés tels que le stress de cisaillement ou la lipolyse médiée par LPL, ainsi que les interactions endothéliales-parenchymateuses, sont absents de ce modèle simplifié. Les systèmes avancés, tels que les co-cultures 3D microfluidiques ou organoïdes, imitent mieux l’architecture et la signalisation in vivo, bien qu’ils nécessitent une expertise technique et une infrastructure accrues16,17. Par exemple, les bioréacteurs microfluidiques fournissent un environnement dans lequel les CE peuvent imiter la formation de microvascularisation et interagir avec d’autres types de tissus, ce qui permet aux chercheurs de modéliser la dynamique paracrine dans un cadre plus physiologique18. De plus, des travaux récents ont montré que des systèmes spécialisés peuvent être développés pour réaliser de l’imagerie fluorescente en direct dans des cultures d’hydrogel 3D19. De telles avancées permettent d’être confiant dans le fait que ce test pourrait un jour être adapté à des systèmes de culture cellulaire plus représentatifs sur le plan physiologique, mais qu’une optimisation devrait être effectuée.

En résumé, ce test représente une plate-forme flexible, accessible et reproductible pour étudier l’absorption cellulaire des FA dans diverses conditions. Bien qu’il soit mieux adapté aux études mécanistes in vitro , les connaissances acquises grâce à ce système pourraient éclairer les travaux futurs en utilisant des modèles plus pertinents sur le plan physiologique du transport des lipides endothéliaux.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs ont déclaré qu’il n’existe aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Tanisha Choudhury a été financée par une bourse de recherche d’été de premier cycle de l’Office for Undergraduate Research de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill. Boa Kim a été soutenu par NHLBI (R56HL162660) et AHA (24CDA1264317). Ayon Ibrahim a été soutenu par le Fonds de recherche de la faculté de l’Union College.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
3-hydroxyisobutyrate (3-HIB)Cayman Chemicals26105Contrôle positif, concentration finale de 5 ou 20 mM
Microplaque de polystyrène noire à fond transparent à 96 puitsSigma-AldrichCLS3603-48EAPour analyser les cellules de placage
BODIPY FL C12 (Bodipy-FA)Thermo Fisher ScientificD3822Acide gras fluorescent vert à chaîne longue
BODIPY FL C16 (Bodipy-FA)Thermo Fisher ScientificD3821Acides gras verts fluorescents très longue
Solution d’albumine sérique bovineSigma-AldrichA9205-50MLUtilisé pour préparer le complexe Bodipy :BSA
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma-AldrichD2650Solvant pour les actions pharmaceutiques
Réservoirs de pipet jetablesVWR89094-680Contient les différentes solutions à pipeter sur les cellules
Dulbecco » s Modified Eagle s MediumCorning Life Sciences10-013-CVSupports pour cellules EA.hy926
Cellules EA.hy926ATCCCRL-2922  ;Lignée hybride cellulaire endothéliale immortalisée
EGM-2 Milieu de croissance cellulaire endothéliale-2 BulletKitLonzaCC-3162Médias pour les HUVECs
Sérum fœtal-bovin (FBS) & nbsp ;VWR97068-085Supplément de 10 % en EGM-2 et DMEM
Lecteur de microplaques à fluorescenceDiversN/ATout lecteur de microplaques capable de mesurer la fluorescence
Solution de gélatineSigma-AldrichG1393-100mlUtilisé pour recouvrir les plaques à 0,1 % de concentration de travail
Hoechst 33342 SolutionSciences de la vie62249Coloration nucléaire pour la normalisation cellulaire (4 & mu ; M)
Cellules endothéliales des veines ombilicales humaines (HUVEC)LonzaC2519ACellules endothéliales humaines primaires
Pipette multicanalVWR76627-768Pour la pipetage dans une plaque à 96 puits
Niclosamide   ;Millipore SigmaN3510-50GTémoins négatif, 1 & mu ; M  ; Concentration finale
PBS, avec du calcium et du magnésiumFisher Scientific21031CVUtilisé pour préparer des traitements et comme tampon de lavage (avec BSA)
PBS, sans calcium ni magnésiumGenesee Scientific25-508Pour la dilution de la gélatine, la coloration Hoechst et les lavis généraux
Pénicilline/StreptomycineThermo Fisher Scientific15140122supplément de 1 % dans l’EGM-2 et le DMEM
Sodium L-lactateSigma-AldrichL7022-5GContrôle positif, concentration finale de 5 ou 20 mM
Solution Trypan BlueSigma-AldrichT8154-20MLUtilisé à 0,08 % pour éteindre la fluorescence extracellulaire
Systèmes de filtres à vide, membrane PES de 500 ml, 0,45 & micro ; mGenClone25-227Stériliser la solution de gélatine

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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