Une analyse R conviviale et puissante des ensembles de données à grande échelle

Avec la disponibilité accrue de grands ensembles de données dans le domaine scientifique, il est important de développer des outils conviviaux pour permettre aux chercheurs d’analyser rapidement ces grands ensembles de données avec précision et facilité. L’un des types de grands ensembles de données communs provient de l’utilisation du gène de la luciférase comme rapporteur, ce qui a permis un examen facile, continu et non invasif de l’expression des gènes dans les cellules et les organismes vivants. L’automatisation de l’enregistrement de la luminescence a transformé la mesure de la luminescence de la luciférase et a conduit à une expansion de la collecte de données, en particulier dans le champ de l’horloge circadienne ^1,2. À l’aide de microplaques à 96 puits et d’un lecteur automatique de plaques avec un empileur, des milliers d’échantillons exprimant le gène de la luciférase peuvent être analysés individuellement en séries chronologiques, parfois à des intervalles d’une heure pendant des jours, dans une seule expérience. De telles expériences à haut débit ont abouti à la production de grands ensembles de données que les expériences traditionnelles d’expression génique utilisant la collecte d’échantillons à la main, suivie d’un traitement de l’ARN, ne pourraient pas atteindre. Il est important d’analyser de tels ensembles de données en temps opportun, mais cela peut s’avérer difficile.

Bien qu’il existe une pléthore d’outils pour analyser les données pour la rythmique, de nombreux outils analysent les tests basés sur le comportement animal plutôt que l’expression rapporteuse de luminescence 3,4,5,6,7 (tableau supplémentaire S1). Certains outils nécessitent que les chercheurs aient des compétences préalables en programmation informatique, telles que des compétences en Python ou un accès à MATLAB. D’autres outils nécessitent l’achat d’un logiciel, ce qui peut s’avérer coûteux. Certaines solutions pratiques gratuites sont disponibles en ligne. L’un de ces outils est BioDare2⁸, qui offre une variété de méthodes différentes pour analyser les données de rythmique. BioDare2 est un outil en ligne convivial qui nécessite une expertise informatique minimale. Les utilisateurs doivent télécharger les données saisies en ligne et télécharger les données sortantes de l’interface en ligne pour un traitement ultérieur.

Ici, nous présentons des scripts R conviviaux avec de multiples capacités pour analyser facilement des ensembles de données à grande échelle. Nous utilisons le logiciel gratuit et open-source RStudio⁹, une interface pour R et Python, pour exécuter les scripts. RStudio peut être utilisé sur divers systèmes informatiques, notamment Windows, Mac et Linux. Dans ce rapport, des instructions détaillées sont fournies pour guider les utilisateurs sur la façon d’utiliser les scripts R, en particulier dans les sections 1 et 2 du protocole. Cette méthode nécessite une intervention minimale de la part de l’utilisateur. Un débutant qui n’a pas de connaissances préalables en R et qui n’a aucune expérience en programmation sera capable d’utiliser la méthode pour analyser de grands ensembles de données à partir d’essais de luciférase ou d’autres types d’ensembles de données avec des données de séries chronologiques. Toutes les données d’entrée et de sortie sont stockées sur un ordinateur local, de sorte qu’une analyse peut être effectuée n’importe où sans restriction d’accès à Internet, une fois que tous les packages R pertinents sont téléchargés pour la première fois. Les données de sortie sont triées dans des dossiers bien organisés avec des résultats prêts à être traités pour les publications. Des analyses statistiques sont également incluses dans le produit afin de fournir une évaluation rapide des différences entre les échantillons. Ainsi, la méthode R pourrait fournir une solution facile et puissante pour les chercheurs dans l’analyse de grands ensembles de données.

1. Analyse de l’horloge circadienne basée sur la luciférase

1. Dispositif expérimental pour le dosage de la luciférase
   REMARQUE : Le dosage de la luciférase est une méthode couramment utilisée pour évaluer l’activité de l’horloge circadienne en temps réel. La luminescence, émise par le rapporteur de luciférase transportée par des organismes et/ou des cellules transgéniques vivants, peut être enregistrée automatiquement, ce qui conduit à la production d’ensembles de données de séries chronologiques à grande échelle. Notre laboratoire utilise principalement des plantules d’Arabidopsis thaliana exprimant le gène de la luciférase en tant que rapporteur. Les figures 1 et 2 montrent un organigramme de la configuration expérimentale typique pour le test de la luciférase avec des plantules dans un format de 96 puits dans notre laboratoire, modifié sur la base d’une description précédente².
   1. Stérilisez les graines avec de la vapeur d’eau de Javel générée en ajoutant 3 ml de HCl à 36 % (p/p) à 100 ml d’eau de Javel domestique dans un bécher pendant 3 h. Placez le bécher dans une cloche avec un couvercle scellé, placé dans une hotte chimique. Après la stérilisation, plaquez les graines sur des plaques 1/2MS contenant 0,5 % de saccharose et 0,8 % de gélose (pH 5,7), à l’aide d’une pipette Pasteur en verre stérile, dans une armoire à flux laminaire. Recueillez les déchets chimiques dans un bocal avec un couvercle et éliminez-les en travaillant avec le service de santé environnementale de l’établissement.
   2. Mettez les plaques à 4 °C pendant 2 jours avant de les déplacer dans une chambre de culture tissulaire avec un cycle de lumière de 12 h et 12 h de lumière sombre (LD).
   3. Laissez pousser les semis pendant 4 jours en LD.
   4. Transférer les semis dans une plaque à 96 puits ; chaque puits contenait 180 μL de milieu de dosage (1/2MS, 0,5 % de saccharose, 0,4 % de gélose, 0,25 mM de luciférine). Placez les plaques pendant 1 jour en LD suivi d'1 jour en 24 h de lumière constante (LL).
   5. Ajoutez des traitements ou une solution fictive aux puits et enregistrez la luminescence à des intervalles de 1 h pendant 5 à 7 jours dans LL. Réglez la lentille du filtre d’émission à 3 600 pour le gain et le temps de l’intervalle de mesure à 1 s.
      REMARQUE : L’heure de début de l’enregistrement peut être à tout moment. Cependant, comme le script R ne prend que des entiers (nombres entiers), les intervalles d’enregistrement doivent être un nombre entier. Par exemple, un intervalle de 1 h est autorisé, mais un intervalle de 15 minutes n’est pas autorisé pour le script R.
   6. À la fin de l’enregistrement, prenez une photo de la plaque pour enregistrer la croissance des plantules.
   7. Enregistrez les données brutes sous forme de fichier CSV pour l’analyse R, à l’aide de la fonction d’enregistrement avec le logiciel d’analyse de données pour le lecteur de plaques.
2. Explication par étapes de l’analyse R des données circadiennes basées sur la luciférase
   REMARQUE : Cette analyse R utilise le script RDossier supplémentaire 1(LUC_2025.R), développé pour l’analyse des données circadiennes, et le fichier d’entréeDossier supplémentaire 2(NO7.csv). Le script R ainsi que le fichier d’entrée sont accessibles au public via la plateforme de dépôt en ligne Github (https://github.com/elvenfire29/Circadian-Luciferase-Analysis).
   1. Téléchargez le logiciel RStudio compatible avec le système informatique ^9,10.
   2. Téléchargez les packages algorithmiques RStudio requis par le fichier supplémentaire 1 (LUC_2025.R) : MetaCycle¹¹ : algorithme ARSER¹² du package MetaCycle, ggplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶, filesstrings¹⁷, circular¹⁸, AICcmodavg¹⁹ et broom²⁰.
      REMARQUE : Voir aussi le haut du script R pour la liste des paquets.
   3. Modifier l’entrée utilisateur I (en fonction d’un ensemble de données spécifique sur un ordinateur local, y compris le répertoire de travail, le nom du fichier d’entrée, les étiquettes des traitements et l’heure de début relative du test.
      REMARQUE : Les étapes 1.2.1 et 1.2.2 ne doivent être effectuées qu’une seule fois. après quoi, la console de l’interface RStudio est prête à prendre en charge les entrées de l’utilisateur, avec des modifications pour chaque nouvelle analyse. La section Saisie de l’utilisateur comporte deux parties (figure supplémentaire S1).
      1. Sélectionnez le répertoire de travail. Indiquez l’emplacement du fichier d’entrée. Le même dossier sera l’emplacement des fichiers de sortie.
      2. Sélectionnez le fichier d’entrée, un fichier CSV correctement formaté pour le script R (Figure 2B). Plus précisément, la rangée du haut contient la série chronologique, et la première colonne contient les positions individuelles des échantillons sur une plaque de 96 puits.
         REMARQUE : Un exemple d’un tel fichier CSV d’entrée se trouve dans le Fichier supplémentaire 2 (NO7.csv).
      3. Nommez les échantillons et/ou les traitements. Comme cette analyse est utilisée pour des données obtenues à partir de 96 puits avec une trajectoire temporelle, concevez les expériences comme 8 répétitions par traitement pour un total de 12 traitements par boîte, ou comme 12 répétitions par traitement pour un total de 8 traitements par plaque. Assurez-vous d’entrer le bon nombre d’échantillons, soit 8 ou 12, car le nombre d’échantillons compte ; Si le nombre d’échantillons n’est pas de 8 ou 12, le code ne s’exécutera pas. Cependant, s’il y a des rangées de puits vides, il suffit de les lister comme tels dans l’espace pour les noms de traitement, par exemple, en les nommant comme vides 1, vides 2...
         REMARQUE : Pour les exemples de noms, il faut éviter d’utiliser des barres obliques inverses ou des symboles similaires car ils peuvent causer des problèmes de nom de fichier. De plus, il faut également éviter d’utiliser « NA » comme étiquette lors de la sélection d’utiliser l’ANOVA dans l’entrée utilisateur II. Tous les traitements portant exactement le même nom seront combinés en un grand groupe de traitement.
      4. Indiquez l’heure de début relative du dosage. Pour une journée donnée de 24 h, l’aube subjective est le moment où la lumière de la chambre est allumée pendant un cycle normal de lumière/obscurité. Par exemple, si la lumière est allumée à 7 heures du matin, considérez cette heure comme l’heure circadienne 0. Si un test de luciférase commence à 9 heures, le moment du test est au temps circadien 2 ; Entrez 2 comme heure de début relative.
         REMARQUE : L’heure de début relative doit être un nombre entier et ne peut pas être négative. Cela affectera la lecture de phase des échantillons.
   4. Modifiez les options de User Input II en fonction de vos besoins spécifiques.
      REMARQUE : Les instructions ci-dessous fournissent une explication plus détaillée des sections Entrée de l’utilisateur et un guide étape par étape pour effectuer les modifications.
      1. Incluez des graphiques : courbes de luminescence, tracés pour la période, la phase et l’amplitude par génotype et par traitement.
      2. Utilisez le test ANOVA avec le HSD de Tukey pour comparer les traitements en fonction de leur période, de leur phase et de leur amplitude. Choisissez une commande pour la sortie du test ANOVA ; spécifiez le contrôle pour le test ANOVA ou laissez l’option vide pour utiliser chaque traitement comme contrôle dans la comparaison par paires. Vous pouvez également choisir de numéroter les fichiers de sortie ANOVA pour une référence et une organisation plus rapides.
      3. Utilisez un test t pour comparer les traitements en fonction de leur période, de leur phase et de leur amplitude. Choisissez si le test t doit être une comparaison par paires ; Si un test T par paires est sélectionné, indiquez si les données sont appariées. Choisissez une commande pour le test t ; Spécifiez la commande pour le test t ou laissez l’option vide pour utiliser chaque traitement comme contrôle. Choisissez de numéroter ou non les fichiers de sortie du test t pour une référence et une organisation plus rapides.
         REMARQUE : Cela ne doit être utilisé que pour comparer deux traitements à la fois, tels que deux lignées du même génotype avec SA ou Mock ajouté. Les valeurs p indiquées ne sont pas ajustées pour tenir compte de plusieurs comparaisons avec la même ligne.
      4. Choisissez d’arrondir ou non les points temporels. Si les points temporels ne sont décalés que d’une minute ou deux, arrondissez à l’heure la plus proche et utilisez cette analyse.
         REMARQUE : Ce code calcule la période, la phase et l’amplitude à l’aide de la méthode ARS¹². Cette méthode nécessite une série chronologique cohérente en heures pour s’exécuter.
      5. Selon la façon dont le lecteur de plaques enregistre les puits, modifiez la façon dont l’entrée est lue. Choisissez soit la liste standard des données des puits par A1, A2, A3... ou celle des puits répertoriés par A1, B1, C1...
   5. Exécutez l’analyse en cliquant simplement sur le bouton Source dans le coin supérieur droit de la console.
      REMARQUE : L’analyse prend moins de 1 min. La sortie de l’analyse R apparaîtra automatiquement dans le même dossier de fichiers que le jeu de données d’entrée.
   6. Afficher la sortie : Le dossier de sortie contient plusieurs documents et sous-dossiers pour fournir une analyse complète, y compris des informations statistiques sur la période, la phase et l’amplitude moyennes pour les répétitions de chaque génotype et/ou traitement.
      REMARQUE : Pour le fichier d’entrée Fichier supplémentaire 2 (NO7.csv), une liste des documents de sortie générés par le script Fichier supplémentaire 1 (LUC_2025.R) dans la section 1 du protocole est décrite dans le Tableau 1 et peut être facilement visualisée avec l’arborescence de la figure supplémentaire S2.

2. Dosage des ROS à base de luminol

1. Dispositif expérimental pour le dosage des ROS
   1. Coupez des disques foliaires de 4 mm de diamètre de la quatrième à la septième feuille de plantes âgées de 25 jours à l’aide d’un perforateur à biopsie.
   2. Faites flotter les disques foliaires avec le côté poilu vers le haut sur 100 μL d’eau stérile dans une plaque à 96 puits.
   3. Couvrez la plaque d’une feuille d’aluminium propre et placez-la dans une chambre de croissance LD pendant la nuit.
   4. Remplacer l’eau par 100 μL de solution de luminol (300 μM dans un tampon MOPS de 10 mM avec un pH de 7,4 et 1 μM flg22 ou un autre éliciteur). Utilisez une solution fictive à la place de flg22 comme contrôle.
   5. Commencez immédiatement à enregistrer les lectures de luminescence toutes les minutes pendant 40 à 60 minutes.
2. Explication par étapes de l’analyse R des données ROS
   REMARQUE : Cette analyse R utilise Rstudio, le script R,  le fichier supplémentaire 3 (ROS_2025.R) et les fichiers d’entrée Fichier supplémentaire 4 (ROS_flg22.csv) ou Fichier supplémentaire 5 (ROS_elf26.csv). Le script R ainsi que le fichier d’entrée Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) sont accessibles au public via la plateforme de dépôt en ligne Github (https://github.com/elvenfire29/ROS-Luminol-Analysis)
   1. Téléchargez les paquets RStudio : gplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶ et filesstrings¹⁷.
      REMARQUE : Les étapes 2.2.1 ne doivent être effectuées qu’une seule fois. Pour aider les utilisateurs à adapter chaque analyse à un ensemble spécifique de données sur l’ordinateur, une section appelée « Entrée de l’utilisateur » a été créée pour permettre aux utilisateurs d’indiquer des paramètres spécifiques pour leurs expériences (figure supplémentaire S3).
   2. Modifiez l’entrée utilisateur I en fonction d’un ensemble de données spécifique sur un ordinateur local, y compris le répertoire de travail, le nom du fichier d’entrée, les étiquettes des traitements et l’heure de début relative du test.
      1. Sélectionnez le répertoire de travail. Indiquez l’emplacement du fichier d’entrée. Le même dossier sera l’emplacement des fichiers de sortie.
      2. Sélectionnez le fichier d’entrée, un fichier CSV correctement formaté pour le script R (Figure 2B). Plus précisément, la rangée du haut contient la série chronologique, et la première colonne contient les positions individuelles des échantillons sur une plaque de 96 puits.
         REMARQUE : Un exemple d’un tel fichier CSV d’entrée se trouve dans le matériel supplémentaire, le fichier supplémentaire 4 (ROS_flg22.csv) ou le fichier supplémentaire 5 (ROS_elf26.csv).
      3. Nommez les échantillons et/ou les traitements. Comme cette analyse est utilisée pour des données obtenues à partir de 96 puits avec une trajectoire temporelle, concevez les expériences comme 8 répétitions par traitement pour un total de 12 traitements par boîte, ou comme 12 répétitions par traitement pour un total de 8 traitements par plaque. S’il y a des rangées de puits vides, il suffit de les lister comme tels dans l’espace réservé aux noms de traitement, par exemple, en les nommant comme vides 1, vides 2...
         REMARQUE : Il est important d’entrer le bon nombre d’échantillons, soit 8 ou 12, car le nombre d’échantillons compte. Si le nombre d’échantillons n’est pas de 8 ou 12, le code ne s’exécutera pas. Pour les exemples de noms, évitez d’utiliser des barres obliques inverses ou des symboles similaires, car ils peuvent causer des problèmes de noms de fichiers. Évitez également d’utiliser « NA » comme étiquette lorsque vous choisissez d’utiliser l’ANOVA dans l’entrée utilisateur II. Contrairement au script du Fichier supplémentaire 1 (LUC_2025.R), les traitements portant le même nom ne se combinent pas en un seul groupe dans ce script du Fichier supplémentaire 3 (ROS_2025.R).
   3. Modifiez les options de User Input II en fonction des besoins spécifiques de l’utilisateur.
      REMARQUE : L’exemple d’entrée utilisateur peut être vu dans la figure supplémentaire S3.
      1. Utilisez le test ANOVA avec le HSD de Tukey pour comparer les sommes de luminescence du traitement.
      2. Utilisez un test t bilatéral pour comparer les données de seulement deux traitements à la fois.
         REMARQUE : Les valeurs p indiquées ne sont pas ajustées pour tenir compte de plusieurs comparaisons avec la même ligne.
      3. Tracez graphiquement les courbes de fluorescence et un graphique à barres comparant la somme totale de la fluorescence. Ajoutez l’écart-type ou l’erreur-type de la moyenne aux graphiques.
      4. Selon la façon dont le lecteur de plaques enregistre les puits, modifiez la façon dont l’entrée est lue. Soit utiliser la liste de données standard des puits par A1, A2, A3... ou celle des puits répertoriés par A1, B1, C1...
3. Exécutez l’analyse en cliquant simplement sur le bouton Source dans le coin supérieur droit de la console.
   REMARQUE : L’analyse prend moins de 1 min. La sortie de l’analyse R apparaîtra automatiquement dans le même dossier de fichiers que le jeu de données d’entrée.
4. Afficher la sortie : le dossier de sortie comporte plusieurs documents et sous-dossiers pour fournir une analyse complète.
   REMARQUE : Pour le fichier d’entrée Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv), une arborescence des documents de sortie générés par le script Supplemental File 3 (ROS_2025.R) décrit dans la section 2 du protocole est illustrée dans la figure supplémentaire S4.

Étude de cas 1. Le test de luminescence pour l’activité de l’horloge circadienne avec des plantules d’Arabidopsis

Nous avons précédemment montré que le gène GLYCINE-RICH RNA-BINDING PROTEIN 7 (GRP7) était contrôlé par la protéine de l’horloge maîtresse CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1 (CCA1) et que l’expression circadienne de GRP7 est importante pour son rôle dans la défense des plantes, en utilisant des plantes transgéniques Col-0 exprimant le rapporteur de la luciférase sous le contrôle du promoteur GRP7 de type sauvage (pGRP7wt :LUC)21. Nous avons analysé les activités de l’horloge circadienne de ces plantes transgéniques avec la plante témoin CCA1 :LUC/Col-0, en utilisant le script R nommé LUC_2025.R (Supplemental File 1 dans la section 1 du protocole).

Le fichier d’entrée nommé NO7.csv (Fichier supplémentaire 2) contient des lectures de luminescence pour sept raies indépendantes pGRP7wt :LUC et le contrôle CCA1 :LUC/Col-0 (Fichier supplémentaire 2 (NO7.csv)). Après l’exécution du script, le sous-dossier de sortie appelé NO7 output sera généré dans le même dossier que le fichier d’entrée NO7.csv (Supplemental File 2 (NO7.csv)). Les fichiers du dossier de sortie NO7 sont décrits dans le Tableau 1 et peuvent être facilement visualisés avec l’arborescence de la figure supplémentaire S2. Les valeurs du dossier de sortie NO7 ont été traitées pour réaliser les figures 3 et 4. La figure 3 montre que le rapporteur CCA1 :LUC a montré une amplitude de 3 000 RLU, une période de 23,5 h et une phase de 3,5 h. Ces paramètres d’horloge sont largement cohérents avec les rapports précédents22,23. Un modèle d’expression différent a été observé pour les lignes pGRP7wt :Luc. Alors que toutes les lignées pGRP7wt :LUC semblaient être similaires en période et en phase, il y avait des différences dans les valeurs d’amplitude de ces lignes, probablement en raison de l’effet de position des transgènes dans les chromosomes. Ces observations ont été confirmées lorsque les paramètres de période, d’amplitude et de phase ont été calculés via le script R (Figure 4). Pour valider cette analyse, le même ensemble de données a été réanalysé à l’aide de BioDare2, une plateforme en ligne gratuite d’analyse des données circadiennes8. Les résultats de l’analyse R étaient comparables à ceux obtenus de l’algorithme FFT-NLLS (NLLS) 8,24 de BioDare2 (Figure 4).

Étude de cas 2. Le test de luminescence pour l’activité de l’horloge circadienne avec des cellules de mammifères
Le script R LUC_2025.R (Fichier supplémentaire 1) a ensuite été utilisé pour analyser l’activité de l’horloge circadienne affichée par les cellules de mammifères25. La lignée cellulaire U2 OS exprimant un rapporteur de l’horloge circadienne est une lignée cellulaire modèle couramment utilisée pour évaluer les activités de l’horloge circadienne des mammifères26,27. Nous avons réanalysé les données de séries temporelles générées avec des cellules U2 OS exprimant le rapporteur Per2d :Luc cultivé dans une plaque de 96 puits. Les cellules ont été traitées avec des molécules d’ARNi ciblant des gènes spécifiques. La figure 5 montre que les cellules témoins négatives, qui n’ont pas été traitées avec des ARNsi, ont montré une période de 23,3 h, une phase de 2,8 h et une amplitude de 184,8 RLU. Comme prévu, le siRNA ciblant le gène CRY2 a considérablement atténué l’amplitude et affecté la période et la phase du rapporteur. Les gènes PSMD4 et PSMD7 codent pour des protéines qui font partie du composant de la paupière du protéasome 26S pour la dégradation des protéines. Conformément au rapport précédent25, l’analyse R montre que l’élimination de PSMD4 ou PSMD7 par leurs siRNA respectifs n’affecte pas les paramètres de l’horloge. Ainsi, ce script R est facilement applicable à différents systèmes expérimentaux pour l’étude de l’horloge circadienne.

Étude de cas 3. Le test ROS pour une réponse de défense
En plus des grands ensembles de données provenant d’analyses d’horloge circadienne luminescente, le script R peut être adapté pour analyser d’autres types de données. Nous présentons ici l’une de ces applications pour quantifier les espèces réactives de l’oxygène (ROS). Les plantes sont connues pour avoir développé diverses stratégies pour lutter contre l’invasion d’agents pathogènes. L’une des stratégies consiste à reconnaître les molécules non-soi d’un agent pathogène et à activer par la suite les réponses immunitaires innées. L’une de ces réponses immunitaires précoces est une explosion de ROS, qui se produit en quelques minutes lorsqu’un hôte rencontre une molécule non soi-même. Un test ROS typique a été réalisé avec une plaque de 96 puits, contenant 12 disques foliaires par génotype et par traitement (section 2 du protocole). Ici, deux molécules élicitrices courantes, flg22, un peptide de 22 acides aminés dérivé de la région conservée des protéines de flagelle bactérienne28, et elf26, un peptide de 26 acides aminés du facteur d’élongation Tuprotéine 29, ont été utilisées pour induire l’explosion des ROS. Le script, Supplemental File 3 (ROS_2025.R), a été développé pour l’analyse des données ROS. Deux fichiers CVS des analyses ROS, le fichier supplémentaire 4 (ROS_flg22.csv) et le fichier supplémentaire 5 (ROS_elf26.csv), qui ont été convertis au format de l’analyse R, peuvent être téléchargés à partir de la section Matériel supplémentaire. Après l’analyse R, les dossiers de sortie doivent être générés dans le même dossier que chaque fichier d’entrée dans son propre ordinateur, contenant les courbes de rafale des ROS et les valeurs totales des ROS pendant la durée du test, ainsi que des analyses statistiques (figure supplémentaire S4). Les données ont été traitées pour réaliser la figure 6. Les résultats présentés ici sont similaires à ceux publiés, qui ont été traités manuellement30.

Figure 1 : Organigramme du dosage de la luciférase pour l’analyse R. Des plantules exprimant un rapporteur de luciférase piloté par un promoteur d’horloge ont été stérilisées et cultivées sur un milieu 1/2 MS en LD pendant 4 jours. Les plantules ont été transférées sur des plaques à 96 puits contenant 180 μL de milieu 1/2 MS contenant de la D-luciférine. Chaque puits contenait un semis. Après 1 jour en LD suivi d'1 jour en LL, la luminescence a été enregistrée avec un lecteur de plaques. Les plantules sur une plaque ont généralement été enregistrées pour la luminescence dans LL à des intervalles de 1 h pendant 5 à 7 jours. Après l’enregistrement, des plaques ont été photographiées pour évaluer la croissance des semis et les données brutes ont été enregistrées sous forme de fichier CSV pour l’analyse R. Abréviations : LD = 12 h clair/12 h foncé ; LL = lumière constante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Organigramme de l’acquisition des données de luminescence et de l’analyse R. ( A) Une procédure en cinq étapes est décrite pour l’analyse de l’horloge circadienne à l’aide du script R. Étape 1. Mettre en place des expériences soit sur 8 ou 12 plants par génotype et/ou par traitement ; Étape 2. Enregistrer la luminescence dans LL à 1 h d’intervalle pendant 5 à 7 jours ; Étape 3. Obtenir et formater des données dans un fichier CSV ; Étape 4. Analyser les données à l’aide de R ; et l’étape 5. Afficher les données de sortie. L’heure de début de l’enregistrement peut être à tout moment. Cependant, comme le script R ne prend que des entiers (nombres entiers), les intervalles d’enregistrement doivent être un nombre entier. (B) Capture d’écran d’un fichier CSV d’entrée correctement formaté pour le script R. Le fichier d’entrée original, NO7.csv, se trouve dans le fichier supplémentaire 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Expression circadienne de pGRP7wt :LUC chez les plantes transgéniques. Les traces de luminescence de pGRP7wt :LUC sont montrées. Les barres sous l’axe des x indiquent le jour (barres ouvertes) et la nuit (barres grises) subjectives. La trace de luminescence de chaque génotype est en moyenne de 12 répétitions. Les barres d’erreur n’étaient pas affichées en raison du grand nombre de courbes. Abréviation : RLU = Unités de luminescence relatives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Comparaison des données de sortie du script R et de BioDare2. Le même ensemble de données montré dans la figure 3 a été analysé par le script R et par BioDare2 pour les paramètres de l’horloge circadienne, l’amplitude, la période et la phase. Les données représentent la moyenne ± MEB (n=12). Des lettres différentes indiquent une différence significative entre les échantillons (P < 0,05 ; ANOVA à un facteur avec test HSD de Tukey post hoc). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Analyse de l’activité de l’horloge circadienne avec des cellules de mammifères. Les données de séries chronologiques générées avec des cellules U2 OS exprimant le rapporteur Per2dLuc cultivé sur une plaque de 96 puits en DD ont été décrites précédemment 25. Des molécules de siRNA ciblant CRY2, PSMD4 ou PSMD7 ont été utilisées pour traiter les cellules. (A) Traces de luminescence. ( b) Amplitude, période et phase de Per2d :Luc. Les données représentent la moyenne ± SEM (n = 3). Différentes lettres dans le panneau (B) indiquent une différence significative entre le témoin négatif et un échantillon traité par siRNA (P<0,05 ; ANOVA à un facteur avec test HSD de Tukey post hoc). Abréviation : RLU = unité de luminescence relative. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Analyse de l’éclatement des ROS par R. Les plantules ont été enregistrées pour leur unité de luminescence relative immédiatement après avoir été traitées avec 1 μM flg22 (à gauche) ou 1 μM elf26 (à droite). (A) Traces de luminescence moyennes à partir de 12 plantules par génotype (n = 12) dans un cours temporel après l’élicitation. Les valeurs moyennes par génotype et par traitement font partie de la sortie R. (B) Nombre moyen de luminescence totale pour chaque génotype avec le traitement flg22 ou elf26. Les données représentent la moyenne ± SEM (n = 12). Des lettres différentes indiquent une différence significative entre les échantillons (P < 0,05 ; ANOVA à un facteur avec test HSD de Tukey post hoc). Abréviation : RLU = unité de luminescence relative. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Liste des documents de sortie de l’analyse R. Il s’agit d’une liste des documents de sortie générés par le script LUC_2025.R (Fichier supplémentaire 1) et le NO7.csv du fichier d’entrée (Fichier supplémentaire 2).

Figure supplémentaire S1 : Captures d’écran de l’entrée I et de l’entrée II dans la section 1 du protocole. L’entrée utilisateur I doit être modifiée pour adapter l’analyse à un ensemble de données spécifique sur un ordinateur local. Les modifications apportées à l’entrée utilisateur II sont facultatives, en fonction du paramètre expérimental. Il est important de noter que le script Supplemental File 1 (LUC_2025.R) s’attend à ce que tous les puits soient présents dans le fichier et pas seulement les puits sélectionnés ou utilisés. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire S2 : Arborescence des documents de sortie. Ce résultat a été généré à l’aide du script LUC_2025.R (fichier supplémentaire 1) et du fichier d’entrée NO7.csv (fichier supplémentaire 2). Le script LUC_2025.R génère un dossier de sortie basé sur le nom du fichier d’entrée. Pour plus d’informations sur les fichiers de sortie, reportez-vous au Tableau 1. Les boîtes représentent des dossiers. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire S3 : Captures d’écran pour l’entrée utilisateur I et l’entrée utilisateur II dans la section 2 du protocole. Le script Fichier supplémentaire 3 (ROS_2025.R) utilise le même format d’entrée général que le script Fichier supplémentaire 1 (LUC_2025.R). L’entrée utilisateur I doit être modifiée pour adapter l’analyse à un ensemble de données spécifique sur un ordinateur local. Les modifications apportées à l’entrée utilisateur II sont facultatives, en fonction du paramètre expérimental. Il est important de noter que le script Supplemental File 3 (ROS_2025.R) s’attend à ce que tous les puits soient présents dans le fichier et pas seulement les puits sélectionnés ou utilisés. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire S4 : Arborescence des documents de sortie. Cette sortie a été générée à l’aide du script ROS_2025.R (fichier supplémentaire 3) et du fichier d’entrée ROS_flg22.csv (fichier supplémentaire 4). Le script ROS_2025.R génère un dossier de sortie basé sur le nom du fichier d’entrée. Dans ce dossier se trouve un fichier pour le nombre total de ROS et un fichier pour les graphiques. Il existe également des sous-dossiers pour les données PRISM et graphiques, le test ANOVA et les tests t. Les boîtes représentent des dossiers. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Tableau supplémentaire S1 : Une liste des outils bioinformatiques disponibles pour l’analyse des données circadiennes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 1 : LUC_2025.R. Il s’agit du script R utilisé pour analyser les données de l’horloge circadienne. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 2 : NO7.csv. Il s’agit du fichier d’entrée contenant un exemple de données d’horloge circadienne. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 3 : ROS_2025.R. Il s’agit du script R utilisé pour l’analyse des données ROS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 4 : ROS_fig22.csv. Il s’agit du fichier d’entrée contenant un exemple de données ROS. Les ROS ont été induits par un traitement à 1 μM flg22. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 5 : ROS_elf26.csv. Il s’agit du fichier d’entrée contenant un exemple de données ROS. Les ROS ont été induits par un traitement à 1 μM elf26. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.