Article de méthode

Évaluation de l’effet des facteurs SASP sur la prolifération des cellules cancéreuses à l’aide d’une analyse comparative de trois méthodologies distinctes

DOI :

10.3791/68883

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19 septembre 2025

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1Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Gazi University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude évalue les effets prolifératifs des facteurs de phénotype sécrétoire associés à la sénescence (SASP) des cellules HeLa sénescentes sur les cellules HeLa non sénescentes à l’aide de trois modèles in vitro avec surveillance en temps réel. Les avantages et les limites de chaque méthode ont été systématiquement comparés afin de mieux comprendre les interactions cellule-cellule dans le cancer.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules cancéreuses sénescentes induites par la chimiothérapie sécrètent également divers facteurs, appelés phénotypes sécrétoires associés à la sénescence, pour réguler leur microenvironnement extracellulaire. Des études antérieures ont rapporté que ces facteurs SASP exercent des effets paracrines néfastes sur les cellules environnantes, notamment en favorisant la prolifération, la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), l’angiogenèse et la migration. Plusieurs techniques de co-culture in vitro sont largement utilisées pour comprendre les processus cellulaires résultant de l’interaction en cultivant ensemble le même type de cellules et différents types de cellules. Ici, les effets prolifératifs potentiels des facteurs SASP sécrétés par les cellules HeLa sénescentes sur les cellules HeLa non sénescentes ont été étudiés à l’aide de trois approches in vitro complémentaires. La première approche a consisté à co-cultiver des cellules sénescentes et non sénescentes pour étudier la signalisation paracrine médiée par le SASP. Dans la deuxième approche, des milieux conditionnés prélevés sur des cellules cancéreuses sénescentes ont été concentrés et ensuite utilisés pour examiner l’impact des milieux conditionnés avec surveillance en temps réel de la prolifération. Dans la troisième méthode, des cellules sénescentes et non sénescentes ont été cultivées côte à côte pour évaluer les effets juxtacrines de SASP par contact direct de cellule à cellule. Les trois modèles expérimentaux ont systématiquement démontré que les facteurs SASP augmentaient significativement la prolifération des cellules cancéreuses non sénescentes. Notamment, la co-culture de cellules sénescentes a augmenté le taux de prolifération de 64,6 %, et les milieux concentrés conditionnés par SASP 3x ont augmenté la prolifération de plus de 50 % par rapport aux témoins. L’imagerie basée sur la fluorescence a montré une augmentation de 49,3 % du nombre de cellules positives à la GFP dans des conditions juxtacrines. Ces méthodes ont permis collectivement d’évaluer quantitativement et qualitativement les changements prolifératifs induits par les SASP. L’analyse comparative de ces approches met en évidence leurs forces et leurs limites respectives, fournissant des informations précieuses sur les effets paracrines des cellules sénescentes.

Introduction

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Dans les organismes multicellulaires, les cellules communiquent par signalisation paracrine et juxtacrine en échangeant des messages avec leur microenvironnement, influençant ainsi le comportement de l’autre. Cette communication peut se produire soit directement, par le biais de nanotubes à effet tunnel et de jonctions lacunaires, soit indirectement par la sécrétion de molécules chimiques solubles telles que des cytokines, des facteurs de croissance et des chimiokines dans la matrice extracellulaire. Ces mécanismes de signalisation jouent un rôle essentiel dans la régulation de divers processus physiologiques, y compris le développement des tissus et les réponses des cellules immunitaires, et sont également impliqués dans la pathogenèse de nombreuses maladies, telles que le cancer, le VIH, l’hypertension et la maladie d’Alzheimer1.

Dans les années 1960, Leonard Hayflick a découvert que les fibroblastes humains normaux ont une capacité limitée à se répliquer in vitro2. Cet état de prolifération cellulaire limitée qui se développe en raison du raccourcissement de la télomérase est appelé sénescence réplicative. Des études ultérieures ont révélé que diverses formes de stress cellulaire peuvent également déclencher la sénescence cellulaire. Il a été déterminé que les traitements anticancéreux courants tels que la chimiothérapie et la radiothérapie induisent également une sénescence cellulaire dans les cellules cancéreuses et stromales, appelée sénescence induite par la thérapie 3,4. La sénescence cellulaire et le vieillissement sont des processus hiérarchiquement liés ; Ils représentent des processus biologiques distincts. L’accumulation de cellules sénescentes dans l’organisme contribue au vieillissement en favorisant l’inflammation, le dysfonctionnement des tissus et le développement de maladies liées à l’âge. Cependant, le vieillissement englobe un éventail beaucoup plus large d’événements et de mécanismes systémiques par rapport à la sénescence5.

Les cellules sénescentes se caractérisent par leur cytoplasme élargi nettement plus grand et leur morphologie aplatie par rapport aux cellules normales6. Ces cellules sénescentes ont une activité lysosomale accrue et sont positives pour l’activité de la β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal), une enzyme lysosomale qui reste active même à un pH acide de 6,0. La coloration SA-β-gal est le biomarqueur le plus largement utilisé pour détecter les cellules sénescentes7. L’élargissement et la morphologie irrégulière des noyaux sont couramment observés dans les cellules en cours de sénescence. De plus, ces cellules sont caractérisées par des réarrangements uniques de la chromatine appelés foyers hétérochromatiques associés à la sénescence (SAHF) qui médient l’arrêt irréversible du cycle cellulaire 8,9.

Bien que les cellules cancéreuses sénescentes aient finalement perdu leur capacité à proliférer, elles sont restées viables et métaboliquement actives. Il est connu que les cellules sénescentes sécrètent également divers facteurs pour réguler leur microenvironnement tumoral extracellulaire, appelé phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP)10,11. Ces facteurs SASP comprennent des facteurs de signalisation solubles (interleukines, chimiokines et facteurs de croissance), des protéases sécrétées et des protéines insolubles/composants de la matrice extracellulaire (MEC) sécrétés. Collectivement, ces facteurs exercent des effets paracrines néfastes, notamment la prolifération, la migration, l’invasion des cellules cancéreuses et l’induction de la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM)4,12. De plus, les effets indésirables induits par la chimiothérapie ont été partiellement attribués à l’accumulation de cellules sénescentes13. Par conséquent, l’étude de l’interaction entre les cellules sénescentes et non sénescentes est devenue un domaine de recherche important dans le contexte de la thérapie du cancer. En particulier, l’analyse des facteurs SASP, en particulier de leur composition et de leurs effets sur le microenvironnement cancéreux, est considérée comme une stratégie prometteuse pour identifier de nouvelles molécules cibles pour le traitement du cancer et découvrir de nouveaux médicaments pour ces molécules.

Les techniques de co-culture in vitro sont utilisées depuis longtemps pour étudier la compréhension des interactions entre cellules14. Dans cet article méthodologique, l’objectif était d’évaluer l’activité proliférative possible des facteurs sécrétés par les cellules sénescentes sur les cellules cancéreuses non sénescentes en utilisant trois méthodes différentes. De plus, les résultats obtenus avec les trois méthodes différentes ont été comparés, et les avantages et inconvénients respectifs de chaque approche ont été évalués de manière critique.

Tout d’abord, un modèle de co-culture a été mis en place entre des cellules HeLa sénescentes et des cellules HeLa non sénescentes pour suivre les changements possibles de la prolifération des cellules cancéreuses en temps réel à l’aide du système d’analyse cellulaire en temps réel12. Ce système se compose de deux plaques pour évaluer les interactions cellule-cellule. La vue e-plate, qui forme la couche inférieure, a une surface où les cellules cibles sont ensemencées, avec des microélectrodes positionnées au bas de la plaque. La résistance électrique créée par l’adhésion des cellules cibles à cette surface est exprimée par le paramètre mesurable Cell Index (CI). La valeur CI est proportionnelle au nombre de cellules et au degré d’adhérence à la surface15. De plus, la vue e-plate permet l’examen morphologique des cellules sous un microscope à contraste de phase. L’insert de la plaque E, qui forme la couche supérieure, est la zone où les cellules effectrices sont ensemencées. Le fond de cette plaque est recouvert d’une membrane semi-perméable de 0,4 μm de taille de pore. Les facteurs sécrétés par les cellules effectrices peuvent traverser la membrane et affecter les cellules cibles dans la vue e-plate. Si cette interaction stimule la prolifération cellulaire, on observe une augmentation de la valeur de l’IC. Ainsi, les interactions entre les cellules peuvent être évaluées quantitativement.

Dans la deuxième méthode, des milieux conditionnés collectés à partir de cellules HeLa sénescentes ont été concentrés et ajoutés à des cellules HeLa non sénescentes. L’effet prolifératif potentiel sur ces cellules a été surveillé à l’aide du système d’analyse cellulaire en temps réel.

Dans la troisième méthode, il était prévu de co-cultiver les cellules HeLa sénescentes et les cellules GFP-HeLa non sénescentes directement en 2D et de surveiller les éventuelles altérations prolifératives dans les cellules cancéreuses en temps réel au microscope.

L’objectif de cette expérience est de mettre en place trois modèles pour étudier l’interaction entre les cellules HeLa sénescentes et les cellules HeLa non sénescentes et suivre en temps réel les changements possibles dans la prolifération des cellules cancéreuses. Ainsi, l’effet des facteurs SASP sécrétés par les cellules cancéreuses sénescentes sur les autres cellules cancéreuses peut être facilement étudié. En conséquence, les avantages et les limites des trois approches ont été systématiquement évalués.

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Protocole

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REMARQUE : Toutes les procédures de culture cellulaire ont été effectuées dans des conditions de niveau de biosécurité II+ (BSL2+) dans une enceinte de sécurité certifiée. La doxorubicine est un agent chimiothérapeutique dangereux. Toutes les procédures doivent être effectuées dans une enceinte certifiée de niveau de biosécurité II+ (BSL2+) à l’aide d’un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris des blouses de laboratoire et des gants. Tous les déchets contenant de la doxorubicine, y compris les supports et les fixateurs, doivent être collectés dans des conteneurs de déchets dangereux désignés et clairement étiquetés et éliminés par le biais du système institutionnel de gestion des déchets dangereux.

1. Modèle 1 : Co-culture à l’aide du système d’analyse cellulaire en temps réel

  1. Culture des cellules et induction de la sénescence (jours 1-2)
    1. Implantez 8 x 10 cellulesde 5 HeLa dans une fiole de culture T25 contenant 5 mL de milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (0,1 μg/mL) et incubez des cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2.
    2. Le lendemain, remplacez le milieu des cellules par 5 mL de milieu complet frais. Traitez les cellules avec de la doxorubicine 300 nM directement en les ajoutant dans le milieu pour induire la sénescence cellulaire. Maintenir la fiole T25 dans un incubateur avec 5 % de CO2 à 37 °C pendant 72 h.
  2. Ensemencement de cellules non sénescentes (Jour 4)
    1. Implanter 8 x 105 cellules HeLa non traitées (témoin non sénescent) dans une fiole T25 neuve dans 5 mL de DMEM complété par 10 % de sérum fœtal bovin, de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (0,1 μg/mL) et les conserver dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2.
  3. Confirmation de l’induction de la sénescence (Jour 5)
    1. Pour déterminer si 72 h de traitement à la doxorubicine ont induit la sénescence, effectuer une coloration SA-β-gal6. Effectuez ce test sur un ensemble séparé de cellules non utilisées dans les expériences principales. Pour les résultats obtenus, voir la figure 1A,B.
    2. Mesurer l’IL-6 dans les milieux conditionnés des cellules HeLa du cancer sénescent pour évaluer leur activité sécrétoire. Traiter les cellules avec de la doxorubicine pendant 72 h, suivi d’une incubation dans un milieu sans sérum et sans rouge de phénol pendant 2 jours supplémentaires. Normalisez le milieu conditionné collecté en fonction du nombre de cellules et mesurez les niveaux d’IL-6.
      REMARQUE : L’IL-6 est une cytokine caractéristique de SASP12. Les résultats de la mesure de l’IL-6 sont présentés à la figure 1C.
  4. Configuration du système d’analyse cellulaire en temps réel (Jour 5)
    1. Allumez le système d’analyse cellulaire en temps réel avant l’ensemencement des cellules. Lancez le logiciel RTCA 2.0. Cliquez sur le bouton Exp Notes (Figure 2) et entrez les détails de l’expérience.
    2. Cliquez sur le bouton Planifier et ajoutez deux étapes. La première étape est pour l’arrière-plan. La deuxième étape consiste à surveiller la prolifération cellulaire toutes les 15 minutes pendant 72 heures.
    3. Choisissez la première étape et cliquez sur Lecture pour enregistrer l’impédance d’arrière-plan en ajoutant 50 μL de support complet à chaque puits de la vue de la plaque e.
  5. Semis de cellules dans la vue e-plate (Jour 5)
    1. Vérifiez les cellules HeLa traitées à la doxorubicine (sénescentes) et non traitées (non sénescentes) sous un microscope à contraste de phase en utilisant un grossissement de 10x avant d’ensemencer les cellules. Au microscope, les cellules sénescentes ont une morphologie beaucoup plus élargie que les cellules normales.
    2. Lavez les cellules HeLa sénescentes et non sénescentes avec 5 ml de PBS stérile préchauffé, puis aspirez.
    3. Ajouter 1 mL de trypsine à 0,05 % préchauffée et maintenir les fioles à 37 °C pendant 2 minutes pour détacher les cellules. Neutralisez la trypsine avec 5 ml de DMEM complet complété par 10 % de sérum de veau fœtal, de la pénicilline (100 U/mL) et de la streptomycine (0,1 μg/mL).
    4. Centrifuger les cellules à 500 x g à température ambiante pendant 10 min, jeter le surnageant et remettre les granules cellulaires en suspension dans 5 mL de DMEM complet complété par 10 % de sérum de veau fœtal, de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (0,1 μg/mL).
    5. Comptez les cellules viables à l’aide de la méthode d’exclusion du colorant bleu trypan à l’aide d’un hémocytomètre.
    6. Ensemencer des cellules HeLa non sénescentes à une densité de 5 x 103 cellules/puits dans chaque puits d’une vue en plaque E complète de 100 μL de DMEM complétée par 10 % de sérum de veau fœtal, de la pénicilline (100 U/mL) et de la streptomycine (0,1 μg/mL).
    7. Placez la vue e-plate dans le socle du système d’analyse de cellules en temps réel pour permettre aux cellules de se fixer à la surface de la plaque dans l’incubateur.
    8. Choisissez la deuxième étape sur le bouton de programmation et cliquez sur le bouton Lecture pour démarrer la mesure d’impédance à l’aide du logiciel RTCA 2.0 pendant 72 h (Figure 2).
  6. Semis de cellules dans l’insert e-plate
    1. Les cellules de semence dans une plaque électronique insèrent des puits dans 60 μL de DMEM complet complété par 10 % de sérum de veau fœtal, de la pénicilline (100 μg/mL) et de la streptomycine (0,1 μg/mL).
    2. Placer des cellules sur l’insert de la plaque électronique sous trois configurations expérimentales différentes : Groupe 1 (contrôle négatif) : Aucune cellule ensemencée (milieu uniquement)
      Groupe 2 : 2 × 104 cellules HeLa non sénescentes
      Groupe 3 : 1 × 105 cellules HeLa sénescentes
    3. Maintenir l’insert e-plate à 37 °C dans un incubateur avec 5 % de CO2 pendant 6 h pour la fixation.
  7. Co-culture de cellules
    1. Cliquez sur Pause après 6 h d’ensemencement de cellules. Aspirez doucement le milieu de culture de chaque puits de la vue e-plate pour éliminer le sérum et les cellules non adhérentes.
    2. Lavez les puits 2 fois avec du PBS préchauffé à 37 °C.Ajoutez 140 μL de DMEM sans sérum dans chaque puits de la vue e-plate.
    3. Prenez l’insert de plaque E et aspirez le milieu de culture. Bien laver doucement avec du PBS à 37 °C 2x et ajouter 60 μL de DMEM sans sérum.
    4. Positionnez l’insert e-plate dans la vue e-plate et appuyez doucement jusqu’à ce que l’insert soit complètement en place dans le puits.
    5. Insérez la plaque combinée dans le système d’analyse de cellules en temps réel et cliquez sur Lecture pour reprendre la surveillance en temps réel des valeurs d’indice de cellule à des intervalles de 15 minutes à l’aide du logiciel (Figure 2).
    6. Désactivez le système d’analyse de cellules en temps réel lorsque la durée de l’expérience est écoulée (Figure 3A).
  8. Cellules d’imagerie sur insert e-plate
    REMARQUE : Étant donné qu’il y a une membrane dans le puits d’insertion de la plaque E, les cellules ensemencées ici ne peuvent pas être visualisées sur la membrane à l’aide de la microscopie à contraste de phase. Par conséquent, pour tester si les cellules maintenaient leur viabilité jusqu’à la fin de l’expérience et si les cellules sénescentes préservaient leur intégrité structurelle, elles ont été colorées avec du DAPI (Figure 3B).
    1. Retirez l’insert de la plaque électronique de la vue de la plaque électronique. Colorez les cellules de l’insert e-plate avec du DAPI et vérifiez la présence de cellules au microscope fluorescent16. Les noyaux des cellules sénescentes sont connus pour être plus grands que ceux des cellules normales. Par conséquent, en fonction de la taille nucléaire des cellules colorées au DAPI, déterminez quel puits a été ensemencé avec des cellules non sénescentes et lequel avec des cellules sénescentes.
  9. Imagerie des cellules sur la vue e-plate
    1. Examinez directement la vue de la plaque E à l’aide d’un microscope à contraste de phase à l’aide d’un grossissement de 10x (Figure 3B). Étant donné que quatre rangées de capteurs à microélectrodes ont été retirées du centre de chaque puits dans la vue e-plate, l’espace 6 a été créé pour permettre la surveillance cellulaire par microscopie.
  10. Analyse des données
    1. Normalisez les valeurs CI au moment où la vue e-plate et l’insertion e-plate sont combinées et insérées dans le système d’analyse de cellules en temps réel.
    2. Cliquez sur le bouton Analyse des données pour calculer le taux et la quantité de prolifération à l’aide de l’indice de cellule maximal et des données de pente obtenues à partir du système d’analyse de cellules en temps réel (Figure 2). Ensuite, analysez les données à l’aide d’un programme statistique approprié (Figure 3C,D).

2. Modèle 2 : Essai de traitement en milieu conditionné à l’aide du système d’analyse cellulaire en temps réel

  1. Culture des cellules et induction de la sénescence (jours 1-2)
    1. Semez 35 x 10cellules de 4 cellules HeLa dans chaque puits de 6 plaques contenant 2,5 mL de milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (0,1 μg/mL) et incubez des cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2.
    2. Le lendemain, remplacez le milieu des cellules par 2,5 mL de milieu complet frais. Traitez les cellules avec 300 nM de doxorubicine directement en l’ajoutant au milieu pour induire la sénescence cellulaire. Maintenir la plaque à 6 puits dans un incubateur avec 5 % de CO2 à 37 °C pendant 72 h.
  2. Ensemencement de cellules non sénescentes (Jour 4)
    1. Implanter 35 x 10cellules HeLa non traitées (témoin non sénescent) dans chaque puits d’une nouvelle plaque à 6 puits dans 2,5 mL de DMEM additionnée de 10 % de sérum fœtal de bovin, de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (0,1 μg/mL) et les conserver dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2.
  3. Effectuez la confirmation de l’induction de la sénescence comme décrit à l’étape 1.3.
  4. Préparation d’un milieu conditionné à partir de cellules HeLa sénescentes et non sénescentes
    1. Vérifier à la fois les cellules traitées à la doxorubicine (cellules sénescentes) et les cellules HeLa non traitées (cellules non sénescentes) au microscope à contraste de phase. Au microscope, les cellules sénescentes ont une morphologie beaucoup plus élargie que les cellules normales.
    2. Aspirez le milieu de culture à partir des deux plaques à 6 puits (cellules HeLa sénescentes et non sénescentes). Lavez les cellules 2 fois avec du PBS préchauffé à 37 °C pour éliminer les résidus de sérum et les débris cellulaires.
    3. Ajouter 2 mL de DMEM sans sérum complété par de la pénicilline (100 U/mL) et de la streptomycine (0,1 μg/mL) dans chaque puits. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 48 h.
  5. Collecte et concentration des milieux conditionnés (Jour 7)
    1. Recueillir les milieux conditionnés de chaque puits dans des tubes stériles dans une cabine de sécurité laminaire.
    2. Trypsinisez les cellules et comptez les cellules à l’aide de la méthode d’exclusion du colorant bleu trypan à l’aide d’un hémocytomètre pour normaliser les milieux conditionnés en fonction du nombre de cellules.
    3. Ajuster le milieu conditionné, normalisé en fonction du nombre de cellules, jusqu’à un volume final de 2 mL avec du DMEM sans sérum complété par de la pénicilline (100 U/mL) et de la streptomycine (0,1 μg/mL) dans des tubes stériles de 2 mL.
    4. Centrifuger le milieu conditionné collecté à 1 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires, puis procéder à une centrifugation à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour obtenir le surnageant clarifié.
    5. Centrifuger le média conditionné à l’aide d’unités de filtration ultracentrifuges de 2 mL à 4 °C pendant 60 min à 3 000 x g pour le concentrer. Cette procédure concentre les milieux conditionnés de 2 mL à 5 fois les 400 μL concentrés des milieux conditionnés.
    6. Diluer les 40 μL de milieu conditionné obtenus avec un milieu frais sans sérum pour préparer 1x, 2x et 3x milieux conditionnés concentrés dans des tubes stériles dans une cabine de sécurité laminaire.
      REMARQUE : Étant donné que le milieu restant sur les cellules pendant 48 h est épuisé en raison de la consommation cellulaire, les milieux conditionnés collectés et concentrés sont ensuite dilués avec un nouveau milieu.
  6. Cellules d’ensemencement vers la vue e-plate
    1. Configurez le système d’analyse cellulaire en temps réel comme décrit aux étapes 1.1 à 1.4.Lavez les cellules HeLa non sénescentes avec du PBS préchauffé, puis aspirez.
    2. Ajouter 1 mL de trypsine à 0,05 % préchauffée et maintenir les fioles à 37 °C pendant 2 minutes pour détacher les cellules. Neutralisez la trypsine avec 5 ml de DMEM complet complété par 10 % de sérum de veau fœtal, de la pénicilline (100 U/mL) et de la streptomycine (0,1 μg/mL).
    3. Centrifuger les cellules à 500 x g à température ambiante pendant 10 min, jeter le surnageant et remettre les granules cellulaires en suspension dans 5 mL de DMEM complet complété par 10 % de sérum de veau fœtal, de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (0,1 μg/mL).
    4. Comptez les cellules viables à l’aide de la méthode d’exclusion du colorant bleu trypan à l’aide d’un hémocytomètre.
    5. Ensemencer des cellules HeLa non sénescentes à une densité de 5 x 103 cellules/puits dans chaque puits d’une vue d’une plaque E dans 200 μL de DMEM complet complété par 10 % de sérum de veau fœtal, de la pénicilline (100 U/mL) et de la streptomycine (0,1 μg/mL).
    6. Placez la vue e-plate dans le socle du système d’analyse de cellules en temps réel pour permettre aux cellules de se fixer à la surface de la plaque dans l’incubateur.
    7. Choisissez la deuxième étape sur le bouton de programmation et cliquez sur le bouton Lecture pour démarrer la mesure d’impédance à l’aide du logiciel RTCA 2.0 (Figure 2). Cliquez sur le bouton Pause du logiciel après 6 h de placage de cellules HeLa non sénescentes (Figure 2).
    8. Aspirez doucement le milieu de culture de chaque puits de la vue e-plate pour éliminer le sérum et les cellules non adhérentes. Lavez les puits 2 fois avec du PBS préchauffé à 37 °C.
    9. Ajouter le média conditionné préchauffé à 37 °C dans les groupes appropriés :
      Groupe 1 : Milieux frais
      Groupe 2 : 1x milieu conditionné à la cellule HeLa non sénescente
      Groupe 3 : 2x milieux conditionnés par cellules HeLa non sénescentes
      Groupe 4 : 3x milieux conditionnés à la cellule HeLa non sénescente
      Groupe 5 : 1x milieu sénescent conditionné à la cellule HeLa
      Groupe 6 : 2x milieux sénescents conditionnés à la cellule HeLa
      Groupe 7 : 3x milieux sénescents conditionnés à la cellule HeLa
    10. Insérez la vue e-plate dans le système d’analyse de cellules en temps réel et cliquez sur Lecture pour reprendre la surveillance en temps réel des valeurs d’indice de cellule à des intervalles de 15 minutes pendant 48 h (Figure 2).
    11. Désactivez le système d’analyse de cellules en temps réel lorsque la durée de l’expérience est écoulée (Figure 4A).
  7. Imagerie des cellules sur la vue e-plate
    1. Examinez directement la vue de la plaque E à l’aide d’un microscope à contraste de phase à un grossissement de 10x (Figure 4B). Étant donné que quatre rangées de capteurs à microélectrodes ont été retirées du centre de chaque puits dans la vue e-plate, un espace a été créé pour permettre la surveillance cellulaire par microsopie.
  8. Analyse des données
    1. Normaliser les valeurs de l’IC au moment où les milieux conditionnés concentrés ont été administrés aux cellules HeLa non sénescentes.
    2. Cliquez sur le bouton Analyse des données pour calculer le taux et la quantité de prolifération à l’aide de l’indice de cellule maximal et des données de pente obtenues à partir du système d’analyse de cellules en temps réel (Figure 2). Ensuite, analysez les données à l’aide d’un programme statistique approprié (Figure 4C,D).

3. Modèle 3 : Surveillance en temps réel de l’interaction cellule-cellule

  1. Culture des cellules et induction de la sénescence (jours 1-2)
    1. Implantez 8 x 10 cellulesde 5 HeLa dans une fiole de culture T25 contenant 5 mL de milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (0,1 μg/mL) et incubez des cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2.
    2. Le lendemain, remplacez le milieu des cellules par 5 mL de milieu complet frais. Traitez les cellules avec de la doxorubicine 300 nM directement en les ajoutant dans le milieu pour induire la sénescence cellulaire. Maintenir la fiole T25 dans un incubateur avec 5 % de CO2 à 37 °C pendant 72 h.
  2. Ensemencement de cellules non sénescentes (Jour 4)
    1. Ensemencer 8 x 10cellules 5 GFP-HeLa (témoin non sénescent) dans une fiole T25 neuve dans 5 mL de DMEM complété par 10 % de sérum fœtal bovin, de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (0,1 μg/mL) et les conserver dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2.
    2. Implanter 8 x 10cellules 5 HeLa (témoin non sénescent) dans une nouvelle fiole T25 dans 5 mL de DMEM complété par 10 % de sérum fœtal bovin, de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (0,1 μg/mL) et conserver dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2.
  3. Effectuer la confirmation de l’induction de la sénescence comme décrit à l’étape 1.3 (jour 5).
  4. Co-culture de cellules
    1. Vérifiez les cellules traitées à la doxorubicine, les cellules GFP-HeLa non traitées et les cellules HeLa non traitées sous un microscope à contraste de phase avant d’ensemencer les cellules. Au microscope, les cellules sénescentes ont une morphologie beaucoup plus élargie que les cellules normales.
    2. Lavez les trois flacons T25 avec 5 ml de PBS stérile préchauffé, puis aspirez. Ajouter 1 mL de trypsine à 0,05 % préchauffée et maintenir les fioles à 37 °C pendant 2 minutes pour détacher les cellules.
    3. Neutralisez la trypsine avec 5 ml de DMEM complet complété par 10 % de sérum de veau fœtal, de la pénicilline (100 U/mL) et de la streptomycine (0,1 μg/mL).
    4. Centrifuger les cellules à 500 x g à température ambiante pendant 10 min, jeter le surnageant et remettre les granules cellulaires en suspension dans 5 mL de DMEM complet complété par 10 % de sérum de veau fœtal, de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (0,1 μg/mL).
    5. Comptez les cellules viables à l’aide de la méthode d’exclusion du colorant bleu trypan à l’aide d’un hémocytomètre. Cellules germées dans 200 μL de DMEM complet complété par 10 % de sérum de veau fœtal, de la pénicilline (100 μg/ml) et de la streptomycine (0,1 μg/mL).
    6. Placez des cellules sur μ-lames à 8 puits de hauteur sous trois configurations expérimentales différentes :
      Groupe 1 : 7 x 103 cellules GFP-HeLa
      Groupe 2 : 18 x 103 cellules HeLa non sénescentes + 7 x 103 cellules GFP-HeLa
      Groupe 3 : 18 x 103 cellules HeLa sénescentes + 7 x 103 cellules GFP-HeLa
    7. Maintenir le μ-slide pendant 8 h pour la fixation à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Après 8 h, lavez les cellules avec du PBS préchauffé (37 °C) 2x pour éliminer l’effet du sérum sur les cellules.
    8. Ajouter 200 μL de DMEM sans sérum contenant de la pénicilline (100 μm/ml) et de la streptomycine (0,1 μg/mL) dans chaque puits.
  5. Configuration du microscope
    1. Allumez le régulateur de température et le régulateur de CO2 et laissez le système d’incubation sur le dessus de la scène se stabiliser pendant 30 min.
    2. Vérifiez manuellement les réglages de concentration et de température de CO2 et assurez-vous que les conditions physiologiques (5 % de CO2, 37 °C) sont atteintes.
    3. Allumez le microscope à fluorescence inversée et laissez le système terminer l’auto-étalonnage. Allumez la source lumineuse de fluorescence. Lancez le logiciel d’imagerie et d’analyse pour contrôler les paramètres d’imagerie et l’acquisition d’images.
  6. Imagerie en accéléré
    1. Placez la lame sur la chambre d’incubation de la scène de la microscopie à fluorescence inversée à l’aide d’une caméra numérique haute résolution. Ouvrez le logiciel et sélectionnez les modes Part X, Y, Z et T, puis mettez en scène les expériences dans les paramètres d’acquisition (Figure 5A).
    2. Sélectionnez un objectif 20x avec un contraste élevé pour l’imagerie de fluorescence et de contraste de phase (Figure 5A). Ajoutez les canaux de contraste de phase et de fluorescence (filtre FITC) pour activer l’imagerie dans les deux modes (Figure 5A).
    3. Cliquez sur le bouton Live pour lancer l’imagerie des cellules vivantes, puis faites la mise au point sur les cellules sous contraste de phase (Figure 5A). Ouvrez la fenêtre z-stack et marquez la position des cellules d’intérêt (contenant à la fois des cellules HeLa sénescentes/non sénescentes et des cellules HeLa GFP). Naviguez dans la platine entre les puits à l’aide du contrôleur de platine automatique, ce qui permet de localiser précisément les zones sélectionnées pour le marquage de position (Figure 5A).
      REMARQUE : De cette façon, plusieurs zones peuvent être sélectionnées dans le même puits d’une diapositive.
    4. Basculez le canal sur le canal de fluorescence pour commencer l’imagerie de fluorescence. Réglez les réglages d’exposition (89,506 ms), de gain (10) et d’intensité (136) appropriés (Figure 5A).
      REMARQUE : Ces paramètres varient en fonction de l’intensité de fluorescence des cellules exprimant la protéine fluorescente.
    5. Sélectionnez un intervalle μm z-stack, définissez les positions haut et bas et configurez l’empilement z sous contraste de phase (Figure 5A). Cliquez sur Arrêter pour fermer l’option En direct.
    6. Définissez la durée (48 h) et l’intervalle de temps (30 min) à l’aide des champs Durée et Intervalle de temps pour l’imagerie en accéléré.
    7. Cliquez sur Démarrer pour commencer l’imagerie pendant 48 h (Figure 5A). Enregistrez le projet après 48 h (Figure 5A).
    8. À chaque point temporel (0 h et 48 h), sélectionnez la meilleure image dans la pile z et exportez l’image (Figure 5A).
    9. Comptez les cellules GFP positives à 0 h et 48 h, calculez le pourcentage d’augmentation des cellules GFP positives et analysez les données à l’aide d’un logiciel approprié (Figure 1D,E).
  7. Génération d’un film
    1. Cliquez sur Afficher la galerie pour afficher toutes les images capturées organisées par points temporels et calques z-stack (Figure 5B).
    2. Pour chaque point temporel, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’image la plus ciblée de la pile z correspondante et sélectionnez Sélectionner les vignettes d’affilée. Enregistrez les images sélectionnées (Figure 5B).
    3. Répétez ce processus individuellement pour chaque position. Pour vous aider à sélectionner les images les plus nettes, utilisez la fonction Trouver les meilleurs cadres mis au point. Enregistrez les images sélectionnées via l’option Enregistrer les images sélectionnées. Les images enregistrées sont automatiquement téléchargées dans la section Ouvrir le projet.
    4. Faites un clic droit sur le film et sélectionnez Exporter l’image une fois les séquences d’images entièrement chargées.
    5. Accédez à l’onglet Vidéo de la fenêtre d’exportation, définissez la fréquence d’images souhaitée (images par seconde), sélectionnez des options supplémentaires telles que la barre d’échelle, l’horodatage, etc., si nécessaire, et finalisez l’exportation en choisissant une destination à l’aide de l’option Parcourir (Figure 5B, Vidéo 1, Vidéo 2 et Vidéo 3).

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Résultats

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Cet ensemble représentatif d’expériences a étudié les effets potentiels du phénotype sécrétoire associé à la sénescence dérivé des cellules cancéreuses sénescentes sur d’autres cellules cancéreuses. Par conséquent, il a d’abord été confirmé si le traitement à la doxorubicine pendant 72 heures pouvait induire la sénescence dans les cellules HeLa en utilisant la coloration SA-β-Gal. Dans les cellules sénescentes, l’enzyme lysosomale β-galactosidase reste active même à faible pH et clive le substrat chromogène X-gal, forman...

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Discussion

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Les interactions dynamiques des cellules cancéreuses dans leur microenvironnement sont cruciales pour la progression tumorale, ce qui influence l’induction de métastases et le développement d’une tumeur secondaire. Il est également rapporté que le cancer sénescent et les cellules stromales régulent les microenvironnements tumoraux par le biais des facteurs sécrétés par les cellules sénescentes4. Ces facteurs stimulent la prolifération cellulaire, la migration, l’i...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Cette étude a été soutenue par l’unité de projet scientifique de l’Université de Gazi (code de subvention : TOA-2021-7321) et TUBITAK (code de subvention : 122S564 et 223S969).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
µ ;-Slide 8 Well highfigure-materials-1bidi80806
0,05 % de trypsine-EDTA (1X)Gibco25300-054
Unités filtrantes centrifuges Amicon Ultra (Ultracel-3K)MilliporeUFC200324
Incubateur CO2 (37 & degrés ; C, 5 % CO2)Sanyo
CO2-Controller 2000  ;Pecon  ;
DMEMGibco41966-029
DoxorubicineTocris2252
Plaque électronique INSERT 16  ;ACEA Biosciences/Agilent6 465 382 001
E-plate VIEW 16  ;ACEA Biosciences/Agilent300 601 140
FBSGibcoA5256701
Cellules HeLafigure-materials-2AP Institute, Ankara, TurquieHÜ ; KÜ ; K : 90061901  ;
Microscope à fluorescence inversée Leica DMi8 & nbsp ;Leica
Solution physiologique tamponnée phosphate (PBS)Gibco70011-044
Kit de coloration &bêta ;-galactosidase (SA-&bêta ;-gal) associée à la sénescence   ;Signalisation cellulaire9860S
Système d’incubation au sommet de l’étagePecon  ;
Contrôleur de température 2002-2  ;Pecon  ;
Colorant bleu TrypanSigmaT8154
xCELLigence RTCA DP system  ;ACEA Biosciences/Agilent

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  4. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent Cells in Cancer Therapy: Friends or Foes. Trends Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
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  20. Li, D., et al. Decoding the crossroads of aging and cancer through single-cell analysis: Implications for precision oncology. Int J Cancer. 157 (5), 807-818 (2025).

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Prolif ration des cellules canc reusescellules s nescentessignalisation paracrineeffets juxtacrinesmilieux conditionn stechniques de co cultureanalyse cellulaire en temps r elimagerie de cellules vivantescellules HeLa

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