Dévoilement de la modification de la phosphorylation à l’aide de l’électrophorèse sur gel Phos-tag SDS-PAGE et du dosage in vitro de la kinase

Résumé

Ce protocole décrit les procédures de détection des changements dans les modifications de phosphorylation des protéines cibles à l’aide de l’électrophorèse sur gel Phos-tag dans des échantillons cliniques et des tests de kinase in vitro .

Résumé

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle classique qui régule la fonction protéique. Les protéines contiennent généralement plusieurs sites de phosphorylation potentiels, qui peuvent être modifiés par diverses kinases à différents endroits. L’étude des changements de phosphorylation des protéines cibles dans la maladie nécessite souvent des anticorps phospho-spécifiques. Cependant, les options commerciales peuvent être limitées à un seul site ou totalement indisponibles. Ici, une méthode est décrite pour détecter les changements dans les modifications de phosphorylation des protéines cibles dans les échantillons cliniques à l’aide de l’électrophorèse sur gel Phos-tag et pour identifier des sites de phosphorylation détaillés à l’aide d’essais de kinases in vitro . Les protéines phosphorylées liées au Phos-tag présentent des taux de migration plus lents dans l’électrophorèse sur gel SDS-PAGE, ce qui permet une analyse semi-quantitative des changements de phosphorylation dans les tissus pathogènes en fonction de l’intensité moyenne des pixels des bandes à migration lente. En combinant le Phos-tag SDS-PAGE avec l’immunoblot à l’aide d’anticorps spécifiques du pan contre plusieurs protéines candidates, les chercheurs peuvent identifier efficacement les protéines cibles présentant des changements de phosphorylation. Après le criblage des kinases candidates, des tests de kinases in vitro sont effectués avec la protéine cible, et les produits phosphorylés résultants sont soumis à une spectrométrie de masse pour une identification précise du site. Cette méthode ne nécessite pas d’anticorps spécifiques à base de protéines phosphorylées, ce qui permet un criblage à grande échelle d’échantillons de tissus pour identifier les états de phosphorylation modifiés dans la maladie. De plus, les sites de phosphorylation identifiés peuvent être utilisés pour développer des anticorps spécifiques pour l’analyse quantitative et de localisation dans les tissus pathologiques, fournissant ainsi des informations plus approfondies sur leurs rôles fonctionnels.

Introduction

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle clé pour moduler la localisation subcellulaire, l’activité kinase et l’activité transcriptionnelle des protéines. Plus de 500 gènes de protéine kinase ont été trouvés dans le génome humain, qui sont impliqués dans la transduction du signal, l’expression des gènes et l’interaction protéine-protéine¹. La phosphorylation et la déphosphorylation sont sous le contrôle de diverses kinases, qui sont rapidement réversibles pour réguler l’adhésion cellulaire, la prolifération cellulaire et la différenciation cellulaire². Cependant, des modifications anormales de la phosphorylation des protéines sont responsables de nombreuses maladies humaines, notamment la tumorigenèse, les troubles auto-immuns, la neurodégénérescence et l’hypofertilité ^3,4,5.

Le profilage phosphoprotéomique des échantillons cliniques produit plusieurs protéines candidates phosphorylées différentiellement⁶. Pour révéler les principales modifications de phosphorylation dans les maladies humaines, une méthode simple et efficace pour détecter l’état de phosphorylation de protéines cibles spécifiques est nécessaire. La phosphorylation à différents sites pourrait entraîner des altérations fonctionnelles distinctes de la protéine. Par conséquent, l’utilisation d’anticorps spécifiques à la phosphorylation ciblant des sites d’acides aminés particuliers est sans aucun doute la meilleure méthode pour détecter les changements dans la phosphorylation des protéines. Cependant, les anticorps phosphospécifiques bien caractérisés sont absents pour de nombreuses protéines. De plus, une approche plus appropriée est nécessaire pour identifier de nouveaux sites potentiels de phosphorylation. La phosphorylation à des résidus d’acides aminés spécifiques modifie souvent le taux de migration d’une protéine dans l’électrophorèse sur gel, et des bandes de migration plus lentes peuvent refléter des changements dans l’état de phosphorylation⁷. Cependant, ces changements de mobilité sont généralement subtils, ce qui les rend difficiles à distinguer. Le phos-tag est un composé chimique synthétisé conçu à partir d’un domaine catalytique de phosphatase alcaline comme modèle, qui peut capturer des résidus phosphorylés Ser/Thr/Tyr et His/Asp/Lys. Par conséquent, la conjugaison phos-tag amplifie efficacement les différences de vitesse de migration entre les protéines phosphorylées et non phosphorylées, tout en distinguant les variations du nombre de sites de phosphorylation⁸.

Cette méthodologie basée sur le phos-tag pour détecter les changements de phosphorylation des protéines cibles dans les échantillons de tissus offre des avantages distincts par rapport aux approches conventionnelles. De manière cruciale, il élimine la nécessité d’anticorps phospho-spécifiques, au lieu d’utiliser des anticorps standard spécifiques aux protéines de qualité WB pour la détection. Les formes phosphorylées et non phosphorylées des protéines cibles sont résolues en bandes distinctes au cours du Phos-tag SDS-PAGE, ce qui permet une évaluation semi-quantitative des altérations du niveau de phosphorylation dans les états pathologiques grâce à une analyse comparative de l’intensité des bandes. Le flux de travail de ce protocole comprend : (1) la séparation d’échantillons de protéines par phos-tag SDS-PAGE, (2) le criblage immunoblot de cibles phosphorylées, (3) des tests de kinases in vitro avec des kinases candidates vérifiées par des anticorps phospho-Ser/Thr. L’analyse par spectrométrie de masse ultérieure (menée par une plate-forme de service externe) identifie les sites de phosphorylation pour permettre le développement d’anticorps spécifiques au site ; La méthodologie détaillée n’est pas incluse dans le protocole actuel. Notamment, cette approche a été appliquée avec succès pour détecter les changements de phosphorylation de Nur77 dans des échantillons cliniques, en identifiant la kinase Mst1 comme le régulateur en amont de la phosphorylation de Nur77 et en développant un phospho-anticorps spécifique au site pour la détection clinique de la phosphorylation à la thréonine 366 de Nur77⁹. Par conséquent, cette approche s’avère particulièrement précieuse lors des phases de recherche préliminaires lors de l’étude de plusieurs protéines candidates, car elle permet un criblage à grande échelle des changements de statut de phosphorylation sur de nombreuses cibles à l’aide d’anticorps disponibles dans le commerce.

Protocole

Les comités d’examen institutionnels de l’hôpital Drum Tower de Nanjing ont approuvé la recherche sur l’homme (2013-408081-01). Le protocole actuel est établi en utilisant le tissu endométrial comme modèle représentatif. Avec une optimisation appropriée, cette méthodologie peut être étendue à d’autres échantillons cliniques, y compris, mais sans s’y limiter, les tissus tumoraux pour l’extraction des protéines et les analyses ultérieures. La biopsie de l’endomètre est réalisée en phase de sécrétion intermédiaire chez des femmes fertiles (groupe témoin) et des femmes présentant un échec récurrent d’implantation embryonnaire subissant une fécondation-transfert d’embryonin vitro (groupe maladie). Tous les patients ont donné leur consentement éclairé avant la procédure d’échantillonnage. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation des échantillons

1. Rincez deux fois les échantillons de tissus frais obtenus avec du PBS pré-refroidi pour éliminer les cellules sanguines, et séparez environ 100 mg de tissu dans un tube à centrifuger de 1,5 ml.
2. Placez le tissu dans un tube de broyage à fond rond de 2 mL contenant 1 mL de tampon de lyse des protéines tissulaires (150,0 mmol/L de NaCl, 1,0 % de NP-40, 50,0 mmol/L de Tris pH 8,0, 0,5 % de désoxycholate de sodium, cocktail d’inhibiteurs de protéase et cocktail d’inhibiteurs de phosphatase 2 et 3).
3. Réglez la vitesse du disperseur de tissus à grande vitesse au niveau 5 (sur 6 niveaux) et broyez le tissu pendant 10 s, suivis de 30 s d’incubation sur de la glace. Répétez ce processus 5 fois pour obtenir un homogénat de tissu.
4. Lyser l’homogénat par rotation lente sur un agitateur à 4 °C pendant 30 min, puis centrifuger à 4 °C et 13 000 × g pendant 10 min, et recueillir le surnageant.
5. Déterminer la concentration en protéines à l’aide de la méthode BCA.
6. Prélever un total de 300 μg de protéines, ajuster à un volume égal et mélanger avec 4× de tampon d’échantillon de protéines Laemmli. Dénaturez le mélange en le chauffant à 95 °C pendant 8 min, en le refroidissant à température ambiante, puis en le chargeant pour une analyse plus approfondie.
   REMARQUE : Avant l’étape 2, il est recommandé d’effectuer des analyses Western blot conventionnelles pour détecter la protéine d’intérêt à l’aide d’anticorps totaux afin d’évaluer les niveaux d’expression.

2. Préparation du gel Phos-tag SDS-PAGE

1. Préparer 100 mL de solution mixte d’acrylamide/N,N,-méthylène-bisacrylamide à 30 % p/v en ajoutant 29,0 g d’acrylamide et 1,0 g de N,N,N'-méthylène-bisacrylamide.
   REMARQUE : Conserver à 4 °C dans l’obscurité.
2. Préparez une solution de Tris-HCl à 1,5 mol/L (pH 8,8), une solution de Tris-HCl à 0,5 mol/L (pH 6,8), une solution SDS à 10 % p/v et une solution de persulfate d’ammonium à 10 % p/v comme dans les FDS-PAGE conventionnelles.
3. Préparez une solution de Phos-tag de 5,0 mmol/L et une solution de MnCl₂ de 10 mmol/L spécifique pour le gel Phos-tag SDS-PAGE.
4. Préparer une solution de gel résolutante, en cas de préparation de la solution de 10 mL avec un gel de polyacrylamide à 6 % p/v avec une solution de phos-tag à 50 μM et une solution de MnCl₂ à 100 μM, en mélangeant 2 mL de solution mixte d’acrylamide/bis-acrylamide à 30 % (p/v), 2,5 mL de solution de Tris/HCl à 1,5 mol/L (pH 8,8), 0,1 mL de solution de phos-tag à 5,0 mmol/L, 0,1 mL de solution de MnCl₂ à 10 mmol/L, 0,1 mL de solution de SDS à 10 % (p/v), 10 μL de TEMED et 5,14 mL d’eau distillée.
5. Agitez doucement la solution de gel de résolution préparée pour assurer l’homogénéité, puis placez le tube de solution de gel dans un dessiccateur sous vide et appliquez un vide (0,1 MPa) pendant 2 min jusqu’à ce qu’il ne reste plus de bulles visibles.
6. Ajouter 50 μL de persulfate d’ammonium à 10 % et mélanger doucement mais soigneusement.
7. Pipetez immédiatement la solution dans la cassette de gel assemblée jusqu’à ce qu’elle atteigne ~1 cm sous le bord supérieur de la plaque courte. Évitez d’introduire des bulles.
8. Superposez soigneusement 0,5 ml d’eau distillée sur le gel pour exclure l’air et assurer une interface plate. Laisser polymériser à température ambiante pendant 20-30 min.
9. En même temps, préparer une solution de gel étalon d’empilement tamponnée Tris-HCl (gel de polyacrylamide à 4,5 % p/v) en mélangeant 0,6 mL de solution mixte d’acrylamide à 30 % (p/v), 1 mL de solution de Tris-HCl à 0,5 mol/L (pH de 6,8), 40 μL de solution SDS à 10 % (p/v), 4 μL de TEMED et 2,33 mL d’eau distillée. Tourbillonnez doucement et dégazez.
10. Assurez-vous que le gel s’est complètement solidifié (inclinez la cassette de gel pour observer l’inclinaison de la couche supérieure de liquide tout en confirmant l’immobilité de l’interface intermédiaire). Versez délicatement le revêtement d’eau, puis égouttez-le complètement.
11. Ajoutez 20 μL de persulfate d’ammonium à 10 % dans la solution de gel d’empilage préparée, mélangez doucement et pipetez-la immédiatement sur le gel de résolution.
12. Placez soigneusement un peigne de 10 ou 15 puits dans la solution de gel d’empilage, en évitant les bulles. Laisser le gel d’empilage polymériser à température ambiante pendant 10 min.
    REMARQUE : Préparez toujours le gel juste avant de l’utiliser. Veuillez optimiser les concentrations en phos-marqué et en acrylamide pour chaque protéine d’intérêt.

3. Électrophorèse du Phos-tag SDS-PAGE

1. Assemblez l’équipement d’électrophorèse et remplissez les chambres d’électrodes avec un tampon courant conventionnel Tris/Glycine/SDS.
2. Chargez 30 μg d’échantillon de protéines dans chaque puits à l’aide d’une micropipette.
3. Effectuer l’électrophorèse dans des conditions de courant constant (30 mA/gel) jusqu’à ce que le bleu de bromophénol atteigne le fond du gel de résolution.
4. Faites tremper les gels dans un tampon de transfert SDS-PAGE sans méthanol avec 5 mM d’EDTA pendant 10 minutes deux fois pour éliminer les cations bivalents.
5. Transférez les protéines sur la membrane PVDF à 90 V pendant 90 min à l’aide de systèmes de transfert humide/en réservoir.

4. Immunobuvardage et analyse

1. Bloquer la membrane avec une solution à 5 % de lait écrémé ou de poudre d’albumine sérique bovine (diluée dans une solution 1×Tris-Borate-Sodium Tween-20, TBST) à température ambiante pendant 1 h.
2. Diluer l’anticorps primaire contre la protéine cible avec un rapport approprié et incuber avec la membrane à 4 °C pendant la nuit.
3. Lavez la membrane 3 fois avec du TBST, 10 min par lavage, à température ambiante avec une légère agitation.
4. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire conjugué à HRP à température ambiante pendant 1 h.
5. Lavez la membrane 3 fois avec du TBST, 10 min par lavage, à température ambiante avec une légère agitation.
6. Incuber avec le substrat de chimiluminescence amélioré dans l’obscurité pendant 1 min, suivi d’une exposition.
7. Capturez les images à l’aide d’un système automatisé de documentation sur gel et quantifiez les bandes cibles (protéine cible phosphorylée migrant lentement et protéine cible non phosphorylée migrant rapidement) pour l’intensité des niveaux de gris à l’aide du logiciel ImageJ.
   REMARQUE : Les transferts Western de gels Phos-Tag ne peuvent pas être utilisés pour attribuer la masse moléculaire.
8. Calculez le rapport entre les bandes phosphorylées à migration lente et les bandes non phosphorylées à migration rapide pour chaque échantillon, et analysez la différence statistique du pourcentage de phosphorylation entre les groupes.

5. Immunoprécipitation de la protéine cible

1. Construire des plasmides d’expression codant des phospho-mutants de type sauvage ou spécifiques au site de la protéine cible, marqués FLAG (ou d’autres marqueurs d’épitopes, y compris, mais sans s’y limiter, HA, GFP, GST ou His).
2. Transfectez des cellules HEK293 avec des plasmides d’expression à l’aide de Lipofectamine 3000 selon le protocole du fabricant.
3. Lyser les cellules dans un tampon de lyse des protéines tissulaires de 1 mL comme décrit à l’étape 1 pour extraire le surnageant protéique.
4. Incuber le surnageant avec 20 μL de gel d’affinité Anti-FLAG M2 pendant une nuit à 4 °C avec rotation.
5. Centrifugez (1000 × g, 3 min), recueillez les billes d’agarose et lavez-les avec 10 volumes de colonne de TBS pour éliminer les protéines non spécifiquement liées.
6. Dissoudre le peptide FLAG dans le TBS jusqu’à une concentration finale de 100 μg/mL.
7. Éluer la protéine de fusion FLAG liée du gel d’affinité anti-FLAG M2 par élution compétitive avec cinq volumes d’une colonne de solution peptidique FLAG (utiliser une solution de 100 μL pour des billes d’agarose de 20 μL) pendant 5 à 10 minutes en mélangeant doucement.
8. Centrifuger (1000 × g, 3 min) et recueillir le surnageant.
   REMARQUE : Si la kinase est connue, passez à l’étape 6 ; sinon, identifiez d’abord les kinases potentielles par criblage à deux hybrides de levure ou par prédiction bioinformatique (par exemple, à l’aide de PhosphositePlus ou du système de prédiction basé sur le groupe) avant de passer à l’étape 6.

6. Essai de kinase in vitro pour identifier les acides aminés phosphorylés

1. Préparer un tampon kinase (30 μL par réaction) : 40 mM HEPES pH7,6, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 2,5 mM β-glycérophosphate, 200 μM ATP, 100 ng de kinase active, protéine de fusion FLAG immunoprécipitée.
2. Incuber à 30 °C pendant 30 min dans un thermomélangeur avec une agitation douce.
3. Arrêter les réactions en ajoutant 10 μL 4× tampon Laemmli et dénaturer à 95 °C pendant 5 min.
4. Effectuer une électrophorèse SDS-PAGE conventionnelle à l’aide de la protéine de fusion FLAG immunoprécipitée qui a réagi avec ou sans kinase active.
5. Sonde avec anticorps anti-phospho-Thr et anticorps anti-phospho-Ser pour identifier les acides aminés phosphorylés. Sonde avec anticorps anti-drapeau comme contrôle (voir tableau des matériaux).
6. Effectuez l’immunotransfert et l’analyse comme décrit à l’étape 4.

Résultats

Le profilage phosphoprotéomique préliminaire d’échantillons humains du groupe témoin et du groupe pathologique a permis d’identifier Nur77 comme une protéine candidate phosphorylée différentiellement. Pour évaluer l’efficacité du Phos-tag SDS-PAGE dans la détection de la phosphorylation de la protéine Nur77, une expérience Mn²⁺-Phos-tag SDS-PAGE a été réalisée. Après l’extraction de la protéine totale à partir d’échantillons de tissus, 30 μg de protéine ont été chargés et séparés par électrophorèse sur gel Mn<...

Discussion

L’approche basée sur le phos-tag pour détecter les changements de phosphorylation des protéines cibles dans les tissus cliniques offre des avantages significatifs pour la recherche sur la phosphorylation des protéines. Les protéines phosphorylées présentent une mobilité électrophorétique réduite en raison de la liaison au Phos-tag, ce qui permet un criblage à haut débit de l’état de phosphorylation des protéines candidates sans nécessiter d’anticorps phospho-spécifiques. Ceci est particu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 % SDS Solution	Sangon Biotech	B548118
10x Tris/Glycine/SDS	BIO-RAD
4& fois ;   ; Tampon d’échantillon de protéine Laemmli	BIO-RAD	1610747
Acrylamide	Sangon Biotech	A601032
Persulfate d’ammonium	Sangon Biotech	A100486
Anti-FLAG M2 Gel d’affinité	Millipore	A2220
Kit de chimiluminescence améliorée	ThermoFisher	32106
FLAG anticorps	CST	14793
DRAPEAU  ; Peptide	Millipore	F3290
Anticorps secondaire conjugué HRP	Technologie Bioworld	BS13278
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015
Mini Trans-Blot Cellule	BIO-RAD	1703930
Mini-PROTEAN Tétra Électrophorèse verticale Cellule	BIO-RAD	1658005
Anticorps	Mst1CST	3682
N, N'-méthylène-bisacrylamide	Sangon Biotech	A600025
N,N,N',N'-Tétraméthyléthylènediamine(TEMED)	Sangon Biotech	A610508
Anticorps Nur77	CST	3960
Cocktail d’inhibiteurs de la phosphatase 2	Sigma	P5726	Pour l’inhibition des protéines tyrosine phosphatases, acide et phosphatases alcalines
Inhibiteur de la phosphatase Cocktail 3	Sigma	P0044	Pour l’inhibition de la protéine phosphatase 2A, des phosphatases alcalines, des protéines phosphatases 1 et 2A
Anticorps phospho-sérine	Sigma	P5747
Anticorps phospho-thréonine	Sigma	P6623
Phos-tag Acrylamide	Wako	304-93526	Pour la préparation du Phos-tag SDS PAGE gel
Pierce BCA Kit de dosage des protéines	Thermo  ;	23227
Inhibiteur de protéase Cocktail	Sigma	S8830	sans EDTA, comprimé, pour l’inhibition de la sérine, de la cystéine, de l’aspartique et des métalloprotéases
membrane PVDF  ;	Roche	3010040001
ThermoMixer	Eppendorf	2231001127
disperseur de tissus	IKA	T 10  ;	Pour obtenir un homogénat tissulaire
Tampon Tris-HCl (0,5 M, pH 6,8)	Tampon Sangon Biotech	B546020
Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8)	Déshydratant sous vide Sangon Biotech	B546019
ThermoFisher		5311-0250	Pour dégazer la solution de gel
&bêta ;-Mercaptoethanol	Sigma	M3148