Method Article

Manipulation et analyse des processus dépendants du cycle cellulaire chez les levures bourgeonnantes

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole détaille deux méthodes d’arrêt du cycle cellulaire de levure et de libération facultative, et développe l’utilisation de la microscopie à fluorescence pour étudier les processus dépendants du cycle cellulaire chez S. cerevisiae.

Abstract

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Les cellules eucaryotes suivent un cycle cellulaire conservé qui régule divers processus, notamment le maintien de l’ADN et l’homéostasie des organites. L’étude des processus cellulaires d’une manière dépendante du cycle cellulaire est souvent nécessaire pour interpréter correctement les résultats expérimentaux. Il existe des méthodes chimiques et génétiques disponibles pour produire la synchronisation du cycle cellulaire dans des cellules cultivées à travers un large éventail d’organismes, y compris des modèles de vertébrés, permettant l’étude des processus dépendants du cycle cellulaire. Cependant, parmi les organismes modèles, la levure bourgeonnante reste une centrale électrique pour l’analyse du cycle cellulaire en raison de ses méthodes de synchronisation particulièrement robustes, de son temps de génération court et de sa traçabilité génétique. La levure partage la machinerie centrale du cycle cellulaire avec d’autres eucaryotes, ce qui a permis des découvertes historiques dans la régulation du cycle cellulaire. Ce protocole détaille les méthodes d’analyse du cycle cellulaire chez la levure, en se concentrant sur les expériences d’arrêt-libération G1 et d’arrêt-libération mitotique, y compris la construction de souches, la préparation de cultures et la microscopie. Des méthodes de marquage par PCR pour produire des souches appropriées pour l’arrêt du cycle cellulaire et la microscopie à fluorescence sont présentées. Un arrêt G1 est réalisé à l’aide de la phéromone peptidique α-facteur, et de brefs lavages entraînent une libération synchrone et une progression du cycle cellulaire. Les échantillons sont prélevés à différents moments après leur libération dans le cycle cellulaire et fixés pour la microscopie. Une deuxième méthode arrête les cellules de levure en mitose en épuisant le régulateur du cycle cellulaire Cdc20 pour obtenir une population arrêtée en métaphase, ainsi qu’une libération facultative en anaphase. Les échantillons sont fixés et préparés pour l’imagerie avant et après la libération, puis sont imagés et analysés. L’analyse d’images se concentre sur le catalogage, la localisation dynamique et les changements d’abondance de la population des protéines dans le cycle cellulaire. Ces méthodes de synchronisation conviennent à diverses manipulations du cycle cellulaire, et bien que leur utilisation dans l’imagerie des cellules fixes soit mise en évidence ici, elles peuvent être adaptées à de nombreuses autres analyses, y compris l’imagerie de cellules vivantes ainsi que les tests biochimiques et moléculaires.

Introduction

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La division cellulaire eucaryote est fortement régulée par un programme appelé cycle cellulaire. Les processus dynamiques hautement conservés qui se produisent dans le cycle cellulaire le rendent intéressant à étudier en lui-même, mais ont également des implications étendues qui informent les investigations d’autres processus biologiques cellulaires - par exemple, de nombreux organites subissent un remodelage spectaculaire au cours de la division cellulaire, et l’abondance et la localisation de nombreuses protéines sont fortement réguléestout au long de 1,2,3. Bien qu’il y ait quelques couches supplémentaires de complexité présentes dans les systèmes métazoaires par rapport à la levure, y compris une plus grande variété de kinases et de protéines régulatrices, ainsi que des informations supplémentaires provenant de la signalisation externe chez les métazoaires, la division cellulaire est globalement très fortement conservée chez tous les eucaryotes 4,5. De nombreux travaux fondamentaux ont permis d’obtenir des informations clés sur la progression du cycle cellulaire et les étapes régulatrices cruciales chez la levure, et elle reste un organisme extrêmement attrayant pour l’étude des questions liées au cycle cellulaire pour une multitude de raisons 6,7. Le principal d’entre eux est le large éventail de méthodes disponibles pour manipuler le cycle cellulaire, permettant l’arrêt à différents stades et la synchronisation des cellules. Parmi les autres avantages, citons le cycle cellulaire court de la levure (~90-150 min selon la température et les conditions du milieu), la facilité de manipulation génétique et la grande variété d’allèles conditionnels qui permettent l’étude dans un contexte de type sauvage.

La progression à travers les différentes phases du cycle cellulaire est déterminée par l’activité de plusieurs kinases clés, notamment la kinase dépendante de la cycline (Cdk) omniprésente, la kinase de type Polo et les kinases Aurora. Les points de contrôle du cycle cellulaire régulent la progression tout au long du cycle cellulaire, garantissant que les cellules ne progressent pas vers l’étape suivante de la division à moins que des conditions spécifiques ne soient remplies 8,9. Ces points de contrôle, et les transitions qu’ils régulent, peuvent être détournés par les chercheurs pour réaliser un arrêt à long terme, ou un arrêt et une libération transitoires pour synchroniser une population de cellules (Figure 1). Par exemple, le point de contrôle de l’engagement du cycle cellulaire (point de restriction ou Start chez la levure) garantit que la cellule dispose de suffisamment de nutriments pour s’engager dans la division avant de commencer la réplication de l’ADN10. Ce point de contrôle peut être manipulé chez la levure haploïde pour obtenir un arrêt G1, en tirant parti du programme d’accouplement de la levure qui interagit avec le cycle cellulaire. Dans la levure de boulanger (Saccharomyces cerevisiae), les cellules haploïdes ont l’un des deux types d’accouplement, MATa ou MATα, qui est génétiquement déterminé par un locus de type d’accouplement. Les levures d’un type d’accouplement sont sensibles à la phéromone d’accouplement de l’autre type d’accouplement et réagissent en activant une cascade de signalisation de la kinase MAP qui finit par phosphoryler et stabiliser l’inhibiteur de Cdk Far1, qui empêche l’entrée dans le cycle cellulaire en se liant au complexe Cln1/2-Cdk et en bloquant son activité 11,12,13. Les cellules qui réagissent aux phéromones d’accouplement peuvent être déterminées visuellement par la présence d’une projection d’accouplement ou shmoo (Figure 1). Ainsi, des α-facteurs synthétisés chimiquement peuvent être ajoutés à des cultures de cellules MATa pour obtenir un arrêt G1. Une autre transition du cycle cellulaire que les chercheurs peuvent cibler pour synchroniser les cellules de levure est la transition de la métaphase à l’anaphase. Au cours de la mitose, le point de contrôle de l’assemblage du fuseau (SAC) surveille la fixation des kinétochores aux microtubules et inhibe le complexe/cyclosome favorisant l’anaphase (APC/C) en séquestrant son activateur, Cdc20, lorsque des kinétochores non attachés sont détectés. L’APC/C est un complexe de ligase E3 qui est essentiel pour l’entrée en phase analogique. Lorsque le SAC est satisfait, Cdc20 se lie alors à l’APC/C, et l’APC/C ubiquitine plusieurs protéines, principalement la securine et la cycline B, qui les cible pour la dégradation, et favorise la ségrégation chromosomique et la sortie mitotique14,15. Bien que Cdc20 lui-même ne soit pas un composant du SAC, son inhibition est la cible de l’activation du SAC ; par conséquent, l’appauvrissement inductible en Cdc20 peut être exploité pour arrêter une culture de levure en métaphase (Figure 1)16.

Ce protocole comprend deux méthodes de manipulation du cycle cellulaire de levure, ainsi qu’un exemple d’application de chaque méthode. Dans le premier, le facteur α est utilisé pour arrêter les cellules dans G1, suivi d’une étape de lavage pour libérer les cellules de l’arrêt, entraînant une réentrée synchrone du cycle cellulaire. Les cellules synchronisées se poursuivront tout au long du cycle cellulaire, ce qui permettra aux chercheurs de suivre et d’étudier les cellules à chaque étape du cycle cellulaire. Dans cette méthode, la localisation dynamique d’une protéine d’intérêt marquée à la GFP, Stu2, est surveillée tout au long de l’étude, et son association avec le fuseau mitotique est suivie. Cette méthode exploite également un composant de corps de pôle de fuseau (SPB) marqué, Spc110-mCherry, qui permet de mesurer la longueur du fuseau mitotique et constitue un excellent indicateur de la progression du cycle cellulaire17. Cette méthode démontre comment l’arrêt et la libération du cycle cellulaire permettent la synchronisation des populations cellulaires, facilitant ainsi l’étude d’une protéine ou d’un autre composant d’intérêt tout au long du cycle cellulaire.

Dans la deuxième méthode, un arrêt mitotique est réalisé par appauvrissement en Cdc20 à l’aide d’un système de degron inductible à l’auxine (AID)18. Dans les cellules exprimant TIR1 (une protéine F-box d’origine végétale), toute protéine avec un marqueur AID sera ubiquitinée et dégradée lors de l’ajout d’auxine. Ici, nous utilisons un Cdc20 marqué AID-AID pour permettre la dégradation inductible de Cdc20, provoquant ainsi un arrêt en métaphase. Cette population cellulaire est ensuite surveillée pour le recrutement du composant SAC marqué Bub1-GFP dans les kinétochors, en utilisant la protéine kinétochore marquée Mtw1-mCherry comme marqueur repère. Bien que Bub1 joue des rôles indépendants de la SAC au niveau des kinétochores et se localise aux kinétochores au début de la mitose, sa localisation persistante du kinétochore dans les cellules arrêtées signale des attaches kinétochores-microtubules incorrectes19. Nous l’avons montré en traitant les cellules avec le poison des microtubules, le nocodazole, qui perturbe les attaches kinétochores-microtubules. Cette expérience met en évidence comment les processus spécifiques à une phase distincte du cycle cellulaire peuvent être étudiés à l’aide de méthodes d’arrêt hautement accordables. Nous démontrons en outre que l’auxine peut être éliminée des cultures cdc20-AID, ce qui permet la libération en anaphase et l’entrée dans un nouveau cycle cellulaire, bien que d’après notre expérience, ces cultures ne se libèrent pas de manière aussi synchrone qu’un arrêt-libération à α facteurs. Ces deux méthodes d’arrêt-libération sont à la fois efficaces et faciles à mettre en œuvre, mais de nombreuses autres méthodes sont à la disposition des chercheurs sur la levure pour arrêter les cellules à différents stades du cycle cellulaire 20,21,22,23. De plus amples détails sur ces méthodes sont disponibles dans la discussion.

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Protocol

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1. Construction de souches pour l’analyse du cycle cellulaire et l’imagerie

  1. Concevez des amorces pour marquer C-terminal le gène d’intérêt à l’aide de plasmides de marquage Pringle (plasmides pFA6a)24. En bref, concevez des amorces F2 et R1 qui, lorsqu’elles sont utilisées avec un plasmide de la série pFA6a, produisent un produit PCR qui peut être directement transformé en levure pour générer une version « marquée » du gène d’intérêt. Utilisez les paires d’amorces et les plasmides contenus dans le tableau 1 pour marquer les gènes d’intérêt dans ce protocole. Les stratégies de conception de plasmides et d’amorces pour le marquage C-terminal des gènes de levure sont décrites en détail par Longtine et al.24.
    REMARQUE : Cette méthode peut être utilisée pour produire des protéines marquées par fluorescence pour l’imagerie, ou des protéines marquées au Degron inductible à l’auxine (AID) pour faciliter l’arrêt du cycle cellulaire et d’autres expériences rendues possibles par la dégradation d’une protéine cible18. Par exemple, pour marquer CDC20 avec l’étiquette AID (IAA7), l’amorce de marquage direct se compose de 25 à 40 bases du gène CDC20 immédiatement avant le codon stop, à l’exclusion du codon STOP (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG 3'), ainsi que la séquence de l’adaptateur F2 du plasmide Pringle (5' cggatccccgggttaattaa 3') ajoutée à l’extrémité 3' pour produire la séquence d’amorce finale (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATGATCAGG cggatccccgggttaattaa 3'). L’amorce de marquage CDC20 inverse contient le complément inverse des paires de 25 à 40 bases immédiatement après le codon STOP (5' ATTATATGCCTTGACATGAA
    CTTTTATTTTTTTTTTTTTTA 3') et la séquence adaptatrice R1 du plasmide Pringle (5' gaattcgagctcgtttaaac 3') pour produire la séquence d’amorce finale (5' ATTATATGCCTTGACATGAACTTTTATT
    TTTTTTATTTTA gaattcgagctcgtttaaac 3'). Il est également important de noter que l’utilisation d’amorces PCR inférieures à 40 paires de bases réduira l’efficacité de l’intégration dans le génome de la levure.
  2. Diluer les amorces dans de l’eau de qualité biologie moléculaire à 10 μM.
  3. Effectuer la PCR avec la paire de plasmides F2 et R1 et le plasmide de marquage approprié à l’aide de méthodes standard, en suivant le programme de thermocycleur contenu dans le tableau 2, puis confirmer la taille du produit de PCR par électrophorèse sur gel d’agarose.
  4. Inoculer la souche de levure pour la transformer en 25 mL d’extrait de levure culture de peptone adénine dextrose (YPAD) et cultiver pendant la nuit à 23 °C. Pour la construction de la levure cdc20-AID (qui dégradera Cdc20 lors du traitement à l’auxine), la souche transformée peut soit déjà contenir OsTIR1 exprimé à partir d’un locus ectopique, soit OsTIR1 peut être croisé plus tard18.
  5. Le lendemain matin, vérifiez l’OD600 de la culture de nuit. Si la culture est DO <2.0, passez à l’étape 1.6. Si la DO > 2,0, diluer à ~0,2-0,4 et permettre 2-3 cycles de croissance.
  6. Récoltez les cellules à OD600 = ~0,4-2,0 pour s’assurer qu’elles sont en phase de croissance logarithmique. Récoltez 5 DO de cellules par transformation (par exemple, 5 mL de DO 600 = 1,0). Si vous effectuez plus d’une transformation de la même souche, les cellules peuvent être combinées à ce stade. Récoltez les cellules par centrifugation à 3 000 x g pendant 5 min à 23 °C.
  7. Jeter le surnageant et laver la pastille cellulaire avec 25 mL d’eau, puis la centrifuger à 3 000 x g pendant 5 min à 23 °C.
  8. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL d’acétate de lithium 0,1 M (LiAc) et transférer dans un ou plusieurs tubes de 1,6 mL. Si vous effectuez plus d’une transformation, divisez la remise en suspension de 1 mL en plusieurs tubes (p. ex., pour 2 transformations, divisez 2 x 500 μL ; pour 3 transformations, divisez 3 x 333 μL, etc.).
  9. Centrifugez les cellules à 1 000 x g pendant 2 min à 23 °C et jetez le surnageant.
  10. Ajouter les éléments suivants à la pastille cellulaire (dans cet ordre) : i) 240 μL de PEG (50 %), ii) 36 μL de 1,0 M de LiAc, iii) 20 μL = 50 μg d’ADN de spermatozoïde de saumon pré-bouilli pendant 5 min, iv) 54 μL d’eau.
  11. Ajoutez 10 μL de produit PCR (obtenu à l’étape 1.3) dans les cellules et agitez le vortex pendant 1 min, en vous assurant que tout est bien mélangé.
  12. Incuber des cellules à 30 °C pendant 30 min dans un tambour roulant dans une pièce chaude ou un thermo-agitateur à 1000 tr/min.
  13. Cellules de choc thermique à 42 °C pendant 15 min dans un bain-marie.
    REMARQUE : Le temps optimal de choc thermique peut différer en fonction du fond de la souche de levure. Ce protocole est optimisé pour le fond de souche W303.
  14. Cellules de centrifugation à 1 000 x g pendant 2 min à 23 °C. Retirer le surnageant et remettre doucement en suspension dans 100 μL d’eau.
  15. Pour les transformations à l’aide de KanMX ou d’une autre sélection de médicaments, placez les cellules sur YPAD et incubez les plaques à 23 °C, puis répliquez la plaque sur la plaque de médicament le lendemain.
    REMARQUE : Il est essentiel de permettre une journée de croissance sur YPAD pour permettre l’expression des gènes de résistance aux médicaments dans les cellules transformées.
  16. Pour les transformations à l’aide de marqueurs auxotrophes (URA, HIS, etc.), les cellules sur plaque directement sur milieu sélectif.
  17. Incuber les plaques à 23 °C pendant 3 jours pour permettre aux colonies de levures transformantes de se développer.
  18. Vérifiez le marquage correct du gène par PCR génomique ou par western blot. Ces méthodes sont décrites en détail par Burnette25 et Chu et al26.
    REMARQUE : Pour produire des souches avec plusieurs allèles marqués, la transformation répétée n’est pas recommandée sans rétrocroisement, car la transformation peut être un processus mutagène. Pour produire la souche contenant Stu2-GFP et Spc110-mCherry, par exemple, nous recommandons de transformer les souches séparément pour produire Stu2-GFP et Spc110-mCherry, puis de combiner ces allèles en une seule souche haploïde par croisement de levure, sporulation, dissection tétrade et analyse génotypique. De plus amples renseignements sur les croisements de levures sont disponibles dans Stansfield et Stark27 et Morin et al.28. Pour effectuer un arrêt-libération à α facteurs, la souche haploïde utilisée doit être MATa.

2. Culture de levure et synchronisation du cycle cellulaire : arrêt-libération à α facteur

  1. Inocuculer la levure dans 25 mL de culture YPAD pendant la nuit à 23 °C, pour être à OD600 = 0,5-2,0 le lendemain matin.
    1. Si les cellules sont supérieures à OD600 = 2,0 le matin, diluez-les à OD600 = 0,2-0,4 et laissez-les croître pendant au moins 1 cycle cellulaire (2-3 h à 23 °C).
  2. Diluer les cellules à une DO 600 = 0,5 et ajouter α-facteur à une concentration finale de 1 μg/mL (stock 10 mg/mL dans le DMSO). Idéalement, les cellules auraient une mutation bar1 (par exemple bar1-1), ce qui les rend plus sensibles au facteur α. Les cellules de type sauvage BAR1 sont moins sensibles au facteur α et nécessitent une concentration de α-facteur supérieure d’au moins un ordre de grandeur supérieur pour être arrêtée correctement, ce qui est moins économique.
  3. 2,5 à 3,5 h après l’arrestation, vérifiez le degré d’arrestation en comptant le pourcentage de cellules non bourgeonnées. Lorsque 90 à 95 % des cellules sont mises à l’écart (arrêtées en G1), procéder à la mise en liberté. Le moment variera en fonction de la souche de levure, du milieu de croissance et de la température.
  4. Libérez les cellules de l’arrêt à α facteur en les faisant tourner dans la centrifugeuse à 3 000 x g pendant 3 à 5 minutes à 23 °C, puis en versant le surnageant.
  5. Laver les cellules en remettant la pastille en suspension dans 25 mL de YPAD + 1 % de DMSO.
  6. Répétez les étapes 2.4-2.5 deux fois pour un total de trois lavages, en changeant le tube usagé une fois après le premier lavage.
  7. Ajouter YPAD dans les cellules pour porter le volume final à 25 mL et transférer les cellules dans une nouvelle fiole.
    REMARQUE : L’utilisation d’un nouveau flacon est essentielle pour éliminer les traces de facteur de α qui pourraient empêcher la libération.
  8. Prélevez un échantillon ponctuel (0 min) et fixez-le (voir les instructions de fixation aux étapes 4.1 à 4.4).
  9. Continuer à prélever des échantillons ponctuels toutes les 15 minutes si la croissance a lieu à 23 °C. Ce moment changera à d’autres températures en fonction de la vitesse de croissance des cellules.
  10. Au point temporel 60 min, jugez de la synchronie de la libération en vérifiant l’uniformité des petits bourgeons (taille des bourgeons < 25 % de la taille de la cellule mère) au microscope optique.
  11. Facultatif) À 60 minutes après la libération du médicament, ajouter de nouveau le facteur α à une concentration finale de 1 μg/mL pour prévenir la progression vers le cycle cellulaire suivant. Confirmer la libération cellulaire synchrone en vérifiant la morphologie uniforme des petits bourgeons avant l’ajout.
  12. Continuez à prélever des échantillons ponctuels jusqu’à 180 min, ou aussi longtemps que vous le souhaitez. À 23 °C, la métaphase se produit ~45-60 min après la libération, l’anaphase se produit ~60-90 min après la libération, et la plupart des cellules seront dans le nouveau G1 120 minutes après la libération.

3. Culture de levure et synchronisation du cycle cellulaire : arrêt-libération de la déplétion Cdc20

  1. Inoculer une culture de levure pendant la nuit à 23 °C pour être à une DO 600 = 0,5-2,0 le lendemain matin.
    1. Si les cellules sont supérieures à OD600 = 2,0 le lendemain matin, diluez-les à OD600 = 0,2-0,4 et laissez-les croître pendant au moins 1 cycle cellulaire (2-3 h à 23 °C).
  2. Diluer à nouveau à OD600 = 0,5 et ajouter de l’auxine à une concentration finale de 500 μM à partir d’un stock de 1 M (500x) pour toutes les cultures. Pour les cultures recevant d’autres médicaments (nocodazole), les ajouter en même temps que l’auxine à la concentration appropriée (par exemple, ~10 μg/mL de nocodazole).
  3. 2 h après l’arrêt, vérifiez le degré d’arrêt en comptant le pourcentage de cellules à gros bourgeons (les cellules à gros bourgeons sont déterminées comme la présence de bourgeons > 25 % de la taille des cellules mères). Lorsque 90 à 95 % des cellules sont arrêtées en mitose, procéder soit à la collecte d’échantillons, soit à la libération des cellules d’arrêt, selon l’application expérimentale. Si 90 % des cellules ne sont pas arrêtées, laissez la culture continuer à croître et vérifiez-la toutes les 15 à 30 minutes. Le moment variera en fonction de la souche de levure, du milieu de croissance et de la température.
    REMARQUE : Il n’est pas conseillé de laisser les arrestations se dérouler trop longtemps (plus de 4 h) si vous les libérez, car les arrestations prolongées peuvent réduire la viabilité de la cellule.
  4. Pour libérer de l’arrêt de l’épuisement en Cdc20, récolter la culture par centrifugation à 3000 x g pendant 3 à 5 min à 23 °C.
  5. Laver les cellules en remettant en suspension la pastille dans 25 mL de YPAD + 1 % de DMSO, puis en récoltant par centrifugation à 3 000 x g pendant 3 à 5 min à 23 °C.
  6. Répétez les étapes 3.4-3.5 pour un total de 2 lavages.
  7. Ajouter YPAD dans les cellules pour porter le volume final à 25 mL et transférer les cellules dans une nouvelle fiole.
    REMARQUE : L’utilisation d’un nouveau flacon est essentielle pour éliminer les traces d’auxine qui pourraient empêcher une libération.
  8. Prenez le point temporel 0 et fixez-le (voir les instructions de fixation aux étapes 4.1 à 4.4).
  9. Continuez à prendre des points de temps toutes les 10-15 minutes pour la durée souhaitée du parcours temporel. À 23 °C, la plupart des cellules se seraient libérées de l’arrestation après 50 à 70 minutes.
    REMARQUE : Les cellules ne se libèrent pas de manière aussi synchrone lors de cet arrêt de déplétion Cdc20 qu’elles le font lors de l’arrêt à α facteur. Cependant, il peut être utile d’étudier les événements d’anaphase ou de sortie mitotique. De plus, une limitation technique de cet arrêt-libération est qu’à des moments ultérieurs après la libération, il est plus difficile de différencier les cellules métaphasiques qui ne se sont pas encore libérées et les cellules qui se sont libérées plus tôt et ont atteint la métaphase de leur prochain cycle cellulaire. Si nécessaire, cela peut être surmonté soit en faisant de l’imagerie de cellules vivantes pour suivre les cellules individuelles lorsqu’elles se libèrent de l’arrêt, soit en ajoutant un facteur α à la culture (en supposant que les cellules sont MATa) pour arrêter les cellules dans G1 après la sortie mitotique.

4. Fixation de la levure

  1. Centrifuger 1 mL (ou 0,5-1,5 ODs) de culture pendant 1 min à vitesse maximale (~20 000 x g) à 23 °C.
  2. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 500 μL de solution fixatrice (formaldéhyde à 3,7 % dans 0,1 M de phosphate de potassium (KPi), pH 6,4).
  3. Incuber les cellules dans la solution fixatrice pendant 2 à 15 minutes à
    23 °C. Pour les expériences dans le temps, il est généralement conseillé de fixer les cellules pendant 15 minutes pour aligner le moment de la centrifugation des cellules lors du prélèvement d’échantillons.
    REMARQUE : Le moment de la fixation doit être optimisé pour des fluorophores et des protéines d’intérêt spécifiques.
  4. Centrifuger les cellules pendant 1 min à vitesse maximale à 23 °C, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 500 μL de 0,1 M KPi (pH 6,4). Les cellules de KPi peuvent être stockées à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être photographiées.
    REMARQUE : Le signal de fluorescence à cellule fixe peut durer jusqu’à 2 semaines, selon le fluorophore, cependant, pour la quantification des signaux fluorescents, collectez des images dans les 7 jours.

5. Préparation des lames pour l’imagerie

  1. Lorsqu’elles sont prêtes à imager, centrifuger les cellules pendant 1 min à vitesse maximale à 23 °C et jeter le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 10 à 100 μL de solution de Triton/DAPI/sorbitol (1,2 M de sorbitol, 1 % de triton, 0,1 M KPi, pH de 7,5, 2 μg/mL de DAPI).
  2. Pipeter ~0,8 μL de cellules directement sur une lamelle propre. À l’aide d’une pointe de pipette, répartissez doucement la gouttelette de cellule en un cercle d’environ 1 cm2 au centre de la lamelle.
  3. Placez la lamelle sur une lame de microscopie. À l’aide d’un Kimwipe, appuyez doucement autour de la lame pour répartir l’échantillon.
  4. Scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles.
  5. En option, stockez-le dans un endroit sombre et frais jusqu’à 4 à 6 h avant l’imagerie pour aider les cellules à se stabiliser et prévenir les mouvements excessifs.

6. Imagerie

  1. Apportez la lame à un microscope équipé d’un objectif à huile 60x/1,42 et d’un ensemble de lasers et de filtres rouge, vert, bleu et rouge lointain. Des objectifs à grossissement plus élevé (jusqu’à 100x) peuvent également être utilisés.
  2. Focalisez le microscope sur les cellules de levure adhérant à la lamelle.
    REMARQUE : Si les cellules de levure bougent trop, les lames peuvent être laissées dans un endroit sombre et frais pendant 20 à 60 minutes pour se déposer.
  3. Une fois que les levures sont nettes, réglez les paramètres d’exposition de chaque canal pour produire un rapport signal/bruit d’au moins 3:1, en veillant à ce qu’aucun point fluorescent ne soit surexposé.
    REMARQUE : Par exemple, sur un système d’imagerie que nous utilisons avec une caméra CMOS scientifique, l’utilisation d’un objectif 60x 550 et d’une huile d’immersion avec un indice de réfraction de n = 1,516, le réglage du signal maximum du canal rouge à 1000-2000 ua, du canal vert à 3000 au, du canal bleu à 3000 au et du canal DIC à 4000-5000 au produit des images de haute qualité.
  4. Ajustez les paramètres d’acquisition pour prendre 14 à 20 piles Z de 0,2 μm pour couvrir un total de 2 à 4 μm.
  5. Pour les microscopes équipés de modules de post-traitement, sélectionnez Déconvolution et Projection rapide pour chaque pile.
  6. Collectez des piles Z de cellules, en prenant suffisamment d’images pour capturer ~100-200 cellules pour chaque condition ou point temporel.
  7. Reportez-vous au fichier supplémentaire 1 pour obtenir des instructions sur le logiciel avec des captures d’écran du logiciel de création d’images.

7. Analyse d’images

  1. Ouvrez les images projetées dans ImageJ et ajustez la luminosité et le contraste pour afficher différents canaux. Si le microscope utilisé pour l’imagerie ne dispose pas de modules de post-traitement, effectuez une projection maximale des piles Z à ce stade.
  2. Pour déterminer la progression du cycle cellulaire, comptez 100 cellules par point temporel et classez-les comme contenant un ou deux noyaux. Vous pouvez également calculer la longueur du fuseau ou la distance entre les corps des pôles du fuseau pour définir l’état du cycle cellulaire. La distance entre les foyers de Spc110 < 1,5 μm correspond aux cellules de métaphase, et la distance > 1,5 μm correspond aux cellules d’anaphase.
  3. Pour calculer l’intensité des points protéiques (p. ex., Stu2-GFP), utilisez l’outil de sélection à main levée pour dessiner autour de la limite du signal d’intérêt. Ajoutez ce signal au gestionnaire de ROI (Région d’Intérêt) en appuyant sur T ou en utilisant le Menu. Dans le gestionnaire de retour sur investissement , sélectionnez Mesurer pour calculer l’intensité de chaque point sélectionné. Pour afficher les changements du signal ponctuel au fil du temps, tracez l’intensité moyenne avec un intervalle de confiance à 95 % sur un graphique linéaire pour chaque point temporel.
  4. Pour calculer le pourcentage de cellules avec Bub1-GFP puncta, assurez-vous que les paramètres de luminosité minimale et maximale du canal vert sont les mêmes sur différentes images. Les cellules avec un puncta Bub1-GFP montrant un chevauchement avec un puncta Mtw1-mCherry sont comptées comme Bub1 localisé au kinétochore ; Sinon, la cellule est considérée comme négative. Comptez ~100 cellules par condition. Aravamudhan et al.29 contiennent plus d’informations sur la localisation de Bub1 chez les kinétochores.
  5. Pour calculer le pourcentage de cellules mononucléées à gros bourgeons, comptez le nombre de cellules avec un gros bourgeon et un noyau (un signal DAPI) dans la population et divisez par le nombre total de cellules.
  6. Reportez-vous au fichier supplémentaire 1 pour les instructions du logiciel avec les captures d’écran du logiciel de création d’images.

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Results

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L’analyse des changements dans la localisation des protéines dépendante du cycle cellulaire par microscopie à fluorescence peut être facilement réalisée en utilisant les méthodes que nous décrivons ici. Notre groupe s’intéresse depuis longtemps à la régulation dynamique et à la fonction du fuseau mitotique. Chez la levure, les corps polaires du fuseau (marqués par le composant Spc110) fonctionnent comme des centres d’organisation des microtubules à partir...

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Discussion

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L’utilisation de la synchronisation du cycle cellulaire chez la levure bourgeonnante permet d’étudier des mécanismes importants pour une variété de processus cellulaires. L’utilisation d’arrêts-libérations G1 avec un traitement à α-facteurs permet la progression synchrone d’une population de cellules à travers les étapes du cycle cellulaire et, comme nous l’avons montré, peut révéler des modèles de localisation dynamique de régulateurs cellulaires comme Stu236. Le...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Cell Imaging Core de l’Université de l’Utah pour l’entretien de l’installation de microscope Delta Vision. Ce travail a été soutenu en partie par les subventions des NIH F31CA2717405 (à M.G.S) et T32GM141848 (à M.G.S. et T.C.S.), 5 For the Fight (à M.P.M.), Pew Biomedical Scholars (à M.P.M.) et NIH grant R35GM142749 (à M.P.M.).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
?-facteurInstallation de synthèse centrale de l’Université de l’UtahSéquence : WHWLQLKPGQPMY
Tubes Eppendorf de 1,5 mLAxygèneMCT-175-C
Mélange dNTP 10mMThermo ScientificR0193
Tubes coniques de 50 mLGreiner Bio-One227 261
5x tampon de réaction Phusion HFNew England BioLabsB0518S
Acide acétique, glaciaireFisher ChemicalBP2401C-212
sel d’hémisulfate d’adénineSigma-AldrichA9126-100G
Agar, granuléApex Chemicals et Réactifs20-275
AgaroseProduits de recherche d’Apex Bioresearch20-102GP
Stérilisateur à vapeur Autoclave Amsco CenturySterisSV-1262
Eau DI autoclavée
AuxineSigma-AldrichCat#I3750-5G-A ; CAS : 87-51-4
Cargille Laser LiquidLaboratoires Cargille20130
D-SorbitolSigma-AldrichS1876-500G
DAPI (40,6-Diamidino-2-Phénylindole, Dihydrochlorure)Sondes moléculairesCat#D1306
Sel de sodium à l’acide désoxyribonucléique provenant des testicules du saumonSigma-AldrichD1626
DextroseFisher ChemicalD16-10
Tétraacétate d’éthylènediamine disodiqueFisher ChemicalS811-10
DMSOThermo Scientific20688
FIJI/ImageJ2 vs 2.14.0/1.54fImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Mélangeur à vortex à vitesse fixeVWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
Fluorescent microscope DV UltraLeicahttps://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwEFeuilleton # : NV01063. Non plus pris en charge
FormaldéhydeFisher ChemicalCat#F79-500
Appareil en gelThermo ScientificOwl EasyCast B1
Mélange d’échelle d’ADN GeneRulerFermentasSM0333
Perles de verreFisher Scientific11312A
Lames en verreVWR48300-026
Vibrateur de plateforme Innova 2300Nouveau-BrunswickNB-2300
KimwipesKimtech06-666
Centrifugeuse de laboratoire pour tubes de 1,5 mLEppendorf2525
Centrifugeuse de laboratoire pour tubes de 50 mLEppendorf5804
Dihydrate d’acétate de lithiumSigma-AldrichL4158-250G
Maître cycleur Nexus X2eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
Micro-pipettes p2, p20, p200 et p1000 et embouts correspondantsRaininL-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
Verre de revêtement de microscopeFisher Scientific12541014
NocodazoleCalbiochemCat#487928 ; CAS : 31430-18-9 ; Lot#B35705
Orange GSigma-AldrichO7252
CHEVILLERecherche à HamptonHR2-591
Peptone granulé   ;Bioréactifs de FisherBP9725-5
Phusion HF ADN polyméraseNew England BioLabsM0530L
Pipet-XRaininPX-100R
Phosphate de potassium, dibaseThermo Scientific424195000
Phosphate de potassium, monobaseThermo Scientific424200025
Source d’alimentationBio-Rad23786
Commence à acquérir Ultra 1.2.2softWoRx CytivaObtenir avec DV Ultra
Tris BaseBioréactifs de FisherBP152-10
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
Rotateur tubulaireVWR10136-084
Bain d’eauVWRWBE10A11B
Eau, ultra pureProduits de recherche d’Apex Bioresearch18-194
Extrait de levure granuléBioréactifs de FisherBP9727-5

References

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