Manipulation et analyse des processus dépendants du cycle cellulaire chez les levures bourgeonnantes

Summary

Ce protocole détaille deux méthodes d’arrêt du cycle cellulaire de levure et de libération facultative, et développe l’utilisation de la microscopie à fluorescence pour étudier les processus dépendants du cycle cellulaire chez S. cerevisiae.

Abstract

Les cellules eucaryotes suivent un cycle cellulaire conservé qui régule divers processus, notamment le maintien de l’ADN et l’homéostasie des organites. L’étude des processus cellulaires d’une manière dépendante du cycle cellulaire est souvent nécessaire pour interpréter correctement les résultats expérimentaux. Il existe des méthodes chimiques et génétiques disponibles pour produire la synchronisation du cycle cellulaire dans des cellules cultivées à travers un large éventail d’organismes, y compris des modèles de vertébrés, permettant l’étude des processus dépendants du cycle cellulaire. Cependant, parmi les organismes modèles, la levure bourgeonnante reste une centrale électrique pour l’analyse du cycle cellulaire en raison de ses méthodes de synchronisation particulièrement robustes, de son temps de génération court et de sa traçabilité génétique. La levure partage la machinerie centrale du cycle cellulaire avec d’autres eucaryotes, ce qui a permis des découvertes historiques dans la régulation du cycle cellulaire. Ce protocole détaille les méthodes d’analyse du cycle cellulaire chez la levure, en se concentrant sur les expériences d’arrêt-libération G1 et d’arrêt-libération mitotique, y compris la construction de souches, la préparation de cultures et la microscopie. Des méthodes de marquage par PCR pour produire des souches appropriées pour l’arrêt du cycle cellulaire et la microscopie à fluorescence sont présentées. Un arrêt G1 est réalisé à l’aide de la phéromone peptidique α-facteur, et de brefs lavages entraînent une libération synchrone et une progression du cycle cellulaire. Les échantillons sont prélevés à différents moments après leur libération dans le cycle cellulaire et fixés pour la microscopie. Une deuxième méthode arrête les cellules de levure en mitose en épuisant le régulateur du cycle cellulaire Cdc20 pour obtenir une population arrêtée en métaphase, ainsi qu’une libération facultative en anaphase. Les échantillons sont fixés et préparés pour l’imagerie avant et après la libération, puis sont imagés et analysés. L’analyse d’images se concentre sur le catalogage, la localisation dynamique et les changements d’abondance de la population des protéines dans le cycle cellulaire. Ces méthodes de synchronisation conviennent à diverses manipulations du cycle cellulaire, et bien que leur utilisation dans l’imagerie des cellules fixes soit mise en évidence ici, elles peuvent être adaptées à de nombreuses autres analyses, y compris l’imagerie de cellules vivantes ainsi que les tests biochimiques et moléculaires.

Introduction

La division cellulaire eucaryote est fortement régulée par un programme appelé cycle cellulaire. Les processus dynamiques hautement conservés qui se produisent dans le cycle cellulaire le rendent intéressant à étudier en lui-même, mais ont également des implications étendues qui informent les investigations d’autres processus biologiques cellulaires - par exemple, de nombreux organites subissent un remodelage spectaculaire au cours de la division cellulaire, et l’abondance et la localisation de nombreuses protéines sont fortement régulées^{tout au} long de ^1,2,3

Protocol

1. Construction de souches pour l’analyse du cycle cellulaire et l’imagerie

1. Concevez des amorces pour marquer C-terminal le gène d’intérêt à l’aide de plasmides de marquage Pringle (plasmides pFA6a)²⁴. En bref, concevez des amorces F2 et R1 qui, lorsqu’elles sont utilisées avec un plasmide de la série pFA6a, produisent un produit PCR qui peut être directement transformé en levure pour générer une version « marquée » du gène d’intérêt. Utilisez les paires d’amorces et les plasmides contenus dans le tableau 1 pour marquer les gènes d’intérêt dans ce protocole. Les stratégies de concep....

Results

L’analyse des changements dans la localisation des protéines dépendante du cycle cellulaire par microscopie à fluorescence peut être facilement réalisée en utilisant les méthodes que nous décrivons ici. Notre groupe s’intéresse depuis longtemps à la régulation dynamique et à la fonction du fuseau mitotique. Chez la levure, les corps polaires du fuseau (marqués par le composant Spc110) fonctionnent comme des centres d’organisation des microtubules à partir.......

Discussion

L’utilisation de la synchronisation du cycle cellulaire chez la levure bourgeonnante permet d’étudier des mécanismes importants pour une variété de processus cellulaires. L’utilisation d’arrêts-libérations G1 avec un traitement à α-facteurs permet la progression synchrone d’une population de cellules à travers les étapes du cycle cellulaire et, comme nous l’avons montré, peut révéler des modèles de localisation dynamique de régulateurs cellulaires comme Stu2³⁶. Le.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
?-facteur	Installation de synthèse centrale de l’Université de l’Utah		Séquence : WHWLQLKPGQPMY
Tubes Eppendorf de 1,5 mL	Axygène	MCT-175-C
Mélange dNTP 10mM	Thermo Scientific	R0193
Tubes coniques de 50 mL	Greiner Bio-One	227 261
5x tampon de réaction Phusion HF	New England BioLabs	B0518S
Acide acétique, glaciaire	Fisher Chemical	BP2401C-212
sel d’hémisulfate d’adénine	Sigma-Aldrich	A9126-100G
Agar, granulé	Apex Chemicals et Réactifs	20-275
Agarose	Produits de recherche d’Apex Bioresearch	20-102GP
Stérilisateur à vapeur Autoclave Amsco Century	Steris	SV-1262
Eau DI autoclavée
Auxine	Sigma-Aldrich	Cat#I3750-5G-A ; CAS : 87-51-4
Cargille Laser Liquid	Laboratoires Cargille	20130
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G
DAPI (40,6-Diamidino-2-Phénylindole, Dihydrochlorure)	Sondes moléculaires	Cat#D1306
Sel de sodium à l’acide désoxyribonucléique provenant des testicules du saumon	Sigma-Aldrich	D1626
Dextrose	Fisher Chemical	D16-10
Tétraacétate d’éthylènediamine disodique	Fisher Chemical	S811-10
DMSO	Thermo Scientific	20688
FIJI/ImageJ2 vs 2.14.0/1.54f	ImageJ2	https://imagej.net/software/fiji/
Mélangeur à vortex à vitesse fixe	VWR	https://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
Fluorescent microscope DV Ultra	Leica	https://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwE	Feuilleton # : NV01063. Non plus pris en charge
Formaldéhyde	Fisher Chemical	Cat#F79-500
Appareil en gel	Thermo Scientific	Owl EasyCast B1
Mélange d’échelle d’ADN GeneRuler	Fermentas	SM0333
Perles de verre	Fisher Scientific	11312A
Lames en verre	VWR	48300-026
Vibrateur de plateforme Innova 2300	Nouveau-Brunswick	NB-2300
Kimwipes	Kimtech	06-666
Centrifugeuse de laboratoire pour tubes de 1,5 mL	Eppendorf	2525
Centrifugeuse de laboratoire pour tubes de 50 mL	Eppendorf	5804
Dihydrate d’acétate de lithium	Sigma-Aldrich	L4158-250G
Maître cycleur Nexus X2	eppendorf	https://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
Micro-pipettes p2, p20, p200 et p1000 et embouts correspondants	Rainin	L-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
Verre de revêtement de microscope	Fisher Scientific	12541014
Nocodazole	Calbiochem	Cat#487928 ; CAS : 31430-18-9 ; Lot#B35705
Orange G	Sigma-Aldrich	O7252
CHEVILLE	Recherche à Hampton	HR2-591
Peptone granulé   ;	Bioréactifs de Fisher	BP9725-5
Phusion HF ADN polymérase	New England BioLabs	M0530L
Pipet-X	Rainin	PX-100R
Phosphate de potassium, dibase	Thermo Scientific	424195000
Phosphate de potassium, monobase	Thermo Scientific	424200025
Source d’alimentation	Bio-Rad	23786
Commence à acquérir Ultra 1.2.2	softWoRx Cytiva	Obtenir avec DV Ultra
Tris Base	Bioréactifs de Fisher	BP152-10
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Rotateur tubulaire	VWR	10136-084
Bain d’eau	VWR	WBE10A11B
Eau, ultra pure	Produits de recherche d’Apex Bioresearch	18-194
Extrait de levure granulé	Bioréactifs de Fisher	BP9727-5